第一章第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術及應用（一）微生物的基本培養(yǎng)技術學習目標01掌握通過配制培養(yǎng)基，了解配制培養(yǎng)基的基本步驟，以及培養(yǎng)基中各類營養(yǎng)物質(zhì)的配比02通過對培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基進行滅菌，了解消毒和滅菌的原理及方法03通過對酵母菌進行純培養(yǎng)，理解并掌握微生物接種、分離和培養(yǎng)的基本原理和過程01從社會中來向經(jīng)過殺菌處理的牛奶中添加某些對人體有益的細菌，再經(jīng)過發(fā)酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復雜，一些人會在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？應該先對制作用具和原料進行滅菌處理，再接種純的菌種，并控制發(fā)酵條件，避免雜菌進入。自主學習任務單（一）請同學們閱讀教材P9-P110的內(nèi)容，思考討論并回答下列問題：1.培養(yǎng)基的概念？作用？2.培養(yǎng)基的類型？實驗室最常用的培養(yǎng)基？3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成？如何滿足不同微生物的特殊需求？課前導入防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養(yǎng)物是研究和應用微生物的前提，也是發(fā)酵工程的重要基礎。微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細菌、真菌、病毒及一些原生生物等。注意：本章中提及的微生物主要指用于發(fā)酵的細菌和真菌。02培養(yǎng)基的配制課前導入實驗室培養(yǎng)微生物關鍵:(1）提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件(2）確保其他微生物無法混入(3)并將需要的微生物分離出來培養(yǎng)基的配制無菌技術微生物的純化培養(yǎng)02培養(yǎng)基的配制【情景一】同學乙在學習了傳統(tǒng)發(fā)酵技術的應用后，在家進行了酸奶制作的實踐，同學乙的具體操作步驟如下：將瓶身、瓶蓋、勺子放在鍋中加熱煮沸10min；待瓶子稍冷卻后向其中倒入鮮奶并加入一定量的蔗糖，再放入鍋中沸水浴約10分鐘；待牛奶冷卻至不燙手時倒入牛奶量1/5的酸奶作“引子”，用勺子攪拌均勻，擰緊瓶蓋；將溫度調(diào)至40℃，繼續(xù)保溫7～8h。從微生物培養(yǎng)角度看，鮮奶相當于培養(yǎng)基，02培養(yǎng)基的配制(1)培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。(2)作用：無有凝固劑瓊脂液體培養(yǎng)基(3)種類：固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)微生物的分離與鑒定，活菌計數(shù)，保藏菌種觀察微生物的運動、分類鑒定用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。02培養(yǎng)基的配制【情景二】牛奶中的蛋白質(zhì)及糖分是細菌很好的營養(yǎng)物質(zhì),在適宜的濕度下，細菌就會生長，繁殖，使牛奶中微量的維生素全部破壞掉，長期食用會影響人體健康。下表是人工配制的培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g碳源、氮源、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源、碳源和維生素等NaCl5g無機鹽H2O定容至1000mL水1000mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成02培養(yǎng)基的配制(1)若添加瓊脂后，該培養(yǎng)基屬于什么(物理性質(zhì))培養(yǎng)基，理由是什么？(2)該培養(yǎng)基中主要提供碳源和氮源的物質(zhì)分別是什么？(3)該培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物同化作用類型是什么，理由是？固體牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。二者均屬于有機物。異養(yǎng)型微生物請結(jié)合教材10頁表1-1，思考以下問題：(4)歸納上述培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成。都含有水、碳源、氮源、無機鹽和維生素等，該培養(yǎng)基的配方中含有凝固劑瓊脂02培養(yǎng)基的配制(5)試從碳源和氮源的角度分析不同類型微生物所需的培養(yǎng)基成分的特點：微生物代謝類型碳源氮源能源藍細菌硝化細菌根瘤菌大腸桿菌NH4+、NO3-等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物CO2CO2糖類等有機物糖類、蛋白質(zhì)等有機物NH3N2蛋白質(zhì)等光能NH3的氧化有機物有機物02培養(yǎng)基的配制(1)基本成分：水、碳源、氮源、無機鹽。培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成①碳源：無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等（自養(yǎng)微生物的碳源）（異養(yǎng)微生物的碳源）②氮源：無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。③無機鹽：Ca、K、Mg為大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素02培養(yǎng)基的配制(2)特殊需求：滿足微生物對

pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的需求培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成③培養(yǎng)厭氧微生物時，需要提供無氧的條件。①培養(yǎng)乳酸桿菌時，需要在培養(yǎng)基中添加維生素；②培養(yǎng)霉菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至酸性；④培養(yǎng)細菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性；

又叫生長因子：微生物正常生長代謝所必需的，且不能用碳源、氮源自行合成的有機物，如維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。02培養(yǎng)基的配制微生物接種操作時為什么要“全副武裝”和在專門的設備內(nèi)進行？獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵是防止雜菌污染。03無菌技術【情景三】同學乙在制作酸奶時對鮮奶采用的消毒方法是煮沸消毒法，而工業(yè)生產(chǎn)中制作酸奶時對鮮奶常采用巴氏消毒法。自主學習任務單（二）請同學們閱讀教材P10-P11的內(nèi)容，思考討論并回答下列問題：1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵？

2.無菌技術包括什么？消毒和滅菌的概念？常用的消毒和滅菌方法？

3.已滅菌的材料用具應注意什么？如何避免周圍環(huán)境微生物的污染？4.(旁欄思考)無菌技術除用來防止培養(yǎng)物被污染外，還有什么作用？03無菌技術無菌技術在微生物研究、醫(yī)療操作、食品生產(chǎn)中采取的防止其他微生物污染的技術，就是無菌技術。消毒滅菌主要包括：03無菌技術無菌技術操作的對象：①實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒②培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌無菌操作過程中，應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。實驗操作應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。03無菌技術消毒：是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥物消毒法紫外線消毒100℃煮沸5～6min。可殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢。62～65℃煮30min或80～90℃下處理0.5～1min。可殺死絕大部分微生物，不破壞食物的營養(yǎng)成分。用70%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。對接種室、接種箱或超凈工作臺用紫外線照射30min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。滅菌：是指使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。03無菌技術濕熱滅菌干熱滅菌灼燒滅菌高壓蒸汽滅菌鍋干熱滅菌箱接種環(huán)灼燒滅菌注意：①使用前必須先把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，將鍋內(nèi)冷空氣排盡，才能達到預設的壓力和溫度。②滅菌完成時，待鍋內(nèi)壓力自然降到0時，再打開氣閥。無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？還能有效避免操作者自身被微生物感染?。?3無菌技術孢子是脫離親本后能直接或間接發(fā)育成新個體的生殖細胞。有時候可直接由營養(yǎng)細胞通過細胞壁加厚和積貯養(yǎng)料而形成，能抵抗不良環(huán)境條件。孢子：03無菌技術又稱內(nèi)生孢子，是細菌休眠體。芽孢含水量極低，抗逆性強，能經(jīng)受高溫、紫外線，電離輻射以及多種化學物質(zhì)滅殺等。惡劣環(huán)境下，一個細菌產(chǎn)生一個芽孢，條件適宜時重新成為一個細菌。芽孢：03無菌技術項目主要方法應用范圍消毒

巴氏消毒法

℃消毒30min或

℃處理15s或

℃處理10～15s

、啤酒、果酒和醬油等不耐高溫的液體煮沸消毒法100℃煮沸

min家庭餐具等生活用品紫外線消毒30W紫外燈照射

min(損傷細菌的DNA)化學藥物消毒

擦拭實驗者雙手水源牛奶63～6572～765～630體積分數(shù)為70%～75%的酒精氯氣接種室、接種箱或超凈工作臺80～85比較分析無菌技術03無菌技術比較分析無菌技術項目主要方法應用范圍滅菌灼燒滅菌直接在酒精燈火焰的

層灼燒干熱滅菌干熱滅菌箱中，

℃的熱空氣中維持

。高壓蒸汽滅菌(濕熱滅菌)充分燃燒接種工具，如涂布器、接種環(huán)、接種針或其他金屬用具、試管口或瓶口等160～170

1～2h100kPa、121℃的條件下，維持15～30min培養(yǎng)基等耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金屬用具等03無菌技術自主學習任務單（三）請同學們閱讀教材P11-P13的內(nèi)容，思考討論并回答下列問題：1.培養(yǎng)物、純培養(yǎng)物、純培養(yǎng)的概念2.什么是菌落？單菌落？3.獲得單菌落的方法？4.酵母菌的純培養(yǎng)的基本步驟？（注意倒平板和接種的具體操作）04微生物的純培養(yǎng)1.培養(yǎng)物：在微生物學中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養(yǎng)物；2.純培養(yǎng)物：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物；3.純培養(yǎng)：獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。相關概念：02培養(yǎng)基的配制在固體平板培養(yǎng)基上，單個微生物細胞或孢子可生長繁殖成一個具有特定形狀、肉眼可見的子細胞群體，稱為菌落。菌落單菌落：一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。04微生物的純培養(yǎng)稀釋涂布平板法平板劃線法獲得單菌落的方法：稀釋涂布平板法、平板劃線法純培養(yǎng)的基本步驟：配制培養(yǎng)基滅菌接種分離培養(yǎng)探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)材料用具酵母菌培養(yǎng)液、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蒸餾水、天平、小刀、紗布、燒杯、錐形瓶、棉塞、報紙、皮筋、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱和恒溫培養(yǎng)箱目的要求1.學會配制培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基并倒平板。2.學會進行無菌操作。3.嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落。探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)方法步驟1.制備培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基稱取去皮的馬鈴薯200g切成小塊加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛用紗布過濾濾液中加入20g葡萄糖，15~20g瓊脂用蒸餾水定容至1000mL得到濾液探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)滅菌將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞包上牛皮紙，并用皮筋勒緊壓力100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15~30min取5~8套培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿疊成一束用幾層牛皮紙包緊放入干熱滅菌箱內(nèi)，160~170℃滅菌2h探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)倒平板注意：待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置防止瓶口微生物污染培養(yǎng)基防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染溫度過高容易燙傷，低于50℃瓊脂會凝固。避免雜菌污染。探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)2.接種和分離酵母菌通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。接種環(huán)連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)平板劃線法①灼燒接種環(huán)，直至接種環(huán)金屬絲燒紅⑥在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃3-5條平行線，蓋上皿蓋。⑤試管口通過火焰，并塞上棉塞

②在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔出酵母菌培養(yǎng)液試管的棉塞③試管口通過火焰④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。劃3個平板（重復實驗）；1個不劃線（空白對照）2.接種和分離酵母菌探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)平板劃線法2.接種和分離酵母菌a.接種環(huán)只蘸一次菌液，但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次；b.劃線首尾不能相接；c.每次劃線前灼燒接種環(huán)進行滅菌；d.劃線操作結(jié)束后，仍需灼燒接種環(huán)。12345課堂互動1.若要按照如圖進行劃線，那么在接種劃線的操作過程中，共灼燒了幾次接種環(huán)？探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)圖中共劃了5個區(qū)域，在每次劃線前后均需要對接種環(huán)灼燒滅菌，因此共需要灼燒接種環(huán)6次。課堂互動2.在第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因：劃線后，線條末端酵母菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細胞繁殖而來的菌落探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)12345課堂互動3.為什么最后一次的劃線與第一次的劃線不能相連？最后一次的劃線已經(jīng)將細菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次的劃線相連則增加了細菌的數(shù)目，達不到純化的目的。探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)3.培養(yǎng)酵母菌：完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。警示：在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。對照：說明培養(yǎng)基是否被雜菌污染將接種后的平板探究·實踐：酵母菌的純培養(yǎng)1.在未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有，說明了什么？在未接種的培養(yǎng)基表面應該沒有菌落生長，如果有，說明培養(yǎng)基被雜菌污染或滅菌不徹底。結(jié)果分析與評價2.在接種酵母菌的培養(yǎng)基上，你是否觀察到了單菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致？如果你觀察到了不同形態(tài)的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？在接種酵母菌的培養(yǎng)基上可觀察到單菌落。如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特點，則說明純化酵母菌的操作成功；如果觀察到了不同形態(tài)的菌落，可能是接種的菌種不純或者無菌操作不規(guī)范等原因引起的。3.你是如何記錄實驗結(jié)果的？思維訓練：評估論點的可信程度有一段時間，水果“酵素”風靡各地。水果“酵素”制作的大致過程是:將洗凈、切成塊狀的水果放入潔凈的容器，再加入糖和水，密封，置于陰涼處發(fā)酵一至兩周。有人說，吃水果“酵素”可以美容、減肥、促進消化和提高免疫力。請評估這一論點是否可信。追問以下問題可以幫助你分析：“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么?水果“酵素”中可能含有哪些成分?它是否含有人們無法從其他食品中獲取但又是維護健康所必需的成分?水果“酵素”中的所有成分都有益于人體健康嗎?如果要更加有力地支持或反駁水果“酵素”有益健康的論點，應該怎樣獲取證據(jù)?05課堂小結(jié)無菌技術微生物的基本培養(yǎng)技術微生物的純培養(yǎng)紫外線消毒化學藥物消毒巴氏消毒煮沸消毒培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分消毒滅菌濕熱滅菌干熱滅菌灼燒滅菌平板劃線法稀釋涂布平板法06課堂小測1.下列有關培養(yǎng)基的敘述，錯誤的是()A.液體培養(yǎng)基要制成固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基中加入瓊脂B.細菌在固體培養(yǎng)基上生長，可以形成肉眼可見的菌落C.每種培養(yǎng)基都含有水、碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)D.培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)及O2的要求C解析：瓊脂是凝固劑，所以液體培養(yǎng)基要制成固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基中加入瓊脂，A正確；細菌在固體培養(yǎng)基上生