色譜分離技術(shù)

第一節(jié)色譜分離技術(shù)概要色譜技術(shù)的起源:葉綠素的石油醚溶液通過碳酸鈣管柱,并繼續(xù)以石油醚淋洗,由于碳酸鈣對(duì)葉綠素中各種色素的吸附能力不同,色素被逐漸分離,在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶。色譜系統(tǒng)由固相定相、流動(dòng)相、泵系統(tǒng)和在線檢測(cè)系統(tǒng)組成。特點(diǎn)是分離效率高，能分離性質(zhì)極性類似的物質(zhì)，能用于少量物質(zhì)的分析鑒定，也可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。一、色譜技術(shù)的基本概念利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性、分子大小、帶電情況、離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數(shù)不同，達(dá)到彼此分離的目的。

加入洗脫劑使各組分分層的操作稱為展開。洗脫時(shí)從柱中流出的液體稱為洗脫液。展開后各組分的分布情況稱為色譜圖。將樣品加到柱上的操作稱為上樣或加樣。（一）固定相可以是固體物質(zhì)，也可以是液體物質(zhì)組成：空間結(jié)構(gòu)部分，決定固定相尺寸與孔隙率；化學(xué)和生物大分子功能性成分，決定介質(zhì)與目標(biāo)溶質(zhì)特異性相互作用的能力。（二）流動(dòng)相推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界流體。柱色譜中稱為洗脫劑，薄層色譜中稱為展開劑。（三）分配系數(shù)定義：在一定條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中含量（濃度）的比值。它是色譜中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。待測(cè)組分在固定相和流動(dòng)相之間發(fā)生的吸附，脫附或溶解，揮發(fā)的過程叫做分配過程。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，分配系數(shù)的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用色譜方法能否分離的先決條件。差異越大，分離效果越理相。（四）阻滯因素阻滯因素又稱遷移率，指在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值。相對(duì)遷移率：指在一定條件下，在相同時(shí)間內(nèi)，某一組分在固定相中移動(dòng)的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動(dòng)的距離之比值。（五）分辨率分辨率也稱分離度，一般指相鄰兩峰分開程度。用Rs表示，Rs越大，兩組分分離得越好。當(dāng)Rs=1時(shí)，兩組分具有較好的分離，分離純度為98%。當(dāng)Rs=1.5時(shí)，兩組分基本完全分開，每種組分純可達(dá)99.8%。（六）解離常數(shù)Kp和分離因素

用解離常數(shù)討論分子間的相互作用。分離因素

定義為某一瞬間被吸附的溶質(zhì)占總量的分?jǐn)?shù)。對(duì)于一個(gè)有效的柱色譜分離，通常要求≥0.8，Kp一般要求≤0.1mol/l。（七）色帶變形和“拖尾”現(xiàn)象原因：固定相在色譜柱中橫向填充的不均勻，在固定相顆粒粗的地方，溶劑和溶質(zhì)流速快，就會(huì)形成斜歪、不規(guī)則的色帶；由于平衡關(guān)系偏離線性所引起的，當(dāng)柱中目標(biāo)物質(zhì)的色帶移動(dòng)時(shí)，分子由于縱向擴(kuò)散或不均勻流動(dòng)超出了色帶前緣，相對(duì)于后面的主色帶被阻滯，結(jié)果在主色帶前緣產(chǎn)生一個(gè)自動(dòng)削尖效應(yīng)。方法：使用細(xì)長(zhǎng)的色譜柱；使用不同梯度的緩沖液；選擇合適的展層劑。（八）正相色譜與反相色譜正相色譜是指固定相的極性高于流動(dòng)相的極性。非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)速度快，先從柱中流出來。反相色譜是指固定相的極性低于流動(dòng)相的極性，在這種色譜過程中，極性大的分子比極性小的分子移動(dòng)速度快而先從柱中流出。分離純化極性大的分子，采用正相色譜；分離純化極性小的有機(jī)分子，采用反相色譜。（九）操作容量操作容量是指在一定條件下，某種組分與固定相反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于固定相上的飽和容量。數(shù)值越大，固定相對(duì)該物質(zhì)的親和力越強(qiáng)。（十）洗脫體積使溶質(zhì)從柱中流出時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積，稱為洗脫體積。不同的溶質(zhì)有不同的洗脫體積（十一）檢測(cè)方法吸光度、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)、電導(dǎo)率、熒光、紅外吸收光譜、折射率、質(zhì)譜等。二、色譜法的分類（一）根據(jù)固定相基質(zhì)的形式紙色譜：以濾紙作為基質(zhì)薄層色譜：將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行色譜過程。柱色譜：將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行色譜分離。（二）根據(jù)兩相所處的狀態(tài)流動(dòng)相為氣體的稱為氣相色譜流動(dòng)相為液體的稱為液相色譜（三）根據(jù)分離原理的不同吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等。1、吸附色譜以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離的目的。2、分配色譜在一個(gè)有兩相同時(shí)存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的目的。相當(dāng)于連續(xù)性的溶劑抽提方法。3、離子交換色譜以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。固定相為離子交換劑，流動(dòng)相為電解質(zhì)溶液。4、凝膠過濾色譜以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的技術(shù)。分子篩原理。小分子物質(zhì)易進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流出柱子時(shí)間長(zhǎng)，大分子不易進(jìn)入凝膠內(nèi)部，先流出色譜柱。5、親和色譜根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對(duì)能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種技術(shù)。親和色譜是分離生物大分子最為有效的色譜技術(shù)。三、色譜系統(tǒng)的操作方法（一）裝柱裝柱是成功得到分離物質(zhì)最關(guān)鍵的一步。一般實(shí)驗(yàn)室采用重力沉降法和加壓法進(jìn)行裝柱。（二）平衡色譜柱填裝好后，必須用起始緩沖液平衡到與之pH和離子強(qiáng)度相同時(shí)才可使用。裝好的柱子要求均勻，無紋路，無氣泡，柱頂部平整。用藍(lán)色葡聚糖-2000在恒壓下走柱，若色帶均勻下降，則柱填裝均勻。（三）上樣量和上樣體積上樣體積越小，量越少，分離效果越好。對(duì)于分析型色譜，加樣量一般不超過柱床體積的0.5%-1%，制備型色譜加樣量一般不超過柱床體積的1%-3%。分子篩加樣量要遠(yuǎn)小于離子交換色譜。（四）洗脫改變洗脫液的pH,使大分子的電荷減少，從被吸附狀態(tài)變?yōu)榻怆x狀態(tài)。改變離子強(qiáng)度，增加洗脫液的離子強(qiáng)度，將被分離物從交換劑上換下來。同時(shí)改變pH及離子強(qiáng)度。洗脫方式有三種：一步洗脫、階段洗脫、梯度洗脫梯度洗脫洗脫液中含有兩種或以上不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變洗脫液中溶劑的配比和極性，通過洗脫液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。它可使分離時(shí)間縮短，分辨能力增加，提高最小檢出量和精度。

（五）流速及控制洗脫液的流速會(huì)影響色譜的分辨率，在整個(gè)分離過程中，要保持一個(gè)穩(wěn)定的流速。此流速要經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)來確定。流速過高，使色譜峰加寬，降低分辨率。流速可通過調(diào)節(jié)操作壓力來調(diào)節(jié)。（六）分部收集要將各組分分離，必須將溶液在洗脫液中已經(jīng)分離的各組分分部收集。每管收集的體積越小，越容易得到純的組分。分部收集可以人工操作，也可通過自動(dòng)部分收集器實(shí)現(xiàn)。（七）檢測(cè)和合并收集洗脫液按一定體積分別收集于試管中，為測(cè)定各部分中各種成分的分布，要用能特異性檢測(cè)被分離化合物的方法來進(jìn)行分析。比如吸光度。洗脫液的合并：根據(jù)洗脫峰的位置合并較窄的部分，純度較高；合并較寬的部分，含量較多。（八）洗脫峰純度鑒定檢測(cè)系統(tǒng)分辨率有限，一個(gè)對(duì)稱洗脫峰不一定代表一個(gè)純凈的組分。可進(jìn)一步采用電泳法、高效液相色譜法進(jìn)行鑒定。（九）脫鹽和濃縮純度檢測(cè)完畢后，可將同一組分合并。但要得到產(chǎn)品，必須進(jìn)行濃縮。可采用超濾法、透析法、冷凍干燥法或鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法。科研用的高純度樣品，需將已濃縮的樣品再一次上柱檢測(cè)。第二節(jié)吸附色譜法一、吸附色譜基本原理固體物質(zhì)具有吸附性能力，可將物質(zhì)從溶液中吸附到它的表面上。吸附劑從溶液中吸附物質(zhì)的同時(shí)，也有部分被吸附的該物質(zhì)從吸附劑上脫離（解吸）。被解吸下來的物質(zhì)向前移動(dòng)時(shí)，遇到前面新的吸附劑會(huì)被重新吸附，然后又被后來的洗脫液再次解吸，繼續(xù)向前移動(dòng)。經(jīng)這樣反復(fù)地吸附-解吸-再吸附-再解吸的過程。物質(zhì)沿洗脫液的前進(jìn)方向移動(dòng)，移動(dòng)速度取決于吸附劑對(duì)該物質(zhì)的吸附能力。吸附能力強(qiáng)，則向前移動(dòng)速度慢，反之則快，不同組分便會(huì)逐漸分離開。二、吸附薄層色譜法將吸附劑均勻地鋪在一塊玻璃上，形成薄薄的平面涂層，干燥后在涂層的一端點(diǎn)樣，豎直放入一個(gè)盛有少量展開劑的有蓋容器中，展開劑接觸到吸附劑涂層，借毛細(xì)作用向上移動(dòng)形成薄層色譜，使混合物得以分離。（一）基本原理吸附劑對(duì)樣品中各成分吸附能力不同，以及展開劑對(duì)它們的解吸附能力的不同，使各成分達(dá)到分離。經(jīng)過在吸附劑與展開劑之間多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)混合物分離。（二）吸附薄層色譜條件1、固定相選擇常用吸附劑（固定相）有硅膠、氧化鋁和聚酰胺等。固定相顆粒的大小對(duì)展開速度、遷移率、分離效果有顯著影響。2、展開劑選擇主要根據(jù)樣品中各組分的極性、溶劑對(duì)于樣品中各組分溶解度等因素來考慮。先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)，若展開不好，則用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次實(shí)驗(yàn)，直到先出適合的展開劑。3、相對(duì)移動(dòng)值從點(diǎn)樣開始到展開后的溶劑前沿?；旌衔镏懈鹘M分的移動(dòng)距離不同。4、顯色分離化合物若有顏色，可易識(shí)別，無需顯色?；衔餂]有顏色時(shí)，要識(shí)別點(diǎn)樣，使之顯色。主要有碘蒸氣顯色、紫外線顯色、噴霧顯色。（三）薄層色譜操作1、制板玻璃板洗凈，硅膠調(diào)成糊，均勻攤在玻璃上，晾干。用前烘干。用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板，對(duì)薄層板的要求是：需要有一定的機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)惰性，且厚度均勻、表面平整，因此玻璃板是最常用的。載板可以有不同規(guī)格，但最大不得超過20×20，玻璃板在使用前必須洗凈、干燥備用。玻板除另有規(guī)定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規(guī)格，要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。（三）薄層色譜操作2、點(diǎn)樣微量進(jìn)樣器在距底邊1.5-2.0cm處點(diǎn)樣，直徑小于3mm。定性：內(nèi)徑為0.5mm管口平整的普通毛細(xì)管。定量：微量注射劑。點(diǎn)樣直徑不超過5mm，點(diǎn)樣距離一般為1~1.5cm即可。3、展開吹干樣點(diǎn)，豎直放入層析缸中。展開劑要接觸到吸附劑下沿，但不接觸樣點(diǎn)。蓋上蓋子，展開。待展開劑上行到一定高度，取出板，畫出展開劑前沿線。4、顯色、計(jì)算遷移率吹干展開劑，合適方法顯色，測(cè)量移動(dòng)距離，計(jì)算相對(duì)移動(dòng)值。三、吸附柱色譜法（一）基本原理在一定條件下，吸附劑與被分離物質(zhì)之間產(chǎn)生作用，這種作用主要是物理和化學(xué)作用。物理作用來自于分子間的范德華力，化學(xué)作用主要是氫鍵作用。

（二）吸附柱色譜條件1、色譜柱選擇通常使用玻璃柱，可直接觀察色帶移動(dòng)情況。工業(yè)大型色譜柱可用金屬制造，在柱壁嵌一條有機(jī)玻璃帶。2、吸附劑的選擇所選吸附劑應(yīng)有最大的比表面積和足夠的吸附能力，對(duì)欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的溶解和解吸能力。與洗脫劑、溶劑及樣品組分不發(fā)生化學(xué)變化顆粒均勻，操作過程中不破裂。3、洗脫劑的選擇洗脫劑純度較高，不與樣品和吸附劑起化學(xué)反應(yīng)。對(duì)樣品溶解度大，黏度小，易流動(dòng)，容易與洗脫劑組分分開。（三）吸附色譜應(yīng)用主要體現(xiàn)在對(duì)生物小分子物質(zhì)的分離，在生物化學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域有比較廣泛的應(yīng)用。第三節(jié)分配色譜法一、基本原理分配色譜法是利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間分布情況不同而使混合物得到分離。相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑提取方法。是把其中一種溶劑固定，用另一種溶劑沖洗。這種分離不經(jīng)過吸附程序，僅由溶劑提取而完成，因此叫分配色譜法。固定在柱內(nèi)的液體稱固定相，需一種固體吸附它，此固體只起支撐作用，而不起分離作用。用作沖洗的液體稱流動(dòng)相。流動(dòng)相與固定相發(fā)生接觸，樣品中各成分在兩相間的分布不同，因此移動(dòng)速度不同。易溶于流動(dòng)相的成分移動(dòng)快，而在固定相中溶解度大的成分移動(dòng)慢，依此得到分離。二、分配色譜條件1、載體的選擇惰性的，沒有吸附能力的，能容留較大量固定相的物質(zhì)。主要有硅膠、硅藻土、纖維素等。2、固定相的選擇常用的固定相有水、緩沖溶液、酸的水溶液、甲酚胺、丙二醇、有機(jī)溶劑等。3、流動(dòng)相選擇一般選用為水所飽和的有機(jī)溶劑或水-有機(jī)溶劑互溶的混合液。如石油醚、醇類、酮類、苯類等。三、分配色譜基本操作1、裝柱固定相與載體混合后裝柱。2、加樣被分離物配成濃溶液，加到固定相載體上端；被分離物溶液用含固定相載體吸收，溶劑揮發(fā)后，加在載體上端；濾紙吸附被分離物，溶劑揮發(fā)后，放在載體上。3、洗脫四、分配色譜法應(yīng)用適用于分離極性大，在有機(jī)溶劑中溶解度小的成分，或極性很相似的成分。第四節(jié)離子交換色譜法一、基本原理通過分子中的活性離子將溶液中帶相反電荷的物質(zhì)吸附在離子交換劑上，然后用適當(dāng)?shù)南疵撊軇⑽轿镔|(zhì)再?gòu)碾x子交換劑上洗脫下來，達(dá)到分離的目的。離子交換樹脂是生產(chǎn)中常用的一種離子交換劑。利用離子交換樹脂作為吸附劑，將溶液中的待分離組分，依據(jù)其電荷差異，依靠庫(kù)侖力吸附在樹脂上，然后利用合適的洗脫劑將吸附質(zhì)從樹脂上洗脫下來，達(dá)到分離的目的。二、離子交換劑的類型與結(jié)構(gòu)（一）離子交換樹脂1、陽(yáng)離子交換樹脂強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂：活性基團(tuán)是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂：活性基團(tuán)有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基團(tuán)2、陰離子交換樹脂強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)為季銨基團(tuán)，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基弱堿性陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)為伯胺或仲胺，堿性較弱（二）多糖基離子交換劑固相載體為多糖類物質(zhì)，親水性強(qiáng)、交換空間大、對(duì)生物大分子物質(zhì)致變性作用。1、離子交換纖維素 樹脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團(tuán)的性質(zhì)可分為陽(yáng)離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類 特點(diǎn)：骨架松散、親水性強(qiáng)、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高2、離子交換葡聚糖和離子交換瓊脂糖凝膠骨架為葡聚糖凝膠:根據(jù)功能基團(tuán)的不同，亦可分為陽(yáng)離子交換和陰離子交換樹脂特點(diǎn)：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率三、離子交換劑的理化性能（一）離子交換樹脂的理化性能1、物理性質(zhì)外觀：球形、淺色為宜，粒度大小為16-60目;孔度、孔徑、比表面積機(jī)械強(qiáng)度：>90%；含水量：0.3-0.7g/g樹脂；穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性；膨脹度：交聯(lián)度、活性基團(tuán)的性質(zhì)與數(shù)量、活性離子的性質(zhì)、介質(zhì)的性質(zhì)和濃度、骨架結(jié)構(gòu)；濕真密度：?jiǎn)挝惑w積濕樹脂的重量；2、交換容量總交換量：每單位數(shù)量樹脂能進(jìn)行離子交換反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)的總量。工作交換容量：樹脂在某一條件下的離子交換能力。再生交換容量：一定的再生劑量條件下所取得的再生樹脂的交換容量。再生交換容量為總交換容量的50-90%，工作交換容量為再生交換容量的30-90%。3、吸附選擇性對(duì)陽(yáng)離子的吸附對(duì)陰離子的吸附對(duì)有色物的吸附（二）多糖基離子交換劑的理化性能極大的表面積和多孔結(jié)構(gòu)良好的化學(xué)、物理穩(wěn)定性離子交換纖維素適于易變性的生化產(chǎn)品的純化分離能力強(qiáng)，能將一組復(fù)雜的混合物逐一分開能分離純化毫克量的純品四、離子交換色譜基本操作（一）離子交換樹脂的操作1、離子交換樹脂的選擇對(duì)陰陽(yáng)離子交換樹脂，一般根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷來決定選用哪種樹脂。被分離物質(zhì)帶正電荷，則采用陽(yáng)離子交換樹脂，被分離物質(zhì)帶負(fù)電荷，則采用陰離子交換樹脂。2、對(duì)離子交換樹脂強(qiáng)弱的選擇目標(biāo)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的堿性和酸性時(shí)，宜選用弱酸或弱堿性的樹脂，以提高選擇性，并便于洗脫。目標(biāo)產(chǎn)物是弱酸或弱堿物質(zhì)時(shí)，宜選用強(qiáng)堿或強(qiáng)酸性樹脂，保證有足夠的結(jié)合力。3、對(duì)離子交換樹脂離子型的選擇主要根據(jù)分離目的進(jìn)行選擇。如將肝素鈉轉(zhuǎn)換成肝素鈣時(shí)，需將所用的陽(yáng)離子交換樹脂轉(zhuǎn)換成鈣離子型，然后與肝素鈉進(jìn)行交換。制備無離子水時(shí)，用H型的陽(yáng)離子交換樹脂和OH型的陰離子交換樹脂。2、操作條件的選擇交換時(shí)選擇合適的pH值溶液中產(chǎn)物的濃度：低價(jià)離子增加濃度有利于交換上樹脂，高價(jià)離子在稀釋時(shí)容易被吸附。洗脫條件應(yīng)盡量使溶液中被洗脫離子的濃度降低3、離子交換樹脂的預(yù)處理、轉(zhuǎn)型、再生與保存（1）預(yù)處理和轉(zhuǎn)型預(yù)處理：清洗轉(zhuǎn)型：預(yù)處理后，用酸或堿處理使之變?yōu)闅湫突蜮c型樹脂的操作。（2）再生用大量水沖洗使用后的樹脂，除去樹脂表面和空隙內(nèi)部吸附的各種雜質(zhì)然后用轉(zhuǎn)型的方法處理。（3）保存樹脂暫不使用時(shí)，以下述離子型保存：陽(yáng)離子交換樹脂為鈉型；陰離子交換樹脂為氯型；弱堿陰離子交換樹脂為游離胺型。4、離子交換基本操作靜態(tài)交換是將樹脂與交換溶液混合置一定的容器中攪拌進(jìn)行。也稱靜態(tài)洗脫。動(dòng)態(tài)交換是先將樹脂裝柱，交換溶液以平流方式通過床進(jìn)行交換。也稱動(dòng)態(tài)洗脫。離子交換完成后將樹脂所吸附的物質(zhì)釋放出來重新轉(zhuǎn)入溶液的過程稱為洗脫。（二）離子交換纖維素的操作在介質(zhì)中帶正電的物質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑，帶負(fù)電的物質(zhì)用陰離子交換劑。在高于其等電點(diǎn)條件下，分子帶負(fù)電而采用陰離子交換纖維素，低于等電點(diǎn)則采用陽(yáng)離子交換纖維素。離子交換纖維素顆粒較大易引起區(qū)帶擴(kuò)散，使分辨率降低。通常采用100-230目大小的顆粒。五、離子交換色譜的應(yīng)用可溶性的有機(jī)或無機(jī)離子化合物均可進(jìn)行離子交換色譜操作?；蟽r(jià)越高，被結(jié)合的生物物質(zhì)越強(qiáng)，相同化合價(jià)和條件下，結(jié)合的親和力隨原子數(shù)的增加而增加。應(yīng)用方式：反離子交換、物質(zhì)的濃縮、相似物質(zhì)的分離、離子排出、在離子交換葡萄糖和離子交換瓊脂糖上進(jìn)行分配色譜第五節(jié)親和色譜一、親和色譜概述親和色譜是利用親和作用分離純化生物物質(zhì)的液相色譜法，它根據(jù)生物分子與特定的固定配基之間的親和力不同而使生物分子得以分離。二、親和色譜原理1、原理主要應(yīng)用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵牢固結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對(duì)它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識(shí)別。2、親和色譜優(yōu)點(diǎn)高選擇性，待分離物質(zhì)與配基專一性結(jié)合，分辨率高。具有濃縮作用，可純化幾千倍，適用于含量極少的活性物質(zhì)分離操作條件溫和，有效保持樣品原有的生物學(xué)活性，適用于不穩(wěn)定的活性物質(zhì)的分離。三、親和色譜介質(zhì)（一）親和配基1、配基應(yīng)具備的條件必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)以利于固定在載體上配基的分子大小合適，以減小分離過程中的空間位阻效應(yīng)配基與被分離物質(zhì)之間有足夠大的親和力，復(fù)合物能穩(wěn)定一定時(shí)間配基與被分離物質(zhì)之間具有合適的特異性（專一性配基與特異性配基）。配基與待分離物之間的結(jié)合具有可逆性2、親和配基的分類按照配基的特性可分為有機(jī)小分子類、生物大分子類和染料化合物三類。按照配基的選擇性，親和色譜為配基又可分為專一性配基（僅對(duì)某種生物物質(zhì)具有特別強(qiáng)的親和性）和基團(tuán)特異性配基（對(duì)某類化學(xué)基團(tuán)或某一類生物分子具有結(jié)合作用）兩類。3、幾類常用的親和配基（1）抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，因此可利用抗體或抗原為配基分離純化相應(yīng)的抗原或抗體，此種親和色譜法又稱免疫親和色譜。利用免疫親和色譜法，特別是以單抗為配基的免疫親和色譜法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。（2）酶抑制劑：蛋白酶均存在抑制其活性的物質(zhì)稱酶抑制劑。具有特殊的結(jié)構(gòu)，能夠與酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酶的活性。酶的抑制劑可以作為配基用于酶的分離純化。（3）過度金屬離子銅、鎳、鋅等可與氮、硫、氧等供電原子產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用。許多蛋白質(zhì)和肽類分子表面都不同程度地含有暴露的組氨酸、半胱氨酸和色氨酸，這些氨基酸能與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用。因此可利用金屬螯合色譜得以分離純化。（4）組氨酸具有比較獨(dú)特的性質(zhì)，可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。在低鹽和pH約等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附最強(qiáng)，隨鹽濃度的增大，親和吸附作用降低。根據(jù)此特性，利用組氨酸為配基可親和分離等電點(diǎn)相差較大的蛋白質(zhì)。（二）載體1、載體應(yīng)具備的條件不溶于水，但具有高度親水性化學(xué)惰性，沒有或極少的物理吸附或離子交換等非特異性結(jié)合作用。具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于溶液的流動(dòng)和滲透。必須具有足夠的可同配基結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性具有良好的物理穩(wěn)定性均勻性好，最好是均勻的球形結(jié)構(gòu)，對(duì)不同分離產(chǎn)物具有不同的分離效果2、常用載體瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃除此之外，還有一些合成的高分子材料，具有剛性良好，粒度均勻，孔徑較大，pH適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。（三）活化劑載體上的化學(xué)基團(tuán)是不活潑的，不能與配基直接偶聯(lián)，通過化學(xué)反應(yīng)介質(zhì)上化學(xué)基團(tuán)處于活化狀態(tài)。能使載體發(fā)生產(chǎn)生自由基與配基結(jié)合的化學(xué)物質(zhì)稱為活化劑。四、親和色譜制備選擇合適的配基、載體和間隔臂選擇合適的活化劑和活化方法活化載體配基偶聯(lián)封閉未偶聯(lián)配基的活化基團(tuán)（一）配基的選擇目標(biāo)產(chǎn)物與配基之間的親和力的大小和專一性。它們之間的結(jié)合常數(shù)應(yīng)在104-108mol/l之間.如果配基與生物分子之間的結(jié)合作用過強(qiáng)，需要強(qiáng)烈的洗脫條件才能將給合物洗脫，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。（二）載體的選擇應(yīng)具有高的比表面積，親水凝膠較為適合做親和色譜的載體。不同的載體適合分離不同的生物分子。（三）載體偶聯(lián)1、偶聯(lián)條件的選擇pH緩沖液溫度和時(shí)間配基濃度2、偶聯(lián)反應(yīng)（1）溴化腈法用于多糖凝膠的活化，固定活性基團(tuán)為氨基的配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）對(duì)多糖類載體的活化在堿性（pH＞10）條件下數(shù)分鐘即可完成，之后的配基修飾亦需在堿性條件進(jìn)行，一般使用碳酸鹽緩沖液。反應(yīng)過程為：

（2）環(huán)氧基活化法可用于固定分子結(jié)構(gòu)為R-NH2、R-OH和R-SH的配基。常用的活化試劑為1,4-丁二醇-二縮水甘油醚（BGE）和環(huán)氧氯丙烷。以活化羥基為例：或引入活性基團(tuán)環(huán)氧基后，可采用直接法或間接法（氧化法、碳二亞胺法、戊二醛法）固定配基。

（3）硅膠的活化活化硅膠常采用硅烷化試劑，如γ-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和環(huán)氧丙基三甲基硅烷等，反應(yīng)為：引入活性氨基或環(huán)氧基后，在酸性溶液中環(huán)氧基可發(fā)生二醇化反應(yīng)：（四）間隔臂當(dāng)配基較小時(shí)，將其直接固定在載體上，會(huì)由于載體的空間位阻，配基大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。這時(shí)，需要在配基與載體之間連接一個(gè)“間隔臂”，使其發(fā)生有效的親和結(jié)合。間隔臂的作用間隔臂應(yīng)滿足以下條件：發(fā)生作用的活性位點(diǎn)必須位于配基分子的內(nèi)部，并且不能影響配基與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)合；長(zhǎng)度適當(dāng)，不能過短，否則難以和配基有效結(jié)合，不能太長(zhǎng)，以免自身某些基團(tuán)發(fā)生相互作用，同時(shí)結(jié)合能力下降；必須在某種特定的分離條件下能被洗脫（五）封閉活化結(jié)束后有少部分活化基團(tuán)未被配基偶聯(lián)，需要將其封閉?？杉尤脒^量的能與活化劑反應(yīng)的試劑封閉多余的活化基團(tuán)，或水解活化基團(tuán)。五、親和色譜法的操作過程1.配基固相化（樣品制備、裝柱、平衡）2.親和吸附3.解吸附4.色譜柱再生1.配基固定化。將與純化對(duì)象有專一結(jié)合作用的物質(zhì)，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和柱）。2.親和吸附（進(jìn)料和雜質(zhì)清洗）。將含有純化對(duì)象的混合物通過親和柱，純化對(duì)象吸附在柱上，其他物質(zhì)流出色譜柱。3.解吸附（目標(biāo)產(chǎn)物洗脫）。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質(zhì)洗脫出來。4.色譜柱再生。清洗液清洗。（一）樣品制備（二）裝柱與平衡（三）吸附：被分離的目標(biāo)產(chǎn)物與親和吸附介質(zhì)緊密結(jié)合的過程（四）清洗：洗去色譜柱中和吸附劑內(nèi)部未被吸附的雜質(zhì)，盡可能留下專一性吸附的結(jié)合物。（五）洗脫1、洗脫方法特異性洗脫：用能與配基可待分離物質(zhì)發(fā)生更強(qiáng)特異性親和作用的小分子化合物作為洗脫劑，通過與配基可目標(biāo)產(chǎn)物竟?fàn)幮越Y(jié)合，使配基與目標(biāo)產(chǎn)物解吸的洗脫方式。特異性洗脫通常在低濃度、中性pH下，條件溫和，有利于目標(biāo)產(chǎn)物的活性。同時(shí)有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度。例如：Lys和Arg均為t-PA（組織纖溶酶原激活劑）的抑制劑，利用固定化Lys為配基親和分離t-PA時(shí)，可用Arg溶液進(jìn)行洗脫。非特異性洗脫：改變洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等物化性質(zhì)，降低目標(biāo)產(chǎn)物與配基之間親和作用的洗脫方法。比如：目標(biāo)產(chǎn)物與配基通過靜電作用時(shí)，可提高離子強(qiáng)度法洗脫。2、洗脫方式一步洗脫：針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物與配基高度特異性結(jié)合的情況。調(diào)節(jié)洗脫液的性質(zhì)，以改變目標(biāo)產(chǎn)物與配基之間的結(jié)合作用，將目標(biāo)產(chǎn)物一次性洗脫下來，可得到較純的分離物。分步洗脫：親和配基的專一性結(jié)合作用較弱，配基上結(jié)合了包括目標(biāo)產(chǎn)物在內(nèi)的一組結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，需要幾中不同的洗脫條件分幾步洗脫。即先用解吸附作用弱的洗脫液，再用解吸附作用強(qiáng)的洗脫液?？蓪⒂H和力不同的成分從配基上分別洗脫下來。梯度洗脫：利用洗脫液的pH、離子強(qiáng)度等因素的梯度變化，將吸附性質(zhì)相同、特異性程度不同的物質(zhì)洗脫下來。隨著洗脫液解吸附能力的逐漸增強(qiáng)，與配基親和力不同的被吸附物質(zhì)分別被洗脫下來。效果比分步洗脫要好。（六）親和色譜介質(zhì)的再生與保存1、再生去除未被洗脫的仍然結(jié)合在親和介質(zhì)上的物質(zhì)，以使親和柱能反復(fù)使用。2、保存親和色