基因工程的基本工具和基本操作程序第54講考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具核心要點(diǎn)·再研典型例題·深研1.基因工程的概念轉(zhuǎn)基因

生物產(chǎn)品DNA分子遺傳性狀2.基因工程的工具 (1)限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”磷酸二酯鍵黏性末端①實(shí)例1——EcoRⅠ限制酶切割EcoRⅠ識別序列為GAATTCEcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端②實(shí)例2——SmaⅠ限制酶切割SmaⅠ識別序列為CCCGGGSmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端DNA兩條單鏈的切口處，伸出幾個(gè)核苷酸，剛好能互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。切口處是平整的，這樣的切口叫平末端。①要想獲得目的基因需要限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？②(源于選必3P74“拓展應(yīng)用”)限制酶不切割原核生物本身DNA分子的原因：要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端③(源于選擇性必修3P71“旁欄思考”)原核生物中存在限制酶的意義：原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。當(dāng)遭受外源DNA(如噬菌體)的入侵時(shí)，限制酶可切割外源DNA使之失效，以保證自身安全。(2)DNA連接酶——“分子縫合針”作用：類型：將兩個(gè)DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶縫合黏性末端和平末端縫合黏性末端和平末端來源：大腸桿菌作用：來源：作用：T4噬菌體E.coliDNA連接酶連接平末端的DNA片段效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈DNA復(fù)制、基因工程DNA復(fù)制、基因工程在兩個(gè)DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個(gè)核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶vsDNA聚合酶題后歸納與DNA有關(guān)的酶的比較名稱作用部位作用對象作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶RNA聚合酶將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸堿基對之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵DNA脫氧核苷酸DNA片段DNA將DNA切成兩個(gè)片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端(3)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”質(zhì)粒限制酶切割位點(diǎn)質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。最常用的載體——質(zhì)粒1.根據(jù)限制酶切割位點(diǎn)的位置確定限制酶的種類（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。（2）保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。（3）確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（或?yàn)榱吮ＷC目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接），可選用什么限制酶？可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。2.根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類3.根據(jù)Ti質(zhì)粒的T－DNA片段選擇限制酶

圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相應(yīng)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體并已表達(dá)的受體細(xì)胞，原理如圖所示：考向1分析基因工程的三種工具，考查科學(xué)思維1.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。利用L－谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如下圖方法將釀酒酵母S的L－谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coliA，構(gòu)建了以L－谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是(

)AA.圖中表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadBB.E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ－氨基丁酸時(shí)，L－谷氨酸鈉的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒2.(2023·新課標(biāo)卷，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

)A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C考向2結(jié)合載體的作用及特點(diǎn)，考查科學(xué)思維3.(2025·廣東廣州模擬)下列有關(guān)基因工程中載體的說法，正確的是(

)A.在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒B.所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體C.質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子D.作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因D4.(不定項(xiàng))(2024·江蘇常州期中)微生物常被用于基因工程中，下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(

) A.從耐熱的細(xì)菌中可獲取PCR所需的DNA聚合酶 B.大腸桿菌、酵母菌等微生物是基因工程常用的載體 C.作為載體的DNA分子需具有合成抗生素的基因 D.可用氯化鈉溶液處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

BCD5.(2025·湖北襄陽四中聯(lián)考)大腸桿菌pUC118質(zhì)粒是基因工程中常用的一種載體，具有氨芐青霉素抗性基因，該質(zhì)粒中某限制酶的唯一切點(diǎn)位于lacZ基因中。在特定的選擇培養(yǎng)基中，若lacZ基因沒有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍(lán)色；若lacZ基因被破壞，則菌落呈白色。關(guān)于圖中操作的敘述正確的是(

)BA.試管1中應(yīng)加入限制酶和DNA連接酶B.試管2中將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，需用Ca2＋處理大腸桿菌C.能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中存在的菌落均呈現(xiàn)白色D.試管3應(yīng)選擇藍(lán)色菌落內(nèi)的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序核心要點(diǎn)·再研典型例題·深研1.目的基因的篩選與獲取 (1)篩選合適的目的基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能（3）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）從基因文庫中獲?。?）通過DNA合成儀直接合成基因組文庫cDNA文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）前提：基因比較小、核苷酸序列已知DNA合成儀原理：DNA半保留復(fù)制，在體外對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制(2)獲取目的基因的方法PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一項(xiàng)根據(jù)

的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的

與

，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件條件DNA模板：引物(2種):四種脫氧核苷酸：一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸(dNTP)提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈DNA的原料TaqDNA聚合酶:緩沖溶液:一般添加Mg2+,激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶(催化形成磷酸二酯鍵)也能為DNA合成提供能量在細(xì)胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。高溫：

(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因兩種引物

耐高溫的DNA聚合酶指數(shù)形式瓊脂糖凝膠電泳5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’思考2：

PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？1.體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較2.引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意的問題 (1)設(shè)計(jì)引物的依據(jù)：目的基因兩端的核苷酸序列。 (2)引物設(shè)計(jì)時(shí)既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因：為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′端加上限制酶的酶切位點(diǎn)。 (3)使用的一對引物的序列不相同,因?yàn)槟康幕騼啥司哂胁煌暮塑账嵝蛄小?(4)引物設(shè)計(jì)的要求(或引物失效的原因)：每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對；兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對。

①每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對的原因：防止引物自身折疊。

②兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對的原因：防止引物之間配對，導(dǎo)致引物不能同模板鏈結(jié)合。 (5)兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的3′端；脫氧核苷酸連接在引物的3′端進(jìn)行延伸。[深度思考]1.設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請分別說明理由。①第1組：___________________________________________________________；②第2組：___________________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效題型一PCR技術(shù)的相關(guān)計(jì)算1.PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律P3412.若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個(gè)引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個(gè)引物數(shù)？

2.PCR中的數(shù)量關(guān)系復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含其中一種引物的數(shù)量1372n－1同時(shí)含兩種引物的數(shù)量0262n－2共消耗引物的數(shù)量26142n＋1－2[例1]

(2025·湖南岳陽模擬)“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)CA.第一輪復(fù)制得到2個(gè)DNA分子，即①②各一個(gè)B.第二輪復(fù)制得到4個(gè)DNA分子，即①②③④各一個(gè)C.第四輪復(fù)制得到16個(gè)DNA分子，其中有4個(gè)X基因D.經(jīng)五輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子(1)基因表達(dá)載體的組成及作用質(zhì)粒標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)啟動子終止子限制酶切位點(diǎn)位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，具有驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的作用。位于基因下游，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來。供目的基因插入載體中便于重組DNA的篩選載體DNA復(fù)制的起始點(diǎn)2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子(重組質(zhì)粒)同一種(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心載體自身環(huán)化片段間的連接目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自身環(huán)化目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接

反向連接目的基因11’22’122’1’22’1’1①質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化；

②質(zhì)粒與目的基因隨意連接單酶切法缺點(diǎn)：如何防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因反向連接？abab雙酶切的優(yōu)點(diǎn):防止質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因隨意連接選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對目的基因和質(zhì)粒切割，使基因兩端產(chǎn)生兩個(gè)不同的粘性末端方案二：雙酶切法a酶：b酶：思考：若目的基因兩端無合適的限制酶切割位點(diǎn)怎么辦？5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'5'3'3'3'3'引物1引物2引入限制酶識別序列引入限制酶識別序列5'3'3'5'3'3'5'3'3'3'5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'3'3'5'3'3'使用引物設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)突變。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞細(xì)胞種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法

受體細(xì)胞

轉(zhuǎn)化過程花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法體細(xì)胞或受精卵受精卵通常選原核細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植↓獲得具有新性狀的個(gè)體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞、并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。問題1：農(nóng)桿菌具有怎樣的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，利于目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞？（p81）

農(nóng)桿菌是生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。冠癭瘤（1）

農(nóng)桿菌：兩次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。第二次拼接：被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入第一次導(dǎo)入：將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌。第二次導(dǎo)入：含含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞(非人工操作)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法共有幾次DNA分子的拼接，幾次導(dǎo)入細(xì)胞？2.如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞 (1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。跳出題海P337(2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。(3)篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即含有重組質(zhì)粒的菌落，如圖中1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

檢測水平檢測目的檢測方法分子水平個(gè)體水平目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性

檢測目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性(1)目的：PCR擴(kuò)增、DNA分子雜交技術(shù)抗原-抗體雜交技術(shù)RT-PCR擴(kuò)增、RNA分子雜交技術(shù)如抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)4.目的基因的檢測與鑒定1.(2023·湖北卷，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)DA.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落2.(2024·新課標(biāo)卷，35)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如下圖所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列問題。(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是____________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是______________________________________________________________________________________________________________________________。磷酸二酯鍵

保證N基因啟動子、N基因、N基因終止子的完整性，確保N基因能夠順利表達(dá)(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對可以形成的堿基對有G—C和____________________。(3)用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是________________________；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是______________________。C—G、U—A、A—T菌株B2的基因組DNA無PCR產(chǎn)物(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是_____________________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。無空氣污染；更安全，無火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等關(guān)鍵·真題必刷1.(2023·重慶卷，12)某小組通過PCR(假設(shè)引物長度為8個(gè)堿基，短于實(shí)際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(如下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)BA.實(shí)驗(yàn)所用引物，其中一個(gè)序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對載體進(jìn)行酶切至少獲得了2個(gè)片段D.酶切片段和載體連接時(shí)可使用E.coli連接酶或T4連接酶2.(2024·黑吉遼卷，25)將天然Ti質(zhì)粒改造成含有Vir基因的輔助質(zhì)粒(輔助T－DNA轉(zhuǎn)移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，可提高轉(zhuǎn)化效率。細(xì)菌和棉花對密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強(qiáng)棉花抗病蟲害能力，進(jìn)行如下操作。回答下列問題。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是____________________________________________________________。提取過程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是____________________________________________________________。(2)本操作中獲取目的基因的方法是______________和_________________。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。

水解蛋白質(zhì)，使得DNA與蛋白質(zhì)分離

溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNAPCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動子，其作用是___________________________________,驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動子，其目的可能是________________________。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。RNA聚合酶識別并結(jié)合的部位提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率(4)根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用________基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是________和________。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。HygBRF3R2(6)本研究采用的部分生物技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程，理由是________(單選)。A.通過含有雙質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞B.將蘇云金桿菌Bt基因?qū)朊藁?xì)胞中表達(dá)C.將1～1362基因序列改變?yōu)槊藁?xì)胞偏好密碼子的基因序列D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列獲得改造的抗蟲蛋白注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。D3.(2024·重慶卷，19)大豆是重要的糧油作物