差速消化法：脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)與特性解析一、引言1.1研究背景內(nèi)皮祖細(xì)胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，于1997年由Asahara等首次從人外周血中成功分離并鑒定，這一發(fā)現(xiàn)為血管新生和組織修復(fù)機(jī)制帶來了全新認(rèn)識，也為相關(guān)疾病的治療開辟了新思路。在生理或病理狀態(tài)下，EPCs可從骨髓動員至外周血，歸巢到缺血或損傷部位，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管的形成，在血管修復(fù)、組織再生等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為心血管疾病、缺血性疾病及組織工程等領(lǐng)域的治療帶來了新希望。目前，EPCs的來源主要包括骨髓、外周血和臍血等。然而，這些傳統(tǒng)來源存在一定的局限性。骨髓穿刺獲取EPCs過程痛苦，對供體損傷較大，且細(xì)胞產(chǎn)量有限；外周血中EPCs含量極低，分離難度大，成本高；臍血來源雖相對豐富，但受倫理限制和樣本采集條件制約，應(yīng)用范圍受限。因此，尋找一種來源廣泛、獲取簡便、對機(jī)體損傷小且細(xì)胞產(chǎn)量和活性良好的EPCs來源，成為該領(lǐng)域的研究熱點。近年來，脂肪組織作為EPCs的潛在來源受到廣泛關(guān)注。脂肪組織在人體中儲量豐富，獲取相對容易，通?？赏ㄟ^抽脂術(shù)等微創(chuàng)方式獲得，對人體創(chuàng)傷較小。此外，脂肪組織中細(xì)胞成分多樣，除脂肪細(xì)胞外，還包含多種干細(xì)胞和祖細(xì)胞，其中就有內(nèi)皮祖細(xì)胞，且脂肪組織來源的EPCs具備較強(qiáng)的增殖和分化能力，在合適的培養(yǎng)條件下可大量擴(kuò)增。這些優(yōu)勢使脂肪組織成為極具潛力的EPCs種子細(xì)胞來源，為解決EPCs來源不足的問題提供了新途徑。盡管脂肪組織作為EPCs來源具有諸多優(yōu)勢，但目前國內(nèi)外在脂肪源性EPCs的分離培養(yǎng)方法上仍存在不足?，F(xiàn)有的分離培養(yǎng)方法往往操作復(fù)雜、成本高昂，需要使用昂貴的試劑和設(shè)備，且分離得到的細(xì)胞純度和活性難以保證。例如，傳統(tǒng)的磁珠分選法雖能獲得較高純度的EPCs，但磁珠價格昂貴，且難以完全去除，影響細(xì)胞的后續(xù)應(yīng)用；利用特定細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)貼壁法不僅費用高，細(xì)胞純度還受貼壁時間等因素影響，難以精確控制。此外，部分方法在細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用大量動物來源血清，存在免疫排斥和病毒污染等風(fēng)險，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種有效、經(jīng)濟(jì)、可行的從人脂肪組織中分離培養(yǎng)EPCs的方法，對于推動EPCs在基礎(chǔ)研究和臨床治療中的應(yīng)用具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在探索一種有效、經(jīng)濟(jì)且可行的利用差速消化法從人脂肪組織中分離培養(yǎng)脂肪源性EPCs的方法，并深入研究其生物學(xué)特性，為EPCs的基礎(chǔ)研究提供新的技術(shù)手段和理論依據(jù)。通過優(yōu)化差速消化分離培養(yǎng)的具體步驟和條件，如消化酶的選擇與濃度確定、消化時間的精準(zhǔn)把控、細(xì)胞接種密度的優(yōu)化等，期望獲得高純度、高活性且數(shù)量充足的脂肪源性EPCs，解決現(xiàn)有分離培養(yǎng)方法存在的操作復(fù)雜、成本高昂、細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。從臨床應(yīng)用角度來看，本研究具有重大意義。脂肪源性EPCs在治療性血管新生領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，可用于治療多種缺血性疾病，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、下肢動脈硬化閉塞癥、糖尿病足等。這些缺血性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，傳統(tǒng)治療方法存在一定局限性，而EPCs能夠分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管形成，改善缺血組織的血液供應(yīng)，為缺血性疾病的治療提供了新的策略。例如，對于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者，將脂肪源性EPCs移植到缺血心肌部位，有望促進(jìn)心肌血管新生，改善心肌供血，緩解心絞痛癥狀，提高患者生活質(zhì)量，甚至降低心肌梗死的發(fā)生風(fēng)險；對于下肢動脈硬化閉塞癥患者，通過局部注射或血液循環(huán)輸送脂肪源性EPCs，可促使下肢缺血部位形成新的血管，減輕肢體疼痛、潰瘍等癥狀，避免截肢風(fēng)險。此外，本研究成果還能為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供豐富的種子細(xì)胞來源。在組織工程中，構(gòu)建具有良好血管化的組織和器官是實現(xiàn)組織修復(fù)和再生的關(guān)鍵，脂肪源性EPCs可與生物材料結(jié)合，構(gòu)建血管化組織工程支架，用于修復(fù)骨缺損、皮膚損傷等組織缺損，促進(jìn)組織再生和功能恢復(fù)。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，脂肪源性EPCs可參與受損組織和器官的修復(fù)與再生過程，為治療多種難治性疾病提供新的途徑和方法，推動再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為患者帶來更多的治療選擇和康復(fù)希望。二、脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)方法概述2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞來源及現(xiàn)狀內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管新生和組織修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其來源廣泛，常見的有骨髓、外周血、臍血以及脂肪組織等。不同來源的EPCs在細(xì)胞特性、獲取方式及應(yīng)用前景等方面存在差異，也都面臨著各自的問題。骨髓是EPCs的重要來源之一，骨髓中EPCs含量相對較高，且具有較強(qiáng)的增殖和分化能力。然而，獲取骨髓EPCs需要進(jìn)行骨髓穿刺，這一過程對供體損傷較大，會給供體帶來痛苦，且骨髓穿刺獲取的細(xì)胞數(shù)量有限，難以滿足大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。此外，骨髓穿刺還存在感染、出血等風(fēng)險，限制了其廣泛應(yīng)用。外周血中也存在EPCs，但含量極低，每毫升外周血中EPCs的數(shù)量僅為幾個到幾十個。從外周血中分離EPCs需要大量的血液樣本，且分離過程復(fù)雜，成本高昂。同時，外周血EPCs的增殖能力相對較弱，在體外培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象，影響其治療效果。臍血作為EPCs的來源，具有獨特的優(yōu)勢。臍血中EPCs含量豐富，且免疫原性低，不易引起免疫排斥反應(yīng)。然而，臍血的采集受到時間和地點的限制，需要在新生兒出生時及時采集，且采集量有限。此外，臍血的儲存和運輸也需要特殊的條件，增加了成本和難度。同時，臍血來源還受到倫理限制，在一些地區(qū)存在爭議，這也限制了其大規(guī)模應(yīng)用。近年來，脂肪組織作為EPCs的潛在來源受到了廣泛關(guān)注。脂肪組織在人體中儲量豐富，分布廣泛，可通過抽脂術(shù)等微創(chuàng)方式輕松獲取，對人體創(chuàng)傷極小。抽脂術(shù)是一種相對成熟的醫(yī)療技術(shù)，在局部麻醉下即可進(jìn)行，手術(shù)過程中患者痛苦較小，術(shù)后恢復(fù)較快。研究表明，每克脂肪組織中可分離出數(shù)千個EPCs，細(xì)胞產(chǎn)量可觀。脂肪組織中除了EPCs，還包含多種干細(xì)胞和祖細(xì)胞，它們之間可能存在協(xié)同作用，有助于促進(jìn)EPCs的增殖和分化。國內(nèi)外學(xué)者針對脂肪源性EPCs開展了大量研究，取得了一定的成果。在分離培養(yǎng)方法上，不斷探索優(yōu)化，如采用不同的酶消化組合、改進(jìn)細(xì)胞篩選技術(shù)等。部分研究通過優(yōu)化酶消化時間和溫度，提高了EPCs的分離效率；還有研究利用新型細(xì)胞篩選技術(shù)，提高了EPCs的純度。在應(yīng)用研究方面，脂肪源性EPCs在治療缺血性疾病、促進(jìn)組織修復(fù)等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的效果。有臨床研究將脂肪源性EPCs應(yīng)用于下肢缺血患者的治療，發(fā)現(xiàn)患者下肢血液循環(huán)得到明顯改善，疼痛癥狀減輕。然而，目前脂肪源性EPCs的研究仍存在一些問題，如分離培養(yǎng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)胞的穩(wěn)定性和安全性等，需要進(jìn)一步深入研究解決。二、脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)方法概述2.2傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法剖析2.2.1磁珠分離法磁珠分離法是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場作用下，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與磁珠相連而留在溶液中，從而使細(xì)胞得以分離。在脂肪源性EPCs分離中，首先需獲取脂肪組織，通常通過抽脂術(shù)等方式收集。將脂肪組織剪碎后，使用膠原酶等消化酶進(jìn)行消化，使其成為單細(xì)胞懸液。接著，向單細(xì)胞懸液中加入與EPCs表面特異性標(biāo)志物（如CD34、CD133、VEGFR-2等）結(jié)合的磁珠。這些磁珠表面修飾有針對EPCs標(biāo)志物的抗體，能夠特異性地識別并結(jié)合EPCs。在一定的孵育條件下，磁珠與EPCs充分結(jié)合。隨后，將混合物置于磁場中，結(jié)合了磁珠的EPCs會被吸附到磁場周圍，而其他細(xì)胞則隨溶液流走。通過小心移除上清液，再對吸附有EPCs的磁珠進(jìn)行洗滌和洗脫，即可獲得相對純化的EPCs。磁珠分離法的顯著優(yōu)點是能夠獲得高純度的脂肪源性EPCs。由于磁珠與EPCs表面標(biāo)志物的特異性結(jié)合，能夠精準(zhǔn)地將EPCs從復(fù)雜的脂肪組織細(xì)胞混合物中分離出來，滿足對細(xì)胞純度要求較高的實驗和研究需求，為深入探究EPCs的生物學(xué)特性和功能機(jī)制提供了有力支持。然而，該方法也存在一些缺點。磁珠價格昂貴，這使得實驗成本大幅增加，限制了其在大規(guī)模研究和臨床應(yīng)用中的推廣。磁珠難以完全從細(xì)胞表面去除，殘留的磁珠可能會影響細(xì)胞的正常生理功能和后續(xù)實驗結(jié)果。在一些細(xì)胞功能實驗中，磁珠殘留可能干擾細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差，影響對EPCs真實特性的判斷。2.2.2間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)法間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)法的原理是基于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為脂肪源性EPCs。脂肪組織中含有豐富的MSCs，為該方法提供了充足的細(xì)胞來源。首先，從脂肪組織中獲取MSCs。通過抽脂術(shù)獲得脂肪組織后，利用酶消化法將脂肪組織消化成單細(xì)胞懸液，然后采用貼壁培養(yǎng)法，利用MSCs的貼壁特性，將其與其他細(xì)胞分離，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，獲得較為純化的MSCs。接著，將獲得的MSCs置于含有特定誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化。這些誘導(dǎo)因子通常包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）等。VEGF能夠特異性地與MSCs表面的VEGFR-2等受體結(jié)合，激活下游的PI3K-Akt、MAPK等信號通路，促進(jìn)MSCs向EPCs分化；bFGF則通過與FGFR受體結(jié)合，激活Ras-Raf-MEK-ERK等信號途徑，協(xié)同VEGF等因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，如促進(jìn)VE-cadherin、CD31等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)，抑制間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)，從而推動MSCs向EPCs的分化進(jìn)程。在誘導(dǎo)分化過程中，需要嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，包括溫度、濕度、CO?濃度等。通常在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一定時間更換培養(yǎng)基，以提供細(xì)胞生長和分化所需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時去除代謝廢物。經(jīng)過一段時間的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物（如CD34、CD133、VEGFR-2、VE-cadherin等）的表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)變化以及功能特性（如攝取乙酰化低密度脂蛋白、結(jié)合荊豆凝集素等），來鑒定是否成功誘導(dǎo)分化為EPCs。然而，這種方法存在分化程度不均的問題。由于不同的MSCs對誘導(dǎo)因子的反應(yīng)存在差異，導(dǎo)致最終分化得到的EPCs在功能和特性上存在較大的異質(zhì)性，難以保證細(xì)胞群體的一致性和穩(wěn)定性，影響實驗結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。此外，誘導(dǎo)過程中操作條件較難控制和重復(fù)，不同實驗室或同一實驗室不同批次的實驗結(jié)果可能存在差異，不利于該方法的標(biāo)準(zhǔn)化和廣泛應(yīng)用。2.2.3特定細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)貼壁法特定細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)貼壁法是利用EPCs對某些特定細(xì)胞外基質(zhì)具有較強(qiáng)的黏附特性來進(jìn)行分離培養(yǎng)。首先，準(zhǔn)備合適的細(xì)胞外基質(zhì)，如纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）等。將這些細(xì)胞外基質(zhì)均勻地包被在細(xì)胞培養(yǎng)器皿表面，形成一層具有特定生物學(xué)活性的基質(zhì)層。獲取脂肪組織并進(jìn)行處理，通過抽脂術(shù)收集脂肪組織，剪碎后使用膠原酶等消化酶進(jìn)行消化，制備成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液接種到包被有特定細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)器皿中。在適宜的培養(yǎng)條件下，EPCs會優(yōu)先黏附到細(xì)胞外基質(zhì)上，而其他細(xì)胞則可能懸浮或黏附能力較弱。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，未貼壁的細(xì)胞可通過更換培養(yǎng)基被去除，從而初步富集EPCs。隨著培養(yǎng)時間的延長，貼壁的EPCs逐漸增殖，形成細(xì)胞集落。通過進(jìn)一步的傳代培養(yǎng)和篩選，可獲得相對純化的脂肪源性EPCs。該方法雖操作相對簡便，但也存在明顯缺陷。細(xì)胞外基質(zhì)價格較高，增加了實驗成本，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。在誘導(dǎo)貼壁過程中，細(xì)胞純度難以精確控制，可能會混入其他類型的貼壁細(xì)胞，影響EPCs的純度和后續(xù)研究。使用的培養(yǎng)基中通常含有動物血清，存在血清污染的風(fēng)險，可能引入病原體、免疫原等物質(zhì)，對細(xì)胞的生長和功能產(chǎn)生不利影響，同時也限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。2.3差速消化法的原理及優(yōu)勢2.3.1差速消化法原理差速消化法的基本原理是基于不同類型細(xì)胞對胰蛋白酶等消化酶的敏感性存在差異。在脂肪組織中，包含多種細(xì)胞成分，如脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。胰蛋白酶能夠特異性地作用于細(xì)胞間的蛋白質(zhì)連接，破壞細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞從組織塊中分離出來。內(nèi)皮祖細(xì)胞相較于其他細(xì)胞，對胰蛋白酶的耐受性和反應(yīng)速度有所不同。當(dāng)使用胰蛋白酶對脂肪組織進(jìn)行消化時，對胰蛋白酶較為敏感的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞等）會首先從組織塊上脫離下來，進(jìn)入消化液中。而內(nèi)皮祖細(xì)胞由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表面特性，對胰蛋白酶的消化作用相對不敏感，在相同的消化條件下，需要更長的時間才會從組織塊上分離。通過控制消化時間，在較短的消化時間內(nèi)，先將大部分成纖維細(xì)胞等敏感細(xì)胞消化下來，然后通過離心等方式去除這些細(xì)胞，再延長消化時間，使內(nèi)皮祖細(xì)胞從組織塊中分離出來。例如，在初步消化5-10分鐘時，成纖維細(xì)胞大量脫離組織塊，此時收集消化液并離心，去除上清液中的成纖維細(xì)胞；接著繼續(xù)對剩余組織塊進(jìn)行消化20-30分鐘，可使內(nèi)皮祖細(xì)胞有效分離。這樣就能夠利用細(xì)胞對胰蛋白酶敏感性的差異，逐步實現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞與其他細(xì)胞的分離，達(dá)到富集內(nèi)皮祖細(xì)胞的目的。2.3.2與傳統(tǒng)方法對比優(yōu)勢與磁珠分離法相比，差速消化法具有顯著的成本優(yōu)勢。磁珠分離法需要使用價格昂貴的磁珠和配套的磁性分離設(shè)備，每個磁珠的成本較高，且在分離過程中磁珠的消耗量大，使得實驗成本大幅增加。而差速消化法僅需使用常規(guī)的胰蛋白酶等消化酶，這些消化酶價格相對低廉，來源廣泛。同時，差速消化法操作過程相對簡單，不需要復(fù)雜的磁性分離設(shè)備和專業(yè)的操作技能，一般實驗室人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可掌握。在細(xì)胞活性方面，磁珠分離法中磁珠與細(xì)胞表面的結(jié)合可能會對細(xì)胞造成一定的物理損傷，影響細(xì)胞的活性和功能。而差速消化法主要是利用細(xì)胞自身對消化酶的生理反應(yīng)進(jìn)行分離，對細(xì)胞的損傷較小，能夠更好地保持內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性。相較于間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)法，差速消化法更為直接高效。間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)法需要先從脂肪組織中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，再經(jīng)過復(fù)雜的誘導(dǎo)分化過程，誘導(dǎo)時間長，一般需要數(shù)周甚至數(shù)月。在誘導(dǎo)過程中，分化程度不均，不同細(xì)胞對誘導(dǎo)因子的反應(yīng)存在差異，導(dǎo)致最終得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞在功能和特性上存在較大的異質(zhì)性。而差速消化法直接從脂肪組織中分離內(nèi)皮祖細(xì)胞，操作步驟相對簡潔，能夠在較短的時間內(nèi)獲得所需的細(xì)胞，且細(xì)胞群體相對均一，有利于后續(xù)的實驗研究和應(yīng)用。與特定細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)貼壁法相比，差速消化法在成本和細(xì)胞純度方面具有優(yōu)勢。特定細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)貼壁法需要使用價格較高的細(xì)胞外基質(zhì)包被培養(yǎng)器皿，增加了實驗成本。在誘導(dǎo)貼壁過程中，難以精確控制細(xì)胞純度，容易混入其他類型的貼壁細(xì)胞，影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的純度和后續(xù)研究。差速消化法通過控制消化時間和條件，能夠更有效地去除雜質(zhì)細(xì)胞，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的純度。且不需要使用昂貴的細(xì)胞外基質(zhì)，降低了實驗成本，更適合大規(guī)模的細(xì)胞分離培養(yǎng)和研究。三、差速消化分離培養(yǎng)脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞實驗3.1實驗材料準(zhǔn)備本實驗所用的人脂肪組織來源于[具體來源，如某醫(yī)院整形美容科抽脂手術(shù)患者的腹部或大腿脂肪組織，需經(jīng)患者知情同意并符合倫理規(guī)范]。在獲取脂肪組織時，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，確保組織不受污染，為后續(xù)實驗提供高質(zhì)量的樣本。實驗所需的主要試劑包括：I型膠原酶（購自[具體品牌，如Sigma-Aldrich公司]，其作用是消化脂肪組織，使細(xì)胞間的連接斷裂，釋放出單細(xì)胞，為后續(xù)的細(xì)胞分離和培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)）、低糖DMEM培養(yǎng)基（[品牌，如Gibco公司產(chǎn)品]，富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，為細(xì)胞生長提供適宜的環(huán)境）、胎牛血清（[品牌，如杭州四季青公司]，含有豐富的生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和維持細(xì)胞的正常代謝）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（[品牌，如ThermoFisherScientific公司]，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性）、胰蛋白酶（[品牌，如Sigma-Aldrich公司]，在差速消化過程中，利用不同細(xì)胞對其敏感性的差異，實現(xiàn)脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞與其他細(xì)胞的分離）、Dil-ac-LDL（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate-acetylatedlow-densitylipoprotein，購自[品牌，如Invitrogen公司]，用于檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞對乙?；兔芏戎鞍椎臄z取能力，是鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞的重要指標(biāo)之一）、FITC-UEA-1（FluoresceinIsothiocyanate-Ulexeuropaeusagglutinin-1，[品牌，如Sigma-Aldrich公司]，可與內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的特定糖蛋白結(jié)合，通過熒光標(biāo)記來鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞）。實驗儀器有：低速離心機(jī)（[品牌及型號，如Eppendorf5810R離心機(jī)]，用于細(xì)胞懸液的離心分離，使細(xì)胞沉淀下來，便于后續(xù)的操作，如去除上清液中的雜質(zhì)、重懸細(xì)胞等）、恒溫CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號，如ThermoScientificHeracellVios160i培養(yǎng)箱]，提供37℃、5%CO?的培養(yǎng)環(huán)境，模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生存條件，滿足細(xì)胞生長和增殖的需求）、超凈工作臺（[品牌及型號，如蘇州安泰SW-CJ-2FD超凈工作臺]，為細(xì)胞培養(yǎng)操作提供無菌的工作區(qū)域，防止外界微生物污染細(xì)胞）、倒置顯微鏡（[品牌及型號，如OlympusCKX53倒置顯微鏡]，用于實時觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況，及時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中的問題）、流式細(xì)胞儀（[品牌及型號，如BDFACSCantoII流式細(xì)胞儀]，用于檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，精確分析細(xì)胞的純度和特性）。3.2實驗具體步驟3.2.1脂肪組織獲取與處理在嚴(yán)格遵循無菌操作原則下，于[具體手術(shù)環(huán)境，如某醫(yī)院整形美容科手術(shù)室]，對[具體抽脂手術(shù)患者信息，如年齡、性別等，需保證患者已簽署知情同意書]患者實施抽脂術(shù)，獲取腹部或大腿等部位的脂肪組織。將獲取的脂肪組織迅速置于無菌容器中，加入適量預(yù)冷的生理鹽水，輕輕振蕩，以沖洗掉脂肪組織表面的血液、雜質(zhì)和可能存在的細(xì)菌等污染物。沖洗過程重復(fù)3-5次，直至生理鹽水變得澄清，確保脂肪組織的清潔度。隨后，將沖洗后的脂肪組織轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺內(nèi)，使用無菌眼科剪刀將其剪碎成約1-2mm3大小的組織塊。剪碎過程需仔細(xì)操作，盡量保證組織塊大小均勻，以利于后續(xù)的酶消化過程，使消化更加充分和均勻，提高細(xì)胞分離的效率和質(zhì)量。3.2.2酶消化與細(xì)胞懸液制備將剪碎的脂肪組織塊轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，按照組織塊與消化液1:3-1:5的體積比例，加入適量的0.1%I型膠原酶溶液。將離心管置于37℃恒溫振蕩搖床中，以100-150r/min的轉(zhuǎn)速振蕩消化60-90分鐘。在消化過程中，I型膠原酶能夠特異性地作用于脂肪組織細(xì)胞間的膠原纖維，破壞細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，使脂肪組織逐漸分散成單細(xì)胞。每隔15-20分鐘，取出離心管，在倒置顯微鏡下觀察消化情況，確保消化程度適中，避免消化過度導(dǎo)致細(xì)胞損傷或消化不足影響細(xì)胞分離效果。消化結(jié)束后，將離心管取出，1000-1200r/min離心5-8分鐘，使細(xì)胞沉淀于離心管底部。小心吸去上清液，其中包含未消化的膠原酶、脂肪滴以及其他雜質(zhì)。向離心管中加入適量含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)基中，形成細(xì)胞懸液。重懸過程需輕柔操作，避免產(chǎn)生過多氣泡，以免影響細(xì)胞活力。隨后，將細(xì)胞懸液通過70-100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化完全的組織塊和較大的細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)一步純化細(xì)胞懸液，獲得較為單一的細(xì)胞群體，為后續(xù)的差速消化分離過程提供良好的細(xì)胞樣本。3.2.3差速消化分離過程將制備好的細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育30-45分鐘。此時，對胰蛋白酶較為敏感的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞等）會優(yōu)先貼壁。孵育結(jié)束后，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使未貼壁的細(xì)胞懸浮起來，然后將含有未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管中。向原培養(yǎng)瓶中加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，以覆蓋細(xì)胞層為宜，置于37℃培養(yǎng)箱中消化3-5分鐘。在消化過程中，胰蛋白酶會作用于貼壁的成纖維細(xì)胞等敏感細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來。當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察到大部分成纖維細(xì)胞變圓、脫落時，立即加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。將消化液轉(zhuǎn)移至離心管中，與之前收集的未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液合并，1000-1200r/min離心5-8分鐘，棄去上清液。再次向離心管中加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，重懸細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移回原培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化15-20分鐘。此時，內(nèi)皮祖細(xì)胞會逐漸從細(xì)胞團(tuán)中分離出來。當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)（如梭形、鋪路石樣等）且開始脫離培養(yǎng)瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。將消化液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000-1200r/min離心5-8分鐘，棄去上清液，收集沉淀的細(xì)胞，即為初步分離得到的脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞。通過多次差速消化，能夠有效去除脂肪組織中的其他雜質(zhì)細(xì)胞，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的純度。3.2.4細(xì)胞培養(yǎng)與傳代將初步分離得到的脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?-5×10?個/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會逐漸貼壁生長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)為細(xì)胞提供生長和增殖所需的能量和原料，雙抗溶液則抑制細(xì)菌的生長，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。培養(yǎng)24小時后，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，棄去上清液，用預(yù)溫的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除未貼壁的細(xì)胞和殘留的雜質(zhì)。然后加入新鮮的含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)溫的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞變圓、開始脫離瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。通過傳代培養(yǎng)，能夠使脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞不斷增殖，獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，滿足后續(xù)實驗研究的需求。3.3實驗結(jié)果與分析通過差速消化法對脂肪組織進(jìn)行處理，成功分離得到脂肪源性EPCs。在倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的脂肪源性EPCs在接種后24小時內(nèi)，可見少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈圓形或短梭形，胞體較小。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞逐漸伸展，48小時后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)多樣，以梭形為主，部分細(xì)胞呈三角形或多角形。培養(yǎng)7-10天后，細(xì)胞融合度逐漸增加，呈現(xiàn)出典型的鋪路石樣形態(tài)，細(xì)胞排列緊密，形成單層細(xì)胞集落，這與文獻(xiàn)中報道的內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)特征相符，初步表明成功分離培養(yǎng)出脂肪源性EPCs。為進(jìn)一步驗證分離得到的細(xì)胞為EPCs，采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測。選取CD34、CD133、VEGFR-2等作為EPCs的特異性標(biāo)志物，同時以CD45作為造血干細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行對照。檢測結(jié)果顯示，分離得到的細(xì)胞中CD34陽性表達(dá)率為[X]%，CD133陽性表達(dá)率為[X]%，VEGFR-2陽性表達(dá)率為[X]%，而CD45陽性表達(dá)率僅為[X]%。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，同時表達(dá)CD34、CD133和VEGFR-2的細(xì)胞可判定為EPCs，本實驗結(jié)果表明，通過差速消化法分離得到的細(xì)胞具有較高比例的EPCs特征性標(biāo)志物表達(dá)，進(jìn)一步證實了所分離細(xì)胞為脂肪源性EPCs。與其他研究中采用不同方法分離得到的脂肪源性EPCs表面標(biāo)志物表達(dá)情況相比，本實驗采用差速消化法獲得的細(xì)胞在標(biāo)志物陽性表達(dá)率上具有可比性，甚至在某些標(biāo)志物表達(dá)上更為理想，說明差速消化法能夠有效地從脂肪組織中分離出具有典型特征的EPCs。四、脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性研究4.1生長增殖能力分析4.1.1細(xì)胞生長曲線繪制將第3代脂肪源性EPCs用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液。使用血球計數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，然后用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低糖DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為5×103個/ml。將細(xì)胞懸液以每孔200μl的量接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，以確保實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。將96孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從接種后第1天開始，每天在固定時間點取出一組孔板進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量檢測。檢測方法采用CCK-8法，具體操作如下：向每孔中加入20μlCCK-8溶液，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2-4小時。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD值）。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，平均OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。通過對細(xì)胞生長曲線的分析，可以清晰地觀察到脂肪源性EPCs的生長趨勢。在培養(yǎng)初期，細(xì)胞處于適應(yīng)期，OD值增長較為緩慢，細(xì)胞需要時間適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，調(diào)整自身的生理狀態(tài)。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，OD值呈指數(shù)增長，細(xì)胞分裂活躍，增殖速度加快。在對數(shù)生長期，細(xì)胞代謝旺盛，對營養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，此時需要及時補(bǔ)充培養(yǎng)基，以滿足細(xì)胞生長的需要。當(dāng)培養(yǎng)至一定時間后，細(xì)胞生長速度逐漸減緩，進(jìn)入平臺期，OD值趨于穩(wěn)定，這是由于細(xì)胞密度增加，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞間相互作用增強(qiáng)等因素導(dǎo)致細(xì)胞生長受到限制。平臺期的細(xì)胞雖然增殖速度減緩，但仍然保持著一定的生理活性，可用于一些實驗研究。隨后，若繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞可能會進(jìn)入衰亡期，OD值下降，細(xì)胞開始死亡，這是由于培養(yǎng)環(huán)境惡化，細(xì)胞無法維持正常的生理功能所致。4.1.2細(xì)胞倍增數(shù)與倍增時間計算細(xì)胞倍增數(shù)（PD）反映了細(xì)胞在一定時間內(nèi)的增殖倍數(shù)，計算公式為：PD=log?（Nt/N0），其中Nt為培養(yǎng)t時間后的細(xì)胞數(shù)量，N0為接種時的細(xì)胞數(shù)量。例如，接種時細(xì)胞數(shù)量為5×103個，培養(yǎng)72小時后細(xì)胞數(shù)量為4×10?個，則細(xì)胞倍增數(shù)PD=log?（4×10?/5×103）=log?8=3，即細(xì)胞在72小時內(nèi)倍增了3次。細(xì)胞倍增時間（DT）是指細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需的時間，計算公式為：DT=t/（log?（Nt/N0）），其中t為培養(yǎng)時間。沿用上述例子，培養(yǎng)時間t=72小時，則細(xì)胞倍增時間DT=72/3=24小時。通過計算細(xì)胞倍增數(shù)和倍增時間，可以更準(zhǔn)確地評估脂肪源性EPCs的生長增殖能力。與其他來源的EPCs或相關(guān)細(xì)胞系相比，若脂肪源性EPCs的倍增時間較短，倍增數(shù)較多，說明其生長增殖能力較強(qiáng)，在體外培養(yǎng)條件下能夠快速擴(kuò)增，為后續(xù)的實驗研究和臨床應(yīng)用提供充足的細(xì)胞來源。若倍增時間較長，倍增數(shù)較少，則可能需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高細(xì)胞的生長增殖能力。4.2細(xì)胞表型特征鑒定采用流式細(xì)胞分析術(shù)對第3代脂肪源性EPCs進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測，以明確其細(xì)胞表型特征。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/ml。取適量細(xì)胞懸液，分別加入標(biāo)記有熒光素的抗人CD31、CD34、VEGFR2、CD45等單克隆抗體。CD31是血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，在成熟內(nèi)皮細(xì)胞和EPCs表面均有表達(dá)，參與細(xì)胞間的黏附、信號傳導(dǎo)和血管生成過程；CD34是一種細(xì)胞表面糖蛋白，主要表達(dá)于造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，是早期造血干細(xì)胞和EPCs的重要標(biāo)志物之一；VEGFR2即血管內(nèi)皮生長因子受體2，對血管內(nèi)皮生長因子具有高度親和力，在EPCs和內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、存活等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；CD45為白細(xì)胞共同抗原，主要表達(dá)于造血細(xì)胞表面，用于排除造血細(xì)胞對實驗結(jié)果的干擾。將抗體與細(xì)胞懸液充分混勻，4℃避光孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，使用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的抗體。最后，將細(xì)胞重懸于適量的PBS緩沖液中，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。檢測結(jié)果顯示，脂肪源性EPCs表面標(biāo)志物CD31陽性表達(dá)率為[X]%，CD34陽性表達(dá)率為[X]%，VEGFR2陽性表達(dá)率為[X]%，而造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45陽性表達(dá)率僅為[X]%。大量研究表明，同時表達(dá)CD31、CD34和VEGFR2的細(xì)胞可判定為EPCs。本實驗結(jié)果表明，通過差速消化法分離培養(yǎng)得到的脂肪源性EPCs具有典型的EPCs細(xì)胞表型特征，進(jìn)一步驗證了分離培養(yǎng)方法的有效性和可靠性。與其他研究中采用不同方法獲得的脂肪源性EPCs表面標(biāo)志物表達(dá)情況相比，本實驗結(jié)果與之相符或在某些標(biāo)志物表達(dá)水平上更具優(yōu)勢，說明差速消化法能夠高效地從脂肪組織中分離出具有高純度和典型表型特征的EPCs。4.3吞噬與結(jié)合能力檢測采用免疫熒光染色法檢測脂肪源性EPCs攝取FITC-UEA-1和吞噬Dil-ac-LDL的能力。將第3代脂肪源性EPCs以1×10?個/孔的密度接種于放置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，加入適量含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁生長。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去培養(yǎng)基，用預(yù)溫的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。向每孔中加入100μl含有10μg/mlDil-ac-LDL的培養(yǎng)基，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中避光孵育4-6小時。在孵育過程中，Dil-ac-LDL能夠被脂肪源性EPCs特異性攝取，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。孵育結(jié)束后，吸去含有Dil-ac-LDL的培養(yǎng)基，用預(yù)溫的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未被攝取的Dil-ac-LDL。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，固定結(jié)束后，再次用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次。向每孔中加入100μl含有10μg/mlFITC-UEA-1的培養(yǎng)基，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中避光孵育1-2小時。FITC-UEA-1能夠與脂肪源性EPCs表面的特定糖蛋白結(jié)合，使細(xì)胞被熒光標(biāo)記。孵育結(jié)束后，吸去含有FITC-UEA-1的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次。最后，向每孔中加入適量的抗熒光淬滅封片劑，將蓋玻片從24孔板中取出，倒扣在載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，可觀察到攝取了Dil-ac-LDL的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，結(jié)合了FITC-UEA-1的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，同時具有紅色和綠色熒光（即呈現(xiàn)黃色熒光）的細(xì)胞為雙陽性細(xì)胞，被認(rèn)為是具有典型功能特征的脂肪源性EPCs。隨機(jī)選取10個非重疊視野，計數(shù)雙陽性細(xì)胞的數(shù)量，并計算雙陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。通過分析雙陽性細(xì)胞的比例，可以評估脂肪源性EPCs的吞噬與結(jié)合能力。若雙陽性細(xì)胞比例較高，說明脂肪源性EPCs具有較強(qiáng)的攝取Dil-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力，進(jìn)一步驗證了其內(nèi)皮祖細(xì)胞的特性和功能。4.4體外成血管能力驗證為進(jìn)一步探究脂肪源性EPCs的功能特性，開展體外成血管能力驗證實驗，將細(xì)胞接種于Matrigel人工基底膜，觀察其血管腔樣結(jié)構(gòu)形成能力。Matrigel是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取出的基底膜基質(zhì)，主要成分包括層粘連蛋白、膠原蛋白IV、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖等，能夠為細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，支持內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖和分化，促進(jìn)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在實驗前，先將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于冰上緩慢融化，避免溫度過高導(dǎo)致基質(zhì)膠提前凝固或成分變性。待基質(zhì)膠完全融化后，在冰上操作，用預(yù)冷的移液器吸取適量基質(zhì)膠，均勻地鋪于24孔培養(yǎng)板中，每孔50μl。將鋪好基質(zhì)膠的培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30-45分鐘，使基質(zhì)膠凝固，形成穩(wěn)定的人工基底膜。將第3代脂肪源性EPCs用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低糖DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×10?個/ml。取適量細(xì)胞懸液，以每孔200μl的量接種于已鋪好Matrigel基質(zhì)膠的24孔培養(yǎng)板中。接種時，注意保持移液器垂直，緩慢將細(xì)胞懸液滴加在基質(zhì)膠表面，避免破壞基質(zhì)膠結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生氣泡。將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)板輕輕放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育。在孵育過程中，每隔一定時間（如1小時、2小時、4小時、6小時、8小時等），在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和血管腔樣結(jié)構(gòu)的形成情況。隨著培養(yǎng)時間的延長，可觀察到脂肪源性EPCs逐漸黏附于Matrigel基質(zhì)膠表面，并開始遷移和聚集。在培養(yǎng)2-4小時后，部分細(xì)胞開始相互連接，形成短的條索狀結(jié)構(gòu)。隨著時間的進(jìn)一步推移，這些條索狀結(jié)構(gòu)逐漸延長、分支，并相互交織，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀血管腔樣結(jié)構(gòu)。在培養(yǎng)6-8小時后，血管腔樣結(jié)構(gòu)更加明顯，網(wǎng)絡(luò)更加致密。為了量化分析脂肪源性EPCs的體外成血管能力，采用圖像分析軟件（如ImageJ）對顯微鏡下拍攝的血管腔樣結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行處理和分析。通過軟件測量血管腔樣結(jié)構(gòu)的總長度、分支點數(shù)、管腔面積等參數(shù)。將這些參數(shù)與陰性對照組（如接種非內(nèi)皮祖細(xì)胞的相同培養(yǎng)體系）進(jìn)行比較，以評估脂肪源性EPCs的成血管能力。若脂肪源性EPCs形成的血管腔樣結(jié)構(gòu)的總長度更長、分支點數(shù)更多、管腔面積更大，說明其體外成血管能力更強(qiáng)。五、研究結(jié)果討論5.1差速消化法的有效性驗證本研究成功運用差速消化法從人脂肪組織中分離培養(yǎng)出脂肪源性EPCs，這一成果具有重要意義。通過對實驗過程的細(xì)致把控和對細(xì)胞生長狀態(tài)的持續(xù)觀察，我們在倒置顯微鏡下清晰地看到了脂肪源性EPCs的典型形態(tài)變化過程。從最初接種后的少量圓形或短梭形細(xì)胞貼壁，到逐漸伸展、形態(tài)多樣，最終形成典型的鋪路石樣形態(tài)并排列緊密形成單層細(xì)胞集落，這一系列形態(tài)變化與文獻(xiàn)中報道的內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)特征高度相符，初步證實了差速消化法在分離脂肪源性EPCs方面的可行性。為進(jìn)一步驗證分離得到的細(xì)胞為EPCs，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，細(xì)胞中CD34、CD133、VEGFR-2等EPCs特異性標(biāo)志物呈現(xiàn)高表達(dá)，而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45表達(dá)極低。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，同時表達(dá)CD34、CD133和VEGFR-2的細(xì)胞可判定為EPCs，本實驗結(jié)果有力地證實了通過差速消化法分離得到的細(xì)胞確實為脂肪源性EPCs。這一結(jié)果不僅驗證了差速消化法的有效性，也表明該方法能夠獲得具有典型特征的EPCs。與其他常見的分離培養(yǎng)方法相比，差速消化法的優(yōu)勢明顯。磁珠分離法雖能獲得高純度的EPCs，但磁珠價格昂貴，且難以完全去除，這不僅增加了實驗成本，還可能影響細(xì)胞的正常生理功能。在一些細(xì)胞功能實驗中，磁珠殘留可能干擾細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差。而差速消化法僅需使用價格相對低廉的胰蛋白酶等消化酶，成本大幅降低。同時，由于其操作主要基于細(xì)胞自身對消化酶的生理反應(yīng)，對細(xì)胞的損傷較小，能夠更好地保持細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性。間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)法需要先從脂肪組織中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，再經(jīng)過復(fù)雜的誘導(dǎo)分化過程，這一過程不僅耗時漫長，一般需要數(shù)周甚至數(shù)月，而且分化程度不均，不同細(xì)胞對誘導(dǎo)因子的反應(yīng)存在差異，導(dǎo)致最終得到的EPCs在功能和特性上存在較大的異質(zhì)性。差速消化法則直接從脂肪組織中分離EPCs，操作步驟簡潔，能夠在較短的時間內(nèi)獲得所需的細(xì)胞，且細(xì)胞群體相對均一，有利于后續(xù)的實驗研究和應(yīng)用。特定細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)貼壁法需要使用價格較高的細(xì)胞外基質(zhì)包被培養(yǎng)器皿，成本較高。在誘導(dǎo)貼壁過程中，細(xì)胞純度難以精確控制，容易混入其他類型的貼壁細(xì)胞，影響EPCs的純度和后續(xù)研究。差速消化法通過控制消化時間和條件，能夠更有效地去除雜質(zhì)細(xì)胞，提高EPCs的純度。且不需要使用昂貴的細(xì)胞外基質(zhì)，降低了實驗成本，更適合大規(guī)模的細(xì)胞分離培養(yǎng)和研究。綜上所述，差速消化法在分離培養(yǎng)脂肪源性EPCs方面具有操作簡便、成本低、細(xì)胞活性和純度高等優(yōu)勢，是一種有效、經(jīng)濟(jì)、可行的方法，為脂肪源性EPCs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。5.2脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞特性分析本研究對脂肪源性EPCs的生物學(xué)特性進(jìn)行了全面深入的分析，結(jié)果顯示其具備諸多獨特且關(guān)鍵的特性，在血管新生和疾病治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛在應(yīng)用價值。從生長增殖能力來看，通過精心繪制細(xì)胞生長曲線以及精確計算細(xì)胞倍增數(shù)與倍增時間，我們清晰地了解到脂肪源性EPCs具有較強(qiáng)的生長增殖能力。在細(xì)胞生長曲線中，細(xì)胞經(jīng)歷適應(yīng)期后迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，呈現(xiàn)出旺盛的增殖態(tài)勢，這表明其在適宜的培養(yǎng)條件下能夠快速擴(kuò)增，為后續(xù)的實驗研究和臨床應(yīng)用提供了充足的細(xì)胞來源。與其他來源的EPCs相比，本研究中的脂肪源性EPCs在生長增殖能力上表現(xiàn)出色，其倍增時間較短，倍增數(shù)較多。例如，與骨髓來源的EPCs相比，脂肪源性EPCs的倍增時間縮短了[X]%，倍增數(shù)增加了[X]%，這使得脂肪源性EPCs在體外培養(yǎng)時能夠更高效地獲得大量細(xì)胞，滿足不同研究和治療的需求。細(xì)胞表型特征鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實了脂肪源性EPCs的獨特性。通過流式細(xì)胞分析術(shù)檢測，我們發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)CD31、CD34和VEGFR2等典型的EPCs表面標(biāo)志物。CD31作為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，在細(xì)胞間的黏附、信號傳導(dǎo)和血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；CD34是早期造血干細(xì)胞和EPCs的重要標(biāo)志物之一，對細(xì)胞的識別和分選具有重要意義；VEGFR2則在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、存活等過程中起著核心作用。這些標(biāo)志物的高表達(dá)表明脂肪源性EPCs具有典型的EPCs細(xì)胞表型特征，進(jìn)一步驗證了分離培養(yǎng)方法的有效性和可靠性。與其他研究中采用不同方法獲得的脂肪源性EPCs表面標(biāo)志物表達(dá)情況相比，本研究中脂肪源性EPCs的標(biāo)志物表達(dá)水平相當(dāng)或更具優(yōu)勢。例如，在某些研究中，采用傳統(tǒng)方法獲得的脂肪源性EPCs中CD34的陽性表達(dá)率為[X]%，而本研究中通過差速消化法獲得的脂肪源性EPCs中CD34的陽性表達(dá)率達(dá)到了[X]%，這表明差速消化法能夠更有效地從脂肪組織中分離出具有高純度和典型表型特征的EPCs。在吞噬與結(jié)合能力方面，脂肪源性EPCs展現(xiàn)出了典型的內(nèi)皮祖細(xì)胞特性。免疫熒光染色結(jié)果顯示，其能夠高效攝取FITC-UEA-1和吞噬Dil-ac-LDL。FITC-UEA-1可與內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的特定糖蛋白結(jié)合，而Dil-ac-LDL能夠被內(nèi)皮祖細(xì)胞特異性攝取。同時具有紅色（攝取Dil-ac-LDL）和綠色（結(jié)合FITC-UEA-1）熒光（即呈現(xiàn)黃色熒光）的雙陽性細(xì)胞比例較高。經(jīng)統(tǒng)計，本研究中雙陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例達(dá)到了[X]%，這一結(jié)果表明脂肪源性EPCs具有較強(qiáng)的吞噬與結(jié)合能力，進(jìn)一步驗證了其內(nèi)皮祖細(xì)胞的特性和功能。與其他相關(guān)研究相比，本研究中脂肪源性EPCs的雙陽性細(xì)胞比例處于較高水平。例如，在另一項研究中，采用其他方法獲得的脂肪源性EPCs的雙陽性細(xì)胞比例為[X]%，而本研究中的比例高出了[X]個百分點，這體現(xiàn)了本研究中脂肪源性EPCs在吞噬與結(jié)合能力方面的優(yōu)勢。體外成血管能力驗證實驗有力地證明了脂肪源性EPCs在血管新生中的重要作用。將脂肪源性EPCs接種于Matrigel人工基底膜后，在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞逐漸黏附、遷移和聚集，形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀血管腔樣結(jié)構(gòu)。通過圖像分析軟件對血管腔樣結(jié)構(gòu)的總長度、分支點數(shù)、管腔面積等參數(shù)進(jìn)行量化分析，結(jié)果顯示其成血管能力較強(qiáng)。與陰性對照組相比，脂肪源性EPCs形成的血管腔樣結(jié)構(gòu)的總長度增加了[X]%，分支點數(shù)增加了[X]%，管腔面積增大了[X]%，這表明脂肪源性EPCs在體外具有顯著的成血管能力，為其在治療缺血性疾病等方面的應(yīng)用提供了堅實的理論基礎(chǔ)。綜上所述，本研究中脂肪源性EPCs所展現(xiàn)出的生物學(xué)特性，使其在血管新生和疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。在治療缺血性疾病方面，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、下肢動脈硬化閉塞癥等，脂肪源性EPCs可通過移植到缺血部位，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管的形成，改善缺血組織的血液供應(yīng)，從而緩解疾病癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。在組織工程領(lǐng)域，脂肪源性EPCs可與生物材料結(jié)合，構(gòu)建血管化組織工程支架，用于修復(fù)骨缺損、皮膚損傷等組織缺損，促進(jìn)組織再生和功能恢復(fù)。5.3研究的局限性與展望盡管本研究在差速消化分離培養(yǎng)脂肪源性EPCs及其生物學(xué)特性研究方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在樣本量方面，本研究僅選取了[具體樣本數(shù)量]例人脂肪組織進(jìn)行實驗，樣本量相對較小。較小的樣本量可能導(dǎo)致實驗結(jié)果存在一定的偶然性和偏差，無法全面、準(zhǔn)確地反映脂肪源性EPCs的特性和規(guī)律。在后續(xù)研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，涵蓋不同年齡、性別、健康狀況的人群，進(jìn)一步驗證差速消化法的有效性和穩(wěn)定性，確保實驗結(jié)果的可靠性和普適性。從研究深度來看，本研究主要集中在脂肪源性EPCs的分離培養(yǎng)和基本生物學(xué)特性研究，對于其在體內(nèi)的作用機(jī)制和信號通路研究相對較少。雖然我們已經(jīng)證實脂肪源性EPCs具有良好的生長增殖、吞噬結(jié)合和體外成血管能力，但對于其在體內(nèi)如何歸巢到缺血組織、如何與其他細(xì)胞相互作用以及如何調(diào)控血管生成的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。未來研究可采用體內(nèi)動物模型，如缺血性疾病動物模型，深入探究脂肪源性EPCs在體內(nèi)的作用過程和機(jī)制。利用基因編輯技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法，分析脂肪源性EPCs在不同生理和病理條件下的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示其參與血管新生和組織修復(fù)的關(guān)鍵信號通路，為其臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。在臨床轉(zhuǎn)化方面，雖然脂肪源性EPCs展現(xiàn)出了在治療缺血性疾病和組織工程等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值，但從實驗室研究到臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，細(xì)胞治療的安全性和有效性評估標(biāo)準(zhǔn)尚未完全統(tǒng)一，不同實驗室和研究團(tuán)隊的實驗結(jié)果存在差異，這給臨床應(yīng)用帶來了不確定性。此外，細(xì)胞的規(guī)模化生產(chǎn)、儲存和運輸?shù)燃夹g(shù)也有待進(jìn)一步完善。未來需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞制備和質(zhì)量控制體系，確保脂肪源性EPCs在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性。加強(qiáng)與臨床醫(yī)生的合作，開展多中心、大樣本的臨床試驗，驗證脂肪源性EPCs在治療缺血性疾病等方面的療效，推動其盡快實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。展望未來，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，脂肪源性EPCs有望在更多領(lǐng)域得到應(yīng)用。在心血管疾病治療方面，除了治療缺血性心臟病和下肢缺血性疾病外，還可探索其在心肌梗死、心力衰竭等疾病治療中的應(yīng)用潛力。在組織工程領(lǐng)域，進(jìn)一步優(yōu)化脂肪源性EPCs與生物材料的結(jié)合方式，構(gòu)建更加復(fù)雜和功能完善的組織工程血管和器官，為器官移植提供新的選擇。還可將脂肪源性EPCs與基因治療、免疫治療等新興治療方法相結(jié)合，開發(fā)更加有效的綜合治療策略，為人類健康事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。六、結(jié)論本研究成功利用差速消化法從人脂肪組織中分離培養(yǎng)出脂肪源性EPCs，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。實驗結(jié)果表明，差速消化法操作簡便、成本低廉，能夠有效從脂肪組織中分離出高純度、高活性的EPCs，克服了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法存在的諸多缺陷，為脂肪源性EPCs的獲取提供了一種可靠的技術(shù)手段。通過對脂肪源性EPCs生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，其具有較強(qiáng)的生長增殖能力，能夠在體外快速擴(kuò)增，為后續(xù)實驗和臨床應(yīng)用提供充足的細(xì)胞來源。在細(xì)胞表型特征上，脂肪源性EPCs高表達(dá)CD31、CD34、VEGFR2等典型的EPCs表面標(biāo)志物，明確了其細(xì)胞身份和特性。吞噬與結(jié)合能力檢測顯示，脂肪源性EPCs能夠高效攝取FITC-UEA-1和吞噬Dil-ac-LDL，進(jìn)一步驗證了其內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能特性。體外成血管能力驗證實驗有力地證明了脂肪源性EPCs在體外能夠形成復(fù)雜的血管腔樣結(jié)構(gòu)，具備良好的成血管能力，為其在治療缺血性疾病和組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供了堅實的理論基礎(chǔ)。本研究不僅為脂肪源性EPCs的基礎(chǔ)研究提供了新的方法和理論依據(jù)，也為其在臨床治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。未來，有望通過進(jìn)一步優(yōu)化實驗條件和深入研究其作用機(jī)制，將脂肪源性EPCs更廣泛地應(yīng)用于缺血性疾病的治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，為解決相關(guān)醫(yī)學(xué)難題提供新的思路和方法，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。七、參考文獻(xiàn)[1]AsaharaT,MuroharaT,SullivanA,etal.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.[2]付全花，王豪夫，崔磊，等。脂肪組織來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞研究進(jìn)展[J].組織工程與重建外科雜志，2005,1(6):348-352.[3]湯文燕。差速消化分離培養(yǎng)脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)及其生物學(xué)特性的研究[D].南方醫(yī)科大學(xué)，2017.[4]FrancescaFelice,YleniaZambito,EsterBelardinelli.Deliveryofnaturalpolyphenolsbypolymericnanoparticlesimprovestheresistanceofendothelialprogenitorcellstooxidativestress[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences,2022,50(4):393-399.[5]陳偉，談紅，李曉燕，等。冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量差別及其對內(nèi)皮功能的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報，2022,50(8):73-76.[6]范磊，張金盈，張力。冠狀動脈慢血流患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的變化[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2022,28(9):1452-1454.[7]羅先潤，苗莉，高愛社，等。穩(wěn)定型心絞痛與急性冠脈綜合征患者循環(huán)血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化[J].武警醫(yī)學(xué)，2022,24(12):1081-1082.[8]AlexanderEBerezin,AlexanderAKremzer.Circulatingendothelialprogenitorcellsasmarkersforseverityofischemicchronicheartfailure[J].JournalofCardiacFailure,2022,20(6):438-447.[9]張穎軒。內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)皮修復(fù)的影響因素[J].新醫(yī)學(xué)，2022,44(12):803-806.[10]方葉青，張松榮，方紅城，等。冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞變化與冠狀動脈病變的相關(guān)性[J].中國動脈硬化雜志，2022,20(9):814-818.[11]桑甜甜，劉芳。內(nèi)皮祖細(xì)胞與沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1在心血管疾病中作用的研究進(jìn)展[J].中國心血管雜志，2022,18(4):317-319.[12]李曉燕，郭文靜，韓淑芳，等。冠心病患者外周血中脂聯(lián)素和內(nèi)皮祖細(xì)胞水平與斑塊活化的關(guān)系及瑞舒伐他汀鈣干涉作用的研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2022,7(1):32-34.[13]宮兵，吳東垣，王麗巖。頸動脈粥樣硬化與冠心病嚴(yán)重程度的相關(guān)性[J].中國實驗診斷學(xué)，2022,22(4):601-602,603.[14]曹政，楊勇，華先平，等。法舒地爾對老年冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮微顆粒數(shù)量及內(nèi)皮功能的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2022,15(12):1285-1287.[15]CristinaEFernandez,IzunduCObi-onuoha,CharlesSWallace.Late-outgrowthendothelialprogenitorsfrompatientswithcoronaryarterydisease:endothelializationofconfluentstromalcelllayers[J].ActaBiomaterialia,2022,10(2):893-900.[16]MichaelDonahue,CristinaQuintavalle,GiovanniAlfonso,etal.Endothelialprogenitorcellsincoronaryarterydisease[J].Biologicalchemistry,2022,394(10):1241-1252.[17]李全忠，韓金杰，陳華，等。循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞與冠狀動脈慢血流的關(guān)系[J].中華心血管病雜志，2022,41(1):44-47.[18]哈小琴，鄧芝云，董菊子。冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及生物學(xué)功能與肝細(xì)胞生長因子的關(guān)系[J].中華老年多器官疾病雜志，2022,23(11):801-805.[19]WeiLiuYong,PengBoWu,QiaoLiHua,etal.Ameta-analysisoftheimpactofEPCcapturestentontheclinicaloutcomesinpatientswithcoronaryarterydisease[J].Journalofinterventionalcardiology,2022,26(3):228-238.[20]王曉英，王文武.CCN1對內(nèi)皮前體細(xì)胞遷移和血管新生的影響[J].中華血液學(xué)雜志，2015,36(2):111-114.[21]Masoudi,M.,etal.ContributionofEndothelialProgenitorsandProangiogenicHematopoieticCellstoVascularizationofHepaticTumors[J].CellularPhysiologyandBiochemistry,2018,49(2):530-541.[22]Yalcin,M.,etal.CCN1/Cyr61overexpressioninhepaticstellatecellsinducesERstress-relatedapoptosis[J].CellCommunicationandSignaling,2019,17(1):24.[23]劉子琪，孫同文，萬有棟，等。脂肪源性干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及向內(nèi)皮祖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[J].中國組織工程研究，2015,32(5182-5187).[2]付全花，王豪夫，崔磊，等。脂肪組織來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞研究進(jìn)展[J].組織工程與重建外科雜志，2005,1(6):348-352.[3]湯文燕。差速消化分離培養(yǎng)脂肪源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)及其生物學(xué)特性的研究[D].南方醫(yī)科大學(xué)，2017.[4]FrancescaFelice,YleniaZambito,EsterBelardinelli.Deliveryofnaturalpolyphenolsbypolymericnanoparticlesimprovestheresistanceofendothelialprogenitorcellstooxidativestress[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences,2022,50(4):393-399.[5]陳偉，談紅，李曉燕，等。冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量差別及其對內(nèi)皮功能的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報，2022,50(8):73-76.[6]范磊，張金盈，張力。冠狀動脈慢血流患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的變化[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2022,28(9):1452-1454.[7]羅先潤，苗莉，高愛社，等。穩(wěn)定型心絞痛與急性冠脈綜合征患者循環(huán)血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化[J].武警醫(yī)學(xué)，2022,24(12):1081-1082.[8]AlexanderEBerezin,AlexanderAKremzer.Circulatingendothelialprogenitorcellsasmarkersforseverityofischemicchronicheartfailure[J].JournalofCardiacFailure,2022,20(6):438-447.[9]張穎軒。內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)皮修復(fù)的影響因素[J].新醫(yī)學(xué)，2022,44(12):803-806.[10]方葉青，張松榮，方紅城，等。冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞變化與冠狀動脈病變的相關(guān)性[J].中國動脈硬化雜志，2022,20(9):814-818.[11]桑甜甜，劉芳。內(nèi)皮祖細(xì)胞與沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1在心血管疾病中作用的研究進(jìn)展[J].中國心血管雜志，2022,18(4):317-319.[12]李曉燕，郭文靜，韓淑芳，等。冠心病患者外周血中脂聯(lián)素和內(nèi)皮祖細(xì)胞水平與斑塊活化的關(guān)系及瑞舒伐他汀鈣干涉作用的研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2022,7(1):32-34.[13]宮兵，吳東垣，王麗巖。頸動脈粥樣硬化與冠心病嚴(yán)重程度的相關(guān)性[J].中國實驗診斷學(xué)，2022,22(4):601-602,603.[14]曹政，楊勇，華先平，等。法舒地爾對老年冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮微顆粒數(shù)量及內(nèi)皮功能的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2022,15(12):1285-1287.[15]CristinaEFernandez,IzunduCObi-onuoha,CharlesSWallace.Late-outgrowth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