抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍(lán)四唑光化還原法）1、試劑的配制（1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。參考文獻(xiàn)：李合生主編：植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).高等教育出版社，2000：267～268。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。（4）60μM核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。 （5）2.25mM氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。酶液制備：取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。2、酶活性測定（1）反應(yīng)混合液配制(以60個樣為準(zhǔn))：分別取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸緩沖液5.4ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻；（2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30μl酶液于試管中（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000lux光照下反應(yīng)20min；同時做兩支對照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后測定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測定時用于調(diào)零。（4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測OD560(出現(xiàn)顏色即可測定)。（5）酶活性計算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50％所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個酶活單位（u）。SOD總活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/gFW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)；Vt為測定時的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g，測定時應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。過氧化物酶（POD）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取A母液(Na2HPO4)123ml和B母液(NaH2PO4)877ml混勻即為1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；（2）反應(yīng)混合液配制（以60個樣為準(zhǔn)）：取200mlPBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml30％的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液并加入30μl酶液，以PBS為對照調(diào)零，而后測定OD470值（測定40秒）。（邊加樣邊測定，測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）（4）酶活性計算：以每minOD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W