PCR技術(shù)和基因編輯技術(shù)微專題11

熱點1

基因編輯技術(shù)思維建?！び|類旁通解題覺醒·融會貫通CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能對基因進行定點編輯，其原理是由一條單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割(如圖)。CRISPR復(fù)合體中的sgRNA的主要功能是與靶向基因(目的基因)上特定的堿基序列互補，從而定向引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向基因結(jié)合，并在特定位點切割DNA。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因生物，與傳統(tǒng)的基因工程相比，其明顯優(yōu)點是避免了因目的基因隨機插入宿主細(xì)胞DNA引起的生物安全性問題。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因治療、基因水平進行動植物的育種、研究基因的功能等方面有廣闊的應(yīng)用前景。1.(2025·山東青島調(diào)研)CRISPR/Cas9是一種基因編輯技術(shù)，Cas9蛋白能與人工設(shè)計的sgRNA形成復(fù)合體(如圖)。利用該技術(shù)可以對DNA進行一系列的定向改造。下列相關(guān)敘述錯誤的是(

)DA.Cas9蛋白屬于限制酶，能切割目的基因B.sgRNA具有能與目的基因發(fā)生堿基互補配對的結(jié)構(gòu)C.基因編輯技術(shù)能夠定點插入、刪除或替換部分堿基對D.通過基因編輯技術(shù)引起的變異屬于基因重組2.(2025·山東煙臺調(diào)研)豬瘟病毒能與豬細(xì)胞膜上的LamR受體蛋白結(jié)合，進而侵入細(xì)胞引起豬瘟。利用基因編輯技術(shù)改變LamR受體蛋白基因，使LamR受體蛋白不能與豬瘟病毒正常結(jié)合，但不影響生理功能，從而培育出抗豬瘟病毒豬?；蚓庉嬙硎怯梢粭l人為設(shè)計的單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)Cas9蛋白到特定的DNA位點進行切割，從而完成對目的基因的編輯。基因編輯過程如圖所示。下列敘述錯誤的是(

)BA.培育抗豬瘟病毒豬，一般選擇受精卵作為基因編輯的受體細(xì)胞，這樣獲得的個體的所有細(xì)胞都無法被豬瘟病毒感染B.Cas9蛋白的功能是準(zhǔn)確識別DNA特定序列并進行切割C.改造后的受體細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)發(fā)育到囊胚或桑葚胚時，可將其進行冷凍保存或胚胎移植D.通過基因編輯技術(shù)改造前后的兩種LamR基因是等位基因熱點2

PCR技術(shù)的應(yīng)用題型二PCR定點突變技術(shù)1.重疊延伸PCR技術(shù)

重疊延伸PCR技術(shù)其主要設(shè)計思路是用具有互補配對片段的引物(圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點)，分別進行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。如某科研團隊運用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖：重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4PCR定點突變技術(shù)重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3第二次引物2引物1第二次引物3?引物4重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3第二次引物2引物1第二次引物3?引物2引物3方案一：引物1引物4引物4方案二：Taq酶Taq酶Taq酶Taq酶引物4引物1重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3第二次引物2引物1第二次引物3?引物2引物3方案一：引物1引物4引物4方案二：Taq酶Taq酶Taq酶Taq酶引物4引物1擬突變位點引物4引物3引物1引物2對比：[例2]

(2025·吉林通化質(zhì)檢)重疊延伸PCR可實現(xiàn)定點基因誘變，其操作過程如圖所示(凸起處代表突變位點)。下列說法正確的是(

)A.過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率B.過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物C.過程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過程D.若過程④得到16個突變基因則需要消耗15個通用引物RP2D重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR定點突變技術(shù)PCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物常規(guī)下游引物突變上游引物第一次復(fù)制擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR定點突變技術(shù)PCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物常規(guī)下游引物突變上游引物第一次復(fù)制第二次復(fù)制突變上游引物常規(guī)下游引物作為下一輪PCR的大引物擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR定點突變技術(shù)PCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物常規(guī)下游引物突變上游引物第一次復(fù)制第二次復(fù)制突變上游引物常規(guī)下游引物作為下一輪PCR的大引物PCR2使用常規(guī)上游引物和大引物第一次復(fù)制常規(guī)下游引物大引物擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR定點突變技術(shù)PCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物常規(guī)下游引物突變上游引物第一次復(fù)制第二次復(fù)制突變上游引物常規(guī)下游引物作為下一輪PCR的大引物PCR2使用常規(guī)上游引物和大引物第一次復(fù)制常規(guī)下游引物大引物擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR定點突變技術(shù)PCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物常規(guī)下游引物突變上游引物第一次復(fù)制第二次復(fù)制突變上游引物常規(guī)下游引物作為下一輪PCR的大引物PCR2使用常規(guī)上游引物和大引物第一次復(fù)制常規(guī)下游引物大引物第二次復(fù)制常規(guī)下游引物常規(guī)上游引物擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR定點突變技術(shù)PCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物常規(guī)下游引物突變上游引物第一次復(fù)制第二次復(fù)制突變上游引物常規(guī)下游引物作為下一輪PCR的大引物PCR2使用常規(guī)上游引物和大引物第一次復(fù)制常規(guī)下游引物大引物第二次復(fù)制常規(guī)下游引物常規(guī)上游引物擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物大引物PCRPCR定點突變技術(shù)PCR1使用常規(guī)下游引物和突變上游引物常規(guī)下游引物突變上游引物第一次復(fù)制第二次復(fù)制突變上游引物常規(guī)下游引物作為下一輪PCR的大引物PCR2使用常規(guī)上游引物和大引物第一次復(fù)制常規(guī)下游引物大引物第二次復(fù)制常規(guī)下游引物常規(guī)上游引物擬突變位點常規(guī)下游引物突變上游引物常規(guī)上游引物對比：2.反向PCR擴增已知序列兩側(cè)的未知序列

當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術(shù)。原理是：用限制酶切割該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴增出未知序列。原理如圖。PCR定點突變技術(shù)PCR技術(shù)拓展應(yīng)用PCR技術(shù)拓展應(yīng)用熒光定量PCR重疊延伸PCR大引物PCR清楚兩種PCR的大致過程，能看懂圖示作答已知序列未知序列未知序列用EcoRⅠ限制酶切割已知序列未知序列未知序列自身環(huán)化反向PCR技術(shù)已知序列未知序列未知序列用EcoRⅠ限制酶切割已知序列未知序列未知序列自身環(huán)化引物1引物2引物3引物4反向連接選哪種引物？引物1引物2反向PCR技術(shù)已知序列未知序列未知序列用EcoRⅠ限制酶切割已知序列未知序列未知序列自身環(huán)化引物1引物2引物3引物4反向連接選哪種引物？引物1引物2引物3引物4反向PCR技術(shù)已知序列未知序列未知序列用EcoRⅠ限制酶切割已知序列未知序列未知序列自身環(huán)化引物1引物2引物3引物4反向連接選哪種引物？引物1引物2引物3引物4復(fù)制完后展開成鏈狀復(fù)制完后展開成鏈狀引物1引物2引物3引物4反向PCR技術(shù)引物1和引物2繼續(xù)擴增大量引物3和引物4繼續(xù)擴增大量反向PCR技術(shù)典例分析例：節(jié)選(3)基因工程中目的基因插入的位點通常具有不確定性，若要檢測目的基因所插入染色體的位置則可采用反向PCR技術(shù)。如圖是利用反向PCR技術(shù)分析基因a所插入染色體位置的流程圖。①步驟Ⅰ、Ⅱ所需要的酶分別是________________、______________。限制酶DNA連接酶典例分析②已知基因a的一條單鏈序列為5‘—GCAATGCGTAGCCTCT…AACTATGCGCTCATGA-—3′(虛線處省略了部分核苷酸序列)，則在步驟Ⅲ中選用的PCR引物是__________。A．5'—-AACTATGCGCTCATGA-—3′B．5'—-TTGATACGCGAGTACT-—3′C．5'-—GCAATGCGTAGCCTCT-—3′D．5'-—AGAGGCTACGCATTGC—-3′AD(3)構(gòu)建基因表達載體需要用限制酶切割后再用DNA連接酶進行連接。DNA聚合酶只能沿著子鏈的3′端延伸，且擴增的是未知序列，引物應(yīng)該結(jié)合在模板鏈的3′端。[例3]

(2025·湖南長郡中學(xué)聯(lián)考)反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計引物對未知序列(圖中L、R)進行擴增的技術(shù)，其過程如圖所示。下列相關(guān)敘述錯誤的是(

)A.過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割B.過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵C.過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶D.該技術(shù)可檢測T－DNA整合到植物染色體DNA的位置C3.融合PCR技術(shù)與融合蛋白

融合PCR技術(shù)采用具有互補末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來，進而可以用于生產(chǎn)融合蛋白。[例4]

(2025·河北衡水金卷)融合PCR技術(shù)(fusionPCR)采用具有互補末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來，為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡捷的途徑。圖1表示融合PCR技術(shù)的過程示意圖(P1～P4表示引物)，圖2表示融合后產(chǎn)物的電泳圖。(1)從化學(xué)本質(zhì)上來說，引物是___________________________，其作用是___________________________________________________。(2)圖1過程設(shè)計的P2與P3引物的添加序列必須能夠發(fā)生____________。融合PCR步驟1中，至少進行________次循環(huán)才能獲得基因A的PCR產(chǎn)物。一小段單鏈DNA或RNA使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸堿基互補配對2(3)融合PCR步驟2中基因A、B融合形成一個基因的機制是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。若要對A、B融合基因繼續(xù)進行PCR擴增，則圖1中的M、N處位置所需要的引物分別是________。引物P2與P3添加序列的互補鏈發(fā)生堿基互補配對，然后在TaqDNA聚合酶的作用下向兩邊延伸，基因A、B完成融合P1、P4(4)圖2中電泳圖中________號條帶最可能表示融合后片段，若PCR反應(yīng)沒有擴增出任何產(chǎn)物，則可能的原因是____________________________________________________________________________________________________(至少兩點)。4

復(fù)性溫度太高；引物設(shè)計不合理，無法與目的基因結(jié)合PCR定點突變技術(shù)反向PCR技術(shù)PCR技術(shù)拓展應(yīng)用PCR技術(shù)拓展應(yīng)用熒光定量PCR重疊延伸PCR大引物PCR清楚兩種PCR的大致過程，能看懂圖示作答過程意義5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針探針完整時，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；34PCR定點突變技術(shù)反向PCR技術(shù)PCR技術(shù)拓展應(yīng)用PCR技術(shù)拓展應(yīng)用重疊延伸PCR大引物PCR清楚兩種PCR的大致過程，能看懂圖示作答過程意義5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針探針完整時，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；34PCR定點突變技術(shù)反向PCR技術(shù)PCR技術(shù)拓展應(yīng)用PCR技術(shù)拓展應(yīng)用重疊延伸PCR大引物PCR清楚兩種PCR的大致過程，能看懂圖示作答過程意義5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針探針完整時，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；34PCR定點突變技術(shù)反向PCR技術(shù)PCR技術(shù)拓展應(yīng)用PCR技術(shù)拓展應(yīng)用重疊延伸PCR大引物PCR清楚兩種PCR的大致過程，能看懂圖示作答過程意義5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針探針完整時，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；345’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解，報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光。345’3’3’5’引物25’3’引物15’3’R熒光基團淬滅熒光基團探針QDNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解，報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光。345’3’3’5’引物25’3’引物15’3’R熒光基團淬滅熒光基團探針QDNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解，熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光。每擴增一次，就有一個熒光分子產(chǎn)生。閾值熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高，Ct值越小(如圖)。1．實時熒光定量PCR可用于對樣品中特定DNA序列進行定量分析。將熒光標(biāo)記的Taqman探針與待測樣本DNA混合，當(dāng)探針完整時，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，在特定光的激發(fā)下R發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號強度增加，通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值(達到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù))。下列相關(guān)敘述正確的是（

）1.下列相關(guān)敘述正確的是（

）A．熒光基因R連接在探針的3’端B．該反應(yīng)體系中并未加入ATP，所以新鏈的合成不需要消耗能量C．TaqDNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是合成磷酸二酯鍵D．Ct值越小，說明樣品中特定DNA序列的含量越多D【分析】實時熒光定量PCR技術(shù)中，TaqDNA聚合酶有兩個作用，一是形成子鏈的磷酸二酯鍵，二是水解探針，破壞磷酸二酯鍵；破壞探針導(dǎo)致熒光出現(xiàn)，Ct值越大，即是熒光強度越大，說明樣品中特定DNA序列的含量越多?！驹斀狻緼、因為引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸，從圖中引物1的方向可以分析出，R端是5'端，A錯誤；B、該反應(yīng)體系中并未加入ATP，但新鏈的合成需要消耗能量，解旋的能量來自于高溫，聚合的能量來自于原料，B錯誤；C、在該反應(yīng)中TaqDNA聚合酶有兩個作用，一是形成子鏈的磷酸二酯鍵，二是水解探針，破壞磷酸二酯鍵，C錯誤；D、Ct值越小，達到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)越少，說明樣品中特定DNA序列的含量越多，D正確。故選D。2．熒光PCR法根據(jù)化學(xué)發(fā)光原理可以分為染料法和探針法。染料法中特殊染料本身不發(fā)光，但是當(dāng)PCR擴增的時候，染料能夠與DNA雙鏈