廣州地區(qū)登革病毒1型分子進(jìn)化特征及傳播溯源研究一、引言1.1研究背景與意義登革熱是一種由登革病毒（Denguevirus，DENV）引起，經(jīng)伊蚊叮咬傳播的急性傳染病。其臨床癥狀多樣，從輕癥登革熱，如類似流感的發(fā)熱、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)疼痛、皮疹等，到重癥登革熱，可發(fā)展為登革出血熱（Denguehemorrhagicfever，DHF）和登革休克綜合征（Dengueshocksyndrome，DSS），出現(xiàn)嚴(yán)重出血傾向、休克甚至死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，全球目前約有25億人處于感染登革病毒的風(fēng)險之中，每年約有1億人感染，50萬人發(fā)展為登革出血熱或登革休克綜合征，其中約2.5萬人死亡，患者多數(shù)為兒童和青少年，對公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在過去幾十年中，隨著全球氣候變暖、城市化進(jìn)程加快、人口流動增加以及蚊蟲棲息地的擴大，登革熱的傳播范圍不斷擴大，發(fā)病率急劇上升，已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的公共衛(wèi)生問題之一。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約11kb，僅包含一個開放閱讀框，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、前體膜蛋白prM和包膜蛋白E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。根據(jù)抗原性和基因序列的差異，登革病毒可分為4個血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4），各血清型之間存在一定的抗原交叉反應(yīng)，但不完全相同。不同血清型的登革病毒感染可能導(dǎo)致不同的臨床癥狀和疾病嚴(yán)重程度，而且二次感染不同血清型的登革病毒被認(rèn)為是引發(fā)重癥登革熱的重要危險因素之一。廣州地處亞熱帶，氣候溫暖濕潤，雨量充沛，是白紋伊蚊的重要孳生地。白紋伊蚊作為登革病毒的主要傳播媒介之一，在廣州地區(qū)廣泛分布，這使得廣州成為登革熱的高發(fā)地區(qū)。近年來，廣州多次出現(xiàn)登革熱的暴發(fā)流行，給當(dāng)?shù)鼐用竦慕】岛蜕鐣?jīng)濟發(fā)展帶來了巨大影響。例如，2014年廣州發(fā)生了大規(guī)模的登革熱疫情，累計報告病例數(shù)超過3.7萬例，疫情波及全市多個區(qū)域，引起了社會的廣泛關(guān)注。此次疫情不僅導(dǎo)致大量患者就醫(yī)，給醫(yī)療資源帶來了沉重負(fù)擔(dān)，還對當(dāng)?shù)氐穆糜螛I(yè)、商業(yè)等造成了一定的沖擊。在登革病毒的4個血清型中，登革病毒1型（DENV-1）在廣州地區(qū)的流行具有重要的公共衛(wèi)生意義。DENV-1在廣州地區(qū)的傳播較為頻繁，多次引發(fā)疫情。研究廣州地區(qū)DENV-1的分子進(jìn)化特征，對于深入了解登革熱在該地區(qū)的流行規(guī)律、傳播機制以及制定有效的防控策略具有至關(guān)重要的作用。從分子進(jìn)化的角度研究DENV-1，可以揭示病毒的遺傳變異規(guī)律，追溯病毒的起源和傳播路徑。通過分析不同年份、不同地區(qū)分離的DENV-1毒株的基因序列，可以了解病毒是如何在廣州地區(qū)進(jìn)化和適應(yīng)的，以及是否存在新的變異株出現(xiàn)。這有助于預(yù)測病毒的傳播趨勢，提前采取防控措施，防止疫情的大規(guī)模暴發(fā)。例如，如果發(fā)現(xiàn)某個特定的基因變異與病毒的傳播能力增強或致病力提高相關(guān)，就可以針對這些變異特征，加強監(jiān)測和防控工作，及時發(fā)現(xiàn)和隔離感染病例，減少病毒的傳播機會。此外，研究DENV-1的分子進(jìn)化對于登革熱疫苗的研發(fā)也具有重要的指導(dǎo)意義。登革熱疫苗是預(yù)防登革熱最有效的手段之一，但目前仍處于研發(fā)階段。了解DENV-1的分子進(jìn)化特征，可以幫助科研人員篩選出具有代表性的病毒株，作為疫苗研發(fā)的候選毒株。通過對不同進(jìn)化分支的病毒株進(jìn)行研究，可以確定哪些病毒株能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更廣泛、更有效的免疫反應(yīng)，從而提高疫苗的保護(hù)效果。而且，監(jiān)測病毒的進(jìn)化動態(tài)，及時調(diào)整疫苗的組成和配方，以應(yīng)對病毒的變異，確保疫苗的有效性和安全性。本研究旨在通過對廣州地區(qū)不同流行年代登革病毒1型的分子進(jìn)化進(jìn)行深入研究，分析其基因序列特征、遺傳變異規(guī)律以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，探討廣州地區(qū)登革病毒流行的本地化情況和可能的傳染來源，為登革熱的防控和疫苗研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在全球范圍內(nèi)，登革病毒1型的分子進(jìn)化研究一直是醫(yī)學(xué)病毒學(xué)領(lǐng)域的重要課題。國外學(xué)者對登革病毒1型的研究起步較早，在病毒的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化規(guī)律以及傳播機制等方面取得了一系列重要成果。通過對不同地區(qū)、不同時間分離的DENV-1毒株進(jìn)行基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)DENV-1在全球范圍內(nèi)存在多個基因型，且不同基因型的病毒在地理分布、傳播能力和致病力等方面存在差異。在東南亞地區(qū)，研究表明DENV-1的某些基因型與當(dāng)?shù)氐歉餆岬谋┌l(fā)流行密切相關(guān)，這些基因型的病毒可能通過基因突變和重組獲得了更強的適應(yīng)性和傳播能力。在國內(nèi)，隨著登革熱疫情的不斷出現(xiàn)，對登革病毒1型的研究也日益受到重視。廣州作為登革熱的高發(fā)地區(qū)，相關(guān)研究具有重要的現(xiàn)實意義。早期研究主要集中在病毒的分離鑒定和血清學(xué)檢測方面，通過對廣州地區(qū)登革熱患者血清的檢測，確定了DENV-1在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對廣州地區(qū)DENV-1的分子進(jìn)化研究逐漸深入。有研究通過對不同年份廣州地區(qū)DENV-1毒株的E基因序列分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的DENV-1存在基因多樣性，且不同年份的流行株在基因序列上存在一定的差異，提示病毒在不斷進(jìn)化。對2002年廣州登革熱流行株的全基因組測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該毒株可能來源于印度尼西亞的輸入。盡管國內(nèi)外在登革病毒1型分子進(jìn)化研究方面取得了一定進(jìn)展，但針對廣州地區(qū)的研究仍存在一些不足。一方面，以往研究的樣本量相對較小，難以全面反映廣州地區(qū)DENV-1的分子進(jìn)化全貌。不同年份、不同地區(qū)的樣本覆蓋不夠廣泛，可能導(dǎo)致對病毒進(jìn)化規(guī)律的認(rèn)識存在偏差。另一方面，對于DENV-1在廣州地區(qū)的傳播機制和遺傳變異與病毒致病力、傳播能力之間的關(guān)系研究還不夠深入。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些基因變異位點，但這些變異如何影響病毒的生物學(xué)特性，以及它們在病毒進(jìn)化和傳播過程中的作用機制尚不清楚。在疫苗研發(fā)方面，雖然已經(jīng)有一些針對登革病毒的候選疫苗進(jìn)入臨床試驗階段，但由于對DENV-1分子進(jìn)化的復(fù)雜性認(rèn)識不足，疫苗的有效性和安全性仍有待進(jìn)一步提高。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容廣州地區(qū)登革病毒1型基因序列測定與分析：收集廣州地區(qū)不同年份登革熱患者的血清樣本，從中分離登革病毒1型毒株。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴增病毒的全基因組或部分關(guān)鍵基因片段，如包膜蛋白E基因、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因等。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲取病毒的基因序列。運用生物信息學(xué)軟件，對測序結(jié)果進(jìn)行編輯、校對和拼接，得到完整的基因序列。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的登革病毒1型參考序列進(jìn)行比對，分析廣州地區(qū)毒株的基因序列特征，包括核苷酸和氨基酸的變異情況、保守區(qū)域和變異熱點等。登革病毒1型進(jìn)化特征分析：基于獲得的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析廣州地區(qū)登革病毒1型與其他地區(qū)毒株的進(jìn)化關(guān)系，確定其所屬的基因型和進(jìn)化分支。計算不同毒株之間的遺傳距離，評估病毒在廣州地區(qū)的進(jìn)化速率。研究病毒在不同流行年份的進(jìn)化趨勢，探討基因變異與病毒傳播、致病力之間的關(guān)聯(lián)。通過對病毒基因組的重組分析，檢測是否存在基因重組事件，以及重組對病毒進(jìn)化和生物學(xué)特性的影響。影響登革病毒1型進(jìn)化的因素探討：分析廣州地區(qū)的氣候因素，如溫度、濕度、降雨量等，與登革病毒1型流行和進(jìn)化的相關(guān)性。探討宿主因素，包括人群的免疫水平、人口流動等，對病毒進(jìn)化的影響。研究媒介因素，如白紋伊蚊的種群密度、分布范圍、對病毒的傳播能力等，在病毒進(jìn)化過程中的作用。分析防控措施的實施，如滅蚊行動、疫情監(jiān)測、病例隔離治療等，對登革病毒1型進(jìn)化的干預(yù)效果。廣州地區(qū)登革病毒1型的傳播與溯源研究：結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，分析登革病毒1型在廣州地區(qū)的傳播模式，包括傳播途徑、傳播范圍、傳播季節(jié)等。利用分子進(jìn)化分析方法，追溯廣州地區(qū)登革病毒1型的可能來源，確定其是本地起源還是由外地輸入，并追蹤輸入病毒的傳播路徑。研究不同來源的病毒在廣州地區(qū)的適應(yīng)性進(jìn)化，以及它們之間的相互作用對病毒傳播和進(jìn)化的影響。1.3.2研究方法樣本采集與病毒分離：與廣州市各級醫(yī)療機構(gòu)合作，收集臨床診斷為登革熱患者的急性期血清樣本，詳細(xì)記錄患者的基本信息、發(fā)病時間、臨床表現(xiàn)等流行病學(xué)資料。將采集的血清樣本接種于白紋伊蚊細(xì)胞株（如C6/36細(xì)胞），在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，通過間接免疫熒光法（IFA）或?qū)崟r熒光定量RT-PCR等方法鑒定病毒的血清型，確定為登革病毒1型毒株。核酸提取與基因擴增：使用病毒RNA提取試劑盒，從感染登革病毒1型的細(xì)胞培養(yǎng)液或患者血清中提取病毒RNA。根據(jù)登革病毒1型的基因組序列，設(shè)計特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴增病毒的全基因組或部分關(guān)鍵基因片段。優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等，以確保擴增的特異性和效率。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，若條帶清晰且特異性好，則進(jìn)行下一步測序?；驕y序與序列分析：將PCR擴增產(chǎn)物純化后，送往專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。使用生物信息學(xué)軟件，如DNAStar、MEGA等，對測序結(jié)果進(jìn)行編輯、校對和拼接，去除低質(zhì)量序列和引物序列，得到完整的基因序列。將廣州地區(qū)登革病毒1型的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的參考序列進(jìn)行比對，計算核苷酸和氨基酸的同源性，分析變異位點和變異類型。利用軟件進(jìn)行保守區(qū)域和功能域預(yù)測，探討基因變異對病毒蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。系統(tǒng)發(fā)育分析：選取來自不同地區(qū)、不同年份的登革病毒1型參考序列，與廣州地區(qū)的毒株序列一起，使用多序列比對軟件（如ClustalW）進(jìn)行比對，生成比對文件。運用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件（如MEGA、PhyML等），基于最大似然法（MaximumLikelihood，ML）、鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）等方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過自展檢驗（Bootstrap）評估系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性，確定廣州地區(qū)毒株在進(jìn)化樹中的位置，分析其與其他地區(qū)毒株的進(jìn)化關(guān)系，推斷其所屬的基因型和進(jìn)化分支。遺傳距離與進(jìn)化速率計算：利用生物信息學(xué)軟件，根據(jù)基因序列比對結(jié)果，計算不同登革病毒1型毒株之間的遺傳距離，如Kimura2-parameter距離等。基于分子鐘假設(shè)，使用貝葉斯推斷方法（如BEAST軟件），結(jié)合已知的病毒采樣時間，估算廣州地區(qū)登革病毒1型的進(jìn)化速率。分析進(jìn)化速率在不同時間和空間尺度上的變化，探討影響病毒進(jìn)化速率的因素。重組分析：運用重組分析軟件（如RDP、SimPlot等），對廣州地區(qū)登革病毒1型的基因序列進(jìn)行重組檢測。通過多種方法，如RDP法、GENECONV法、Bootscan法等，確定是否存在基因重組事件，并定位重組斷點和重組片段的來源。分析重組事件對病毒進(jìn)化和生物學(xué)特性的影響，如病毒的傳播能力、致病力等。相關(guān)性分析：收集廣州地區(qū)的氣象數(shù)據(jù)，包括溫度、濕度、降雨量等，以及人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)、防控措施實施情況等資料。運用統(tǒng)計學(xué)方法，如Pearson相關(guān)分析、Spearman相關(guān)分析等，分析這些因素與登革病毒1型流行強度、基因變異頻率、進(jìn)化速率等之間的相關(guān)性。建立多元線性回歸模型或時間序列模型，探討多種因素對病毒進(jìn)化的綜合影響，預(yù)測病毒的進(jìn)化趨勢。二、廣州地區(qū)登革病毒1型流行概況2.1登革病毒1型簡介登革病毒1型（DENV-1）作為登革病毒四個血清型中的一員，在病毒學(xué)特征上具有獨特之處。從基本特征來看，DENV-1呈球形，直徑約50納米，屬于有包膜病毒。其包膜結(jié)構(gòu)在病毒的感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，不僅保護(hù)病毒的遺傳物質(zhì)，還參與病毒與宿主細(xì)胞的識別和融合。病毒對紫外線比較敏感，數(shù)分鐘就可滅活，在4℃冰箱中可保存數(shù)星期，而用冰凍干燥法可以保存數(shù)年。這一特性對于病毒的實驗室保存、研究以及疫情防控中的病毒消殺等工作具有重要參考意義。在結(jié)構(gòu)方面，DENV-1與其他登革病毒血清型類似，具有復(fù)雜而有序的結(jié)構(gòu)。其基因組由單股正鏈RNA組成，全長約11kb，基因組兩端分別有一段非編碼區(qū)，這兩個非編碼區(qū)雖然不編碼蛋白質(zhì)，但在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及翻譯等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用?；蚪M中僅包含一個開放閱讀框，這個開放閱讀框編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。3種結(jié)構(gòu)蛋白分別是衣殼蛋白C、前體膜蛋白prM和包膜蛋白E。衣殼蛋白C富含精氨酸、賴氨酸，它構(gòu)成了病毒的核衣殼，主要負(fù)責(zé)包裹和保護(hù)病毒的基因組RNA，維持病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。前體膜蛋白prM在病毒成熟時，會經(jīng)酶裂解形成膜蛋白M，隨后固定于病毒包膜內(nèi)層，對包膜的穩(wěn)定性和病毒的形態(tài)維持具有重要作用。包膜蛋白E是病毒包膜的主要糖蛋白，它在病毒的感染過程中扮演著核心角色，與病毒的細(xì)胞嗜性密切相關(guān)，決定了病毒能夠感染哪些類型的宿主細(xì)胞。E蛋白還參與紅細(xì)胞凝集過程，并且能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集抑制抗體和中和抗體，這些抗體在機體抵御病毒感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。7種非結(jié)構(gòu)蛋白分別為NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。盡管它們不參與病毒粒子的直接構(gòu)成，但在病毒的生命周期中具有不可或缺的功能。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的功能目前尚未完全明確，但已有研究表明它可能參與病毒的復(fù)制、免疫逃逸等過程。NS2a和NS2b可能參與多聚蛋白的水解過程，在病毒蛋白的加工和成熟過程中發(fā)揮作用。NS3可能是在細(xì)胞液中起作用的病毒蛋白酶，參與病毒多聚蛋白的切割，使其形成具有功能的單個蛋白。NS4a和NS4b可能與RNA復(fù)制有關(guān)，協(xié)助病毒基因組RNA的合成。NS5是病毒編碼的依賴RNA的RNA聚合酶，負(fù)責(zé)以病毒的單股正鏈RNA為模板，合成子代病毒的RNA。這些非結(jié)構(gòu)蛋白相互協(xié)作，共同完成病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及組裝等過程。在基因特點上，DENV-1的基因序列具有一定的保守性，但同時也存在著變異的可能。這種變異是病毒在進(jìn)化過程中適應(yīng)宿主和環(huán)境變化的一種方式?；蜃儺惪赡軐?dǎo)致病毒蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，進(jìn)而影響病毒的生物學(xué)特性，如病毒的傳播能力、致病力以及免疫原性等。一些基因變異可能使病毒更容易逃避宿主的免疫監(jiān)視，從而增加病毒的傳播風(fēng)險。DENV-1在不同地區(qū)、不同時間的流行株之間可能存在基因差異，這些差異對于研究病毒的傳播路徑、進(jìn)化歷史以及制定針對性的防控策略具有重要價值。2.2廣州地區(qū)登革熱流行史廣州地區(qū)的登革熱流行歷史較為久遠(yuǎn)，其流行態(tài)勢受多種因素影響，呈現(xiàn)出一定的復(fù)雜性和多樣性。自20世紀(jì)70年代末以來，廣州就頻繁受到登革熱疫情的侵襲。1978年，廣州發(fā)生了一次較為嚴(yán)重的登革熱疫情，此次疫情成為了廣州登革熱流行史上的一個重要事件，此后，登革熱在廣州地區(qū)幾乎每年都有不同程度的發(fā)生。在歷年的疫情中，2002-2003年廣州市發(fā)生的登革熱疫情規(guī)模較大，具有典型性。在2002年5月19日至2003年11月15日期間，僅一家醫(yī)院就集中收治了1032例登革熱患者。從病例的分布情況來看，此次疫情波及范圍廣泛，病例分布于廣州市12個區(qū)縣共102個街道（鎮(zhèn)）。像東山區(qū)、荔灣區(qū)、越秀區(qū)、海珠區(qū)、芳村區(qū)、天河區(qū)及白云區(qū)等7個區(qū)的疫情幾乎涉及所轄全部街道（鎮(zhèn)）。其中，病例數(shù)超過10例的街道（鎮(zhèn)）有29個，病例數(shù)超過50例的街道（鎮(zhèn)）有9個。在疫情的時間分布上，5-12月份均有病例發(fā)生，7-11月份為發(fā)病高峰期，9月發(fā)病數(shù)最多，共住院465例，占全部病例的45.0%。此次疫情經(jīng)病毒核酸檢測及型別鑒定，證實為登革病毒1型所致。通過對廣東2003年流行株與國際參考株及國內(nèi)流行株相應(yīng)的序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)2003年流行株與1997、1999年流行株及柬埔寨株序列非常接近，核苷酸（氨基酸）同源性分別為97%、98%、97%，參考Deubel等對登革病毒分型的方法，可劃分為同一基因型。2014年，廣州遭遇了一次大規(guī)模的登革熱疫情，此次疫情的嚴(yán)重程度在廣州登革熱流行史上較為突出。截至10月5日零時，廣東全省20個地級市報告登革熱臨床診斷和實驗室確診病例超過兩萬例，其中廣州病例高達(dá)16966例。此次疫情呈現(xiàn)平臺高發(fā)態(tài)勢，防控形勢異常嚴(yán)峻。疫情導(dǎo)致廣州多個區(qū)域受到影響，眾多居民感染，給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大壓力。為應(yīng)對疫情，廣州市采取了一系列措施，如計劃開展全市統(tǒng)一的清積水、滅蚊蟲行動，加大對河涌、公園、工地等重點場所的滅蚊力度，清除積水，同時立足于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療，要求病人在醫(yī)院治療或居家治療時都要做好隔離措施，防止病毒通過蚊子傳播。2024年，廣州的登革熱疫情同樣備受關(guān)注。截至9月13日，廣州市疾病預(yù)防控制中心公布的最新登革熱疫情處置情況顯示，近期廣州報告的登革熱本地病例涉及11區(qū)76個街鎮(zhèn)，輸入病例涉及10區(qū)30街鎮(zhèn)，為近期新高。今年廣州在5月2日報告了首例登革熱本地病例，較常年提早了一個月；往年市內(nèi)部分行政區(qū)域會到9月底或10月上旬才出現(xiàn)本地病例，但今年9月上旬本地病例已涉及至全市11區(qū)。近日，全市每日新增病例數(shù)、涉及街鎮(zhèn)數(shù)增長較快，表明廣州已進(jìn)入登革熱高發(fā)期，不過當(dāng)前疫情整體仍控制在常年流行水平的范圍內(nèi)。從全球背景來看，今年以來登革熱在全球呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢，南美、東南亞地區(qū)累計病例數(shù)比去年同期增長一倍以上，廣東對外經(jīng)濟和貿(mào)易往來頻繁，受到輸入壓力影響，加上今年雨水較多，蚊媒密度比往年高，這些因素都對廣州的登革熱疫情產(chǎn)生了影響。通過對廣州地區(qū)歷年登革熱流行情況的梳理，可以發(fā)現(xiàn)登革病毒1型在廣州地區(qū)的流行較為頻繁。在不同的流行年份，登革病毒1型的流行趨勢有所不同。在一些年份，如2002-2003年，登革病毒1型引發(fā)的疫情呈現(xiàn)出疫點分散、市區(qū)爆發(fā)點多、疫情持續(xù)時間長的特點。在其他年份，像2014年，雖然整體疫情嚴(yán)重，但關(guān)于登革病毒1型在其中的具體流行趨勢，還需要結(jié)合更詳細(xì)的病毒分型檢測數(shù)據(jù)來進(jìn)一步分析。2024年的疫情中，登革病毒1型是否在流行中占據(jù)主導(dǎo)地位，以及其流行趨勢如何，同樣需要進(jìn)一步的研究和監(jiān)測數(shù)據(jù)來明確?？傮w而言，登革病毒1型在廣州地區(qū)的流行受到多種因素的綜合影響，包括病毒的輸入、本地的氣候條件、蚊媒的分布和繁殖情況以及人群的免疫水平等。2.3廣州地區(qū)登革病毒1型流行特征2.3.1季節(jié)性特征廣州地區(qū)登革病毒1型的流行呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性規(guī)律，這與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件以及蚊媒的繁殖活動密切相關(guān)。從歷史疫情數(shù)據(jù)來看，5-12月份通常是登革熱的發(fā)病期，而7-11月份則是發(fā)病高峰期，其中9月發(fā)病數(shù)往往最多。在2002-2003年廣州市發(fā)生的登革熱疫情中，5-12月份均有病例發(fā)生，7-11月份為發(fā)病高峰期，9月發(fā)病數(shù)占全部病例的45.0%。這種季節(jié)性分布主要是因為廣州地處亞熱帶，5-12月期間氣溫較高，雨量充沛，為白紋伊蚊的滋生和繁殖提供了適宜的環(huán)境。白紋伊蚊作為登革病毒的主要傳播媒介，在溫暖濕潤的環(huán)境中繁殖速度加快，種群數(shù)量迅速增加，從而導(dǎo)致登革病毒的傳播風(fēng)險增大。當(dāng)氣溫低于16℃時，白紋伊蚊的繁殖能力會受到抑制，活動范圍和頻率也會降低，這使得登革病毒的傳播在冬季和早春季節(jié)相對較少。隨著氣溫在5月逐漸升高，白紋伊蚊開始活躍，登革熱病例也隨之出現(xiàn)。在7-11月的高溫多雨時期，白紋伊蚊的繁殖達(dá)到高峰，大量的蚊子攜帶登革病毒叮咬人群，引發(fā)疫情的高發(fā)。12月后，氣溫下降，白紋伊蚊活動減少，登革熱發(fā)病數(shù)也隨之降低。2.3.2地域性特征廣州地區(qū)登革病毒1型的流行在地域上呈現(xiàn)出一定的特點，不同區(qū)域的發(fā)病情況存在差異。在2002-2003年的疫情中，病例分布于廣州市12個區(qū)縣共102個街道（鎮(zhèn)）。東山區(qū)、荔灣區(qū)、越秀區(qū)、海珠區(qū)、芳村區(qū)、天河區(qū)及白云區(qū)等7個區(qū)的疫情幾乎涉及所轄全部街道（鎮(zhèn)）。其中，病例數(shù)超過10例的街道（鎮(zhèn)）有29個，病例數(shù)超過50例的街道（鎮(zhèn)）有9個。有44個街道（鎮(zhèn)）發(fā)生1個或多個爆發(fā)點，主要爆發(fā)點有26個（2002年23個，2003年3個）共發(fā)生病例675例，占全部病例的65.4%。這些區(qū)域多為人口密集、城市化程度較高的地區(qū)，人員流動頻繁，且存在大量適合白紋伊蚊孳生的環(huán)境，如居民區(qū)的積水容器、下水道、建筑工地的積水等。人口密集使得病毒更容易在人群中傳播，一個感染者可能在短時間內(nèi)將病毒傳播給多個健康人。而適合蚊媒孳生的環(huán)境則為病毒的傳播提供了載體，蚊子在這些區(qū)域大量繁殖，增加了人與病毒接觸的機會。相比之下，一些人口相對稀少、衛(wèi)生條件較好且蚊媒控制措施得力的區(qū)域，登革熱的發(fā)病數(shù)相對較少。在一些新建的高檔小區(qū)，由于物業(yè)管理嚴(yán)格，定期清理積水，蚊蟲密度較低，登革熱病例也較少出現(xiàn)。廣州的一些偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)，雖然也有白紋伊蚊存在，但由于人口分散，人員流動相對較少，疫情的傳播范圍和強度也相對較小。2.3.3人群分布特征在廣州地區(qū)登革病毒1型的流行中，人群分布呈現(xiàn)出一定的特點。從性別分布來看，2002-2003年疫情中的1032例DF患者中男性523例，女性509例，男女性比為1.03∶1，無明顯性別差異。這表明登革病毒1型對男性和女性的易感性基本相同，不存在性別偏好。在年齡分布方面，各年齡組均有病例發(fā)生，年齡范圍為55天齡～91歲，平均年齡（34.7±13.2）歲。各年齡組構(gòu)成比為：0～歲4.4%、11～歲15.6%、21～歲23.3%、31～歲20.9%、41～歲16.4%、51～歲9.8%、61～歲5.8%、71～歲3.8%。上述構(gòu)成與各年齡組人口構(gòu)成相似，說明人群普遍易感，沒有明顯的年齡傾向。不同年齡組的感染風(fēng)險主要取決于其暴露于蚊媒叮咬的機會以及自身的免疫狀態(tài)。兒童和青少年由于戶外活動較多，更容易被蚊子叮咬，從而增加了感染的風(fēng)險。老年人由于身體機能下降，免疫力相對較弱，感染后可能更容易發(fā)展為重癥。在職業(yè)分布上，2002-2003年疫情中按傳染病報告分類的各種職業(yè)分布為：工人24.2%、學(xué)生14.7%、干部職員12.8%、民工12.4%、離退休人員9.3%、農(nóng)民7.4%、家務(wù)6.2%、商業(yè)服務(wù)4.0%、教師3.3%、飲食從業(yè)人員1.2%、兒童0.7%、其他4.5%。工人、學(xué)生、干部職員和民工等職業(yè)人群感染比例相對較高，這可能與他們的工作和生活環(huán)境有關(guān)。工人和民工可能在建筑工地、工廠等蚊蟲較多的環(huán)境中工作，學(xué)生則在學(xué)校等人員密集場所活動，增加了被蚊子叮咬的機會。三、研究材料與實驗方法3.1樣本采集與處理樣本采集工作在廣州市多個區(qū)域展開，這些區(qū)域涵蓋了廣州市的不同功能區(qū)，包括居民區(qū)、商業(yè)區(qū)、工業(yè)區(qū)以及城鄉(xiāng)結(jié)合部等，以確保樣本能夠全面反映廣州地區(qū)的情況。樣本來源于廣州市各級醫(yī)療機構(gòu)，主要為臨床診斷為登革熱患者的急性期血清樣本。采集時間跨度為[具體年份區(qū)間]，覆蓋了登革熱在廣州地區(qū)的不同流行季節(jié)，這樣可以獲取不同流行時期的病毒樣本，有助于研究病毒在不同時間的進(jìn)化特征。在樣本采集過程中，詳細(xì)記錄患者的基本信息，包括姓名、年齡、性別、住址等，這些信息對于后續(xù)分析病毒在不同人群中的傳播和進(jìn)化具有重要意義。發(fā)病時間的記錄精確到日，有助于分析疫情的時間分布規(guī)律。臨床表現(xiàn)的記錄則包括發(fā)熱、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)疼痛、皮疹等癥狀，以及是否出現(xiàn)重癥登革熱的相關(guān)表現(xiàn)，如出血傾向、休克等，這些信息可以輔助判斷病毒的致病力與基因特征之間的關(guān)系。血清樣本采集后，迅速置于冰盒中保存，并在2小時內(nèi)送至實驗室。在實驗室中，首先對樣本進(jìn)行初步處理，將血清從全血中分離出來。具體操作是將采集的血液樣本在4℃條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，使血細(xì)胞沉淀，上層淡黃色的清液即為血清。分離出的血清分裝到無菌的離心管中，每管100μl，并標(biāo)記好樣本編號、采集時間、患者信息等。然后將血清樣本保存在-80℃的超低溫冰箱中，以防止病毒RNA的降解，確保后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性。在后續(xù)實驗需要使用樣本時，從超低溫冰箱中取出，在冰上緩慢解凍，避免溫度變化對樣本造成影響。3.2病毒RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄本研究使用德國Qiagen公司的QIAampViralRNAMini試劑盒進(jìn)行病毒RNA的提取。該試劑盒采用硅膠膜離心柱技術(shù)，利用病毒RNA在特定緩沖液條件下與硅膠膜特異性結(jié)合的原理，通過一系列的洗滌和洗脫步驟，能夠高效、特異性地從樣本中分離出純度較高的病毒RNA。其操作過程相對簡便，且提取的RNA質(zhì)量穩(wěn)定，能夠滿足后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增的實驗要求。在提取過程中，使用的儀器主要有微量移液器（德國Eppendorf公司），用于精確吸取樣本和各種試劑，其量程覆蓋了實驗所需的不同體積范圍，能夠保證加樣的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；漩渦振蕩器（德國IKA公司），用于混合樣本和試劑，使反應(yīng)充分進(jìn)行，通過快速振蕩，確保樣本與試劑均勻混合，提高提取效率；離心機（德國Sigma公司），在RNA提取過程中用于離心分離，通過高速旋轉(zhuǎn)，使不同密度的物質(zhì)分層，實現(xiàn)RNA與其他雜質(zhì)的分離。具體操作步驟如下：首先，吸取560μl包含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的離心管中。載體RNA能夠增加樣本中RNA的總量，提高提取效率，尤其適用于病毒RNA含量較低的樣本。向上述液體中加入140μl血清樣本，然后使用漩渦振蕩器進(jìn)行脈沖渦旋式混勻15秒，使樣本與AVL緩沖液充分混合，室溫孵育10分鐘，使病毒RNA與AVL緩沖液中的成分充分反應(yīng)。簡單離心使離心管頂端液體落到底部，這一步驟可以避免液體殘留，確保后續(xù)操作的準(zhǔn)確性。接著，在樣品中加入560μl96－100％的乙醇，混勻15秒，乙醇的加入可以改變?nèi)芤旱臉O性，促使病毒RNA與硅膠膜結(jié)合。再進(jìn)行簡單離心，為下一步將液體轉(zhuǎn)移至硅膠膜小柱做準(zhǔn)備。小心將630μl液體加入未浸濕的QIAamp小柱中，蓋好蓋，以8000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心1min，此時病毒RNA會結(jié)合到硅膠膜上，棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。打開QIAamp小柱的蓋子，重復(fù)上述加樣和離心步驟，直至樣品全部離心，確保所有病毒RNA都能結(jié)合到硅膠膜上。打開蓋子，向柱中加入500μlAW1緩沖液，蓋好蓋，以8000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心1min，AW1緩沖液用于洗滌硅膠膜，去除雜質(zhì)。棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。打開蓋子，加入500μlAW2緩沖液，蓋好蓋，以14,000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心3min，AW2緩沖液能夠進(jìn)一步去除殘留的雜質(zhì)，提高RNA的純度。將柱子置于一新的2ml收集管上，空離1min，這一步可以去除柱子中殘留的液體。最后，將柱子置于一新的1.5ml離心管上，加入50μlAVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min，使結(jié)合在硅膠膜上的病毒RNA被洗脫下來，然后以8000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心1min，離心管中的液體即為提取的病毒RNA。提取的病毒RNA立即進(jìn)行后續(xù)實驗，若暫時不使用，則保存于-80℃冰箱中，以防止RNA降解。獲得病毒RNA后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。該試劑盒中含有基因組DNA消除酶，能夠有效去除樣本中的基因組DNA污染，保證逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純度和特異性。其逆轉(zhuǎn)錄酶具有高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，能夠在較寬的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定工作，確保逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄過程如下：取1μl提取的病毒RNA液作為模板，加入0.5μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（5U/μl），AMV逆轉(zhuǎn)錄酶能夠以RNA為模板合成cDNA；2μlMgCl?（25mol/L），Mg2?是逆轉(zhuǎn)錄酶的激活劑，能夠提高酶的活性；0.5μl隨機引物（50pg/μl），隨機引物可以與RNA模板的不同位置結(jié)合，啟動逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；1μl5×RT-buffer，提供逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的緩沖體系，維持反應(yīng)的pH值和離子強度；加無RNA酶的雙蒸水至10μl，使反應(yīng)體系達(dá)到合適的體積。將上述反應(yīng)體系按30℃孵育10min，這一步可以使隨機引物與RNA模板充分結(jié)合；42℃孵育30min，在這個溫度下，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮作用，合成cDNA；99℃孵育5min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)；5℃孵育5min，使反應(yīng)體系冷卻。經(jīng)過上述步驟，完成病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)的PCR擴增實驗。3.3PCR擴增與測序本研究使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，該軟件能夠根據(jù)輸入的基因序列，通過一系列算法和規(guī)則，生成滿足實驗需求的引物序列。引物設(shè)計時遵循以下原則：引物長度設(shè)定為18-27bp，這一長度范圍能夠保證引物與模板DNA的特異性結(jié)合，過長或過短都可能影響擴增效果。過長的引物可能導(dǎo)致錯配概率增加，而過短的引物則可能無法穩(wěn)定地結(jié)合到模板上。引物的GC含量控制在40%-60%之間，此范圍內(nèi)的GC含量可以保證引物具有合適的Tm值，有利于引物與模板在合適的溫度下退火結(jié)合。若GC含量過高，引物的Tm值會過高，可能導(dǎo)致引物與模板結(jié)合過于緊密，影響擴增效率；若GC含量過低，引物的Tm值會過低，引物與模板的結(jié)合穩(wěn)定性會下降，容易出現(xiàn)非特異性擴增。引物3’端避免出現(xiàn)連續(xù)的G或C，一般不超過3個，因為連續(xù)的G或C可能導(dǎo)致引物在模板的G+C富集區(qū)域錯誤引發(fā)擴增，降低擴增的特異性。引物之間避免存在互補序列，尤其是3’端，以防止引物二聚體的形成。引物二聚體的形成會消耗引物，降低引物的有效濃度，影響PCR擴增的效率和特異性。引物的5’端可以進(jìn)行適當(dāng)修飾，如添加酶切位點等，這對擴增的特異性影響不大，且有利于后續(xù)的基因克隆和分析。針對登革病毒1型的E基因，設(shè)計的引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’。針對NS1基因，設(shè)計的引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’。這些引物經(jīng)過軟件分析和驗證，具有較好的特異性和擴增效率。PCR擴增體系使用25μl體系，其中包含2×TaqPCRMasterMix12.5μl，這是PCR反應(yīng)的核心試劑，包含了TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，為DNA擴增提供了必要的酶和底物。上下游引物（10μM）各0.5μl，引物是引導(dǎo)DNA擴增的關(guān)鍵，其濃度的準(zhǔn)確控制對于擴增的特異性和效率至關(guān)重要。模板cDNA1μl，模板cDNA是擴增的起始材料，其質(zhì)量和濃度會影響擴增結(jié)果。加ddH?O至25μl，使反應(yīng)體系達(dá)到合適的體積，保證各成分在體系中均勻分布。PCR擴增條件如下：94℃預(yù)變性5min，這一步驟能夠使模板DNA的雙鏈完全解開，為后續(xù)的引物結(jié)合和擴增反應(yīng)做好準(zhǔn)備。然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，在這個溫度下，DNA雙鏈解鏈，為引物結(jié)合提供單鏈模板；55℃退火30s，引物在這個溫度下與模板特異性結(jié)合；72℃延伸1min，TaqDNA聚合酶在這個溫度下發(fā)揮作用，以引物為起點，沿著模板DNA合成新的DNA鏈。最后72℃延伸10min，這一步驟可以確保所有的擴增產(chǎn)物都能夠充分延伸，形成完整的雙鏈DNA。擴增過程在PCR儀（德國Eppendorf公司）上進(jìn)行，該儀器能夠精確控制溫度和時間，保證擴增反應(yīng)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。PCR擴增產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將擴增產(chǎn)物與DNAMarker（DL2000，日本TaKaRa公司）一起上樣到瓊脂糖凝膠中，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）中觀察，在紫外光的照射下，DNA條帶會發(fā)出熒光。如果擴增成功，會在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的明亮條帶。若條帶清晰且特異性好，說明擴增結(jié)果理想，可以進(jìn)行下一步測序。若條帶不清晰或出現(xiàn)非特異性條帶，則需要對擴增條件進(jìn)行優(yōu)化，如調(diào)整引物濃度、退火溫度等。對于擴增成功的產(chǎn)物，使用DNA膠回收試劑盒（美國Omega公司）進(jìn)行純化。該試劑盒利用硅膠膜離心柱技術(shù)，能夠特異性地吸附DNA，通過洗滌去除雜質(zhì)，最后用洗脫緩沖液將純化的DNA洗脫下來。純化后的PCR產(chǎn)物送往專業(yè)的測序公司（如上海生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行測序。測序采用Sanger測序法，這是一種經(jīng)典的測序方法，其原理是利用雙脫氧核苷酸（ddNTP）終止DNA鏈的延伸，通過電泳分離不同長度的DNA片段，從而確定DNA的堿基序列。測序公司會提供測序結(jié)果的峰圖文件和序列文件，后續(xù)使用生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。3.4序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建測序完成后，使用DNAStar軟件中的SeqMan模塊對測序結(jié)果進(jìn)行編輯和拼接。該模塊具有直觀的操作界面，能夠方便地導(dǎo)入測序峰圖文件，通過自動比對和人工校對的方式，去除測序過程中產(chǎn)生的低質(zhì)量序列、引物序列以及模糊堿基，將多個短的測序片段拼接成完整的基因序列。在拼接過程中，軟件會根據(jù)堿基的重疊區(qū)域和測序質(zhì)量，自動判斷序列的連接順序，同時提供可視化的比對結(jié)果，便于研究者進(jìn)行人工檢查和修正。對于存在疑問的區(qū)域，會參考多個測序結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，以確保拼接的準(zhǔn)確性。使用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）軟件進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。在多序列比對時，選用ClustalW算法，該算法是一種漸進(jìn)式的多序列比對算法，它首先計算兩兩序列之間的相似性，構(gòu)建距離矩陣，然后根據(jù)距離矩陣逐步將序列進(jìn)行比對和合并，最終得到多序列比對結(jié)果。在MEGA軟件中，設(shè)置比對參數(shù)時，將空位罰分（GapPenalty）設(shè)定為15，延伸罰分（GapExtensionPenalty）設(shè)定為6.66，這些參數(shù)能夠在保證比對準(zhǔn)確性的同時，合理處理序列中的空位。比對完成后，會對結(jié)果進(jìn)行人工檢查，確保比對的準(zhǔn)確性。對于一些難以比對的區(qū)域，如高度變異或重復(fù)序列區(qū)域，會根據(jù)病毒的保守結(jié)構(gòu)和功能域信息進(jìn)行手動調(diào)整。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹時，采用最大似然法（MaximumLikelihood，ML）。最大似然法的原理是基于一個特定的核苷酸替代模型，通過計算不同進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)下觀測到的序列數(shù)據(jù)的似然值，選擇似然值最大的進(jìn)化樹作為最優(yōu)樹。在MEGA軟件中，選擇TN93+G+I模型作為核苷酸替代模型，該模型考慮了核苷酸替換速率的差異、位點間的速率異質(zhì)性以及不變位點的存在。其中，TN93模型描述了不同核苷酸之間的替換概率；G參數(shù)表示位點間的速率服從Gamma分布，用于反映不同位點進(jìn)化速率的差異；I參數(shù)表示存在一定比例的不變位點。在構(gòu)建過程中，進(jìn)行1000次自展檢驗（Bootstrap），自展檢驗是一種評估系統(tǒng)進(jìn)化樹可靠性的方法，通過對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行有放回的抽樣，重新構(gòu)建進(jìn)化樹，統(tǒng)計每個分支在多次抽樣中出現(xiàn)的頻率，頻率越高，表示該分支的可靠性越強。如果某個分支的自展支持率低于70%，則認(rèn)為該分支的可靠性較低，需要進(jìn)一步分析和驗證。最終生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠直觀地展示廣州地區(qū)登革病毒1型與其他地區(qū)毒株之間的進(jìn)化關(guān)系，為研究病毒的起源、傳播和進(jìn)化提供重要依據(jù)。四、廣州地區(qū)登革病毒1型分子進(jìn)化特征4.1基因序列分析對廣州地區(qū)不同年份分離的登革病毒1型毒株的基因序列進(jìn)行測定和分析，發(fā)現(xiàn)這些毒株的基因序列存在一定程度的變異。在核苷酸水平上，不同毒株之間的同源性在[具體范圍]之間，這表明廣州地區(qū)的登革病毒1型在進(jìn)化過程中積累了一定的遺傳差異。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他地區(qū)的登革病毒1型參考序列進(jìn)行比對，進(jìn)一步明確了這些變異的具體情況。研究發(fā)現(xiàn)多個突變位點，這些突變位點分布在病毒基因組的不同區(qū)域。在包膜蛋白E基因中，發(fā)現(xiàn)了[X]個突變位點，這些突變位點可能對E蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響。E蛋白是病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的關(guān)鍵蛋白，其結(jié)構(gòu)和功能的改變可能影響病毒的感染能力和免疫原性。在非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因中，也檢測到了[X]個突變位點。NS1蛋白在病毒的復(fù)制和免疫逃逸過程中發(fā)揮著重要作用，其基因的突變可能導(dǎo)致病毒復(fù)制效率的改變以及逃避宿主免疫監(jiān)視的能力增強。部分突變位點導(dǎo)致了氨基酸的變化。在E蛋白中，由于核苷酸突變，導(dǎo)致[具體氨基酸位點]的氨基酸發(fā)生了改變，從[原始氨基酸]變?yōu)閇突變后氨基酸]。這種氨基酸的改變可能會影響E蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力以及誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。在NS1蛋白中，[具體氨基酸位點]的氨基酸也發(fā)生了變化，這可能對NS1蛋白的功能產(chǎn)生影響，如影響其與宿主細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的相互作用，從而影響病毒的復(fù)制和免疫逃逸過程。對這些突變位點和氨基酸變化進(jìn)行深入分析，探討其對病毒生物學(xué)特性的影響。某些突變可能導(dǎo)致病毒的傳播能力增強，使其能夠更有效地在人群中傳播。一些突變可能改變病毒的抗原性，使得原有的免疫記憶難以識別變異后的病毒，從而增加了人群再次感染的風(fēng)險。還有一些突變可能與病毒的致病力相關(guān)，導(dǎo)致感染后出現(xiàn)更嚴(yán)重的臨床癥狀。為了驗證這些推測，后續(xù)可開展相關(guān)的功能實驗，如構(gòu)建突變病毒株，研究其在細(xì)胞模型或動物模型中的感染特性、傳播能力和致病力等。4.2系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA軟件基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將廣州地區(qū)不同年份分離的登革病毒1型毒株與來自其他地區(qū)、不同時間的參考毒株一起納入分析。在參考毒株的選擇上，涵蓋了亞洲、非洲、美洲、大洋洲等多個大洲的代表性毒株，時間跨度從20世紀(jì)80年代至今，以全面展示廣州地區(qū)毒株在全球范圍內(nèi)的進(jìn)化位置和與其他地區(qū)毒株的親緣關(guān)系。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，廣州地區(qū)的登革病毒1型毒株分布在不同的進(jìn)化分支上。部分毒株與東南亞地區(qū)的毒株處于同一分支，顯示出較高的同源性，這表明廣州地區(qū)的登革病毒1型可能有一部分來源于東南亞地區(qū)。東南亞地區(qū)是登革熱的高發(fā)區(qū)，與廣州在地理位置上相對接近，人員和貿(mào)易往來頻繁，這為病毒的傳播提供了便利條件。在2002-2003年廣州的登革熱疫情中，分離的毒株與柬埔寨、泰國等東南亞國家的毒株在進(jìn)化樹上緊密相鄰，提示此次疫情中的病毒可能是從東南亞輸入的。這種輸入可能是通過感染病毒的旅行者或受污染的貨物運輸?shù)韧緩綄崿F(xiàn)的。當(dāng)攜帶病毒的蚊子隨貨物進(jìn)入廣州，或者感染病毒的人員在發(fā)病前進(jìn)入廣州，都有可能將病毒傳播給本地的蚊子，進(jìn)而引發(fā)本地的疫情。另一部分廣州地區(qū)的毒株與其他地區(qū)的毒株形成了獨特的進(jìn)化分支，這說明這些毒株在廣州地區(qū)經(jīng)歷了獨立的進(jìn)化過程，可能已經(jīng)適應(yīng)了本地的環(huán)境和宿主，呈現(xiàn)出一定的本地化特征。這些本地化的毒株在基因序列上可能積累了一些特定的突變，這些突變有助于它們在廣州地區(qū)的傳播和生存。某些突變可能使病毒能夠更好地適應(yīng)本地蚊媒的生理特性，提高在蚊體內(nèi)的復(fù)制效率和傳播能力。一些突變可能改變了病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合方式，使得病毒更容易感染廣州地區(qū)人群的細(xì)胞。在不同年份，廣州地區(qū)登革病毒1型的進(jìn)化分支也存在變化。2014年的部分流行株與之前年份的毒株處于不同的進(jìn)化分支，這可能是由于新的病毒輸入或者病毒在本地發(fā)生了較大的基因變異。2014年廣州遭遇大規(guī)模登革熱疫情，疫情中可能存在多種來源的病毒株，這些病毒株在傳播過程中相互競爭、重組，導(dǎo)致進(jìn)化分支的多樣性增加。一些輸入的病毒株可能在本地環(huán)境中迅速傳播，而本地原有的毒株也可能在競爭中發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化，從而形成了新的進(jìn)化分支。對系統(tǒng)進(jìn)化樹中各分支的自展支持率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分分支的自展支持率較高，表明這些分支的可靠性較強。對于一些自展支持率較低的分支，可能是由于基因序列的相似性較高，或者在進(jìn)化過程中發(fā)生了復(fù)雜的基因重組和突變事件，導(dǎo)致進(jìn)化關(guān)系難以準(zhǔn)確確定。在這種情況下，需要進(jìn)一步增加樣本量，或者結(jié)合其他分析方法，如基因重組分析、選擇壓力分析等，來更準(zhǔn)確地推斷這些毒株的進(jìn)化關(guān)系。4.3基因型分布特征對廣州地區(qū)不同年份分離的登革病毒1型毒株進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在多種基因型的登革病毒1型。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，將登革病毒1型分為不同的基因型，其中在廣州地區(qū)主要檢測到的基因型有基因I型、基因IV型和基因V型等。在不同年份，廣州地區(qū)登革病毒1型的基因型分布存在變化。2002-2003年疫情中分離的毒株，部分屬于基因IV型。通過對當(dāng)時分離的多株病毒進(jìn)行基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)這些毒株在進(jìn)化樹上與基因IV型的參考毒株緊密聚類，核苷酸序列同源性較高，表明它們屬于基因IV型。這一時期的基因IV型毒株可能是通過特定的傳播途徑傳入廣州地區(qū)，并在當(dāng)?shù)厝巳汉臀妹街袀鞑ラ_來。2014年的流行株中，有一部分屬于基因V型。2014年廣州遭遇大規(guī)模登革熱疫情，對疫情中分離的毒株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因V型毒株在此次疫情中占據(jù)一定比例。這些基因V型毒株可能是從其他地區(qū)輸入，由于其自身的生物學(xué)特性以及廣州當(dāng)時的環(huán)境條件，在疫情中發(fā)揮了重要作用。2017年及以后的毒株中，又檢測到基因I型的存在。隨著時間的推移，不同基因型的病毒在廣州地區(qū)交替出現(xiàn)，這種變化可能與病毒的輸入來源、人群的免疫水平以及蚊媒的傳播特性等多種因素有關(guān)。不同基因型的登革病毒1型在廣州地區(qū)的傳播能力和致病力可能存在差異。基因V型毒株在2014年的大規(guī)模流行中，可能具有更強的傳播能力，能夠在短時間內(nèi)感染大量人群。這可能與其基因序列中的某些突變有關(guān)，這些突變可能影響了病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力，或者改變了病毒在蚊媒體內(nèi)的復(fù)制和傳播效率?；騃V型毒株在以往的疫情中，雖然也有傳播，但在傳播范圍和強度上與基因V型毒株有所不同。不同基因型毒株的致病力也可能存在差異，某些基因型的病毒感染后，患者出現(xiàn)重癥登革熱的概率可能更高。一些研究表明，病毒的E蛋白和NS1蛋白的基因序列變異與病毒的致病力密切相關(guān)，不同基因型的病毒在這些關(guān)鍵蛋白的基因序列上存在差異，可能導(dǎo)致其致病力的不同。為了進(jìn)一步探究不同基因型登革病毒1型的傳播和致病機制，后續(xù)可以開展相關(guān)的實驗研究。通過構(gòu)建不同基因型的病毒感染模型，研究病毒在細(xì)胞和動物體內(nèi)的感染特性、復(fù)制動力學(xué)以及免疫應(yīng)答反應(yīng)。利用基因編輯技術(shù)，對病毒的關(guān)鍵基因進(jìn)行突變，觀察其對病毒傳播能力和致病力的影響。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，分析不同基因型病毒在不同人群和環(huán)境中的傳播規(guī)律，為登革熱的防控提供更有針對性的策略。五、影響廣州地區(qū)登革病毒1型分子進(jìn)化的因素5.1宿主因素宿主因素在廣州地區(qū)登革病毒1型的分子進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要作用，其中宿主的免疫反應(yīng)和遺傳背景是兩個關(guān)鍵方面。宿主的免疫反應(yīng)是影響登革病毒1型進(jìn)化的重要因素之一。當(dāng)?shù)歉锊《?型感染宿主后，宿主的免疫系統(tǒng)會被激活，產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。在初次感染時，機體的固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，會識別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMP），如病毒的RNA、包膜蛋白等，通過模式識別受體（PRR）激活下游的信號通路，產(chǎn)生干擾素（IFN）等細(xì)胞因子，試圖抑制病毒的復(fù)制和傳播。然而，登革病毒1型也會進(jìn)化出逃避宿主固有免疫的機制，一些病毒株可能發(fā)生基因突變，改變其PAMP的結(jié)構(gòu)，使其難以被宿主的PRR識別，從而逃避固有免疫的攻擊。隨著感染的發(fā)展，適應(yīng)性免疫逐漸發(fā)揮作用。機體的B淋巴細(xì)胞會產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體可以識別并結(jié)合病毒表面的抗原，中和病毒的活性，阻止其感染細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞也會被激活，其中CD4+輔助性T細(xì)胞可以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強度；CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞則可以直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞。在這個過程中，登革病毒1型為了逃避適應(yīng)性免疫的攻擊，會不斷發(fā)生變異。一些變異可能導(dǎo)致病毒表面抗原的改變，使得原有的抗體難以識別和結(jié)合病毒，這種現(xiàn)象被稱為抗原漂移。病毒的包膜蛋白E基因是抗原變異的熱點區(qū)域，E蛋白上的氨基酸突變可能改變其抗原表位的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗體的中和能力下降。這使得病毒能夠在宿主免疫壓力下繼續(xù)傳播和進(jìn)化，增加了登革熱防控的難度。宿主的遺傳背景也對登革病毒1型的進(jìn)化產(chǎn)生影響。不同個體的遺傳差異可能導(dǎo)致對登革病毒1型的易感性和免疫反應(yīng)存在差異。研究表明，一些基因多態(tài)性與登革熱的發(fā)病風(fēng)險和病情嚴(yán)重程度相關(guān)。在人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因中，某些等位基因的存在可能影響機體對登革病毒1型的免疫應(yīng)答效率。HLA-DRB1*04等位基因的個體在感染登革病毒1型后，可能更容易出現(xiàn)重癥登革熱，這可能與該等位基因影響了T細(xì)胞對病毒抗原的識別和免疫反應(yīng)的強度有關(guān)。一些細(xì)胞因子基因的多態(tài)性也可能影響登革病毒1型的感染和進(jìn)化。干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）基因的多態(tài)性可能改變機體產(chǎn)生干擾素的能力，進(jìn)而影響病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和傳播。如果宿主的遺傳背景使得其對登革病毒1型的免疫反應(yīng)較弱，病毒就有更多的機會在宿主體內(nèi)復(fù)制和變異，從而推動病毒的進(jìn)化。人群的免疫水平和人口流動也是宿主因素中的重要方面。在廣州地區(qū)，人群的免疫水平存在差異，部分人群可能由于既往感染過登革病毒或接種過相關(guān)疫苗而具有一定的免疫力，而另一部分人群則可能對登革病毒1型易感。當(dāng)易感人群比例較高時，登革病毒1型在人群中傳播的機會增加，病毒在不斷感染新宿主的過程中，更容易發(fā)生變異和進(jìn)化。人口流動也會對登革病毒1型的進(jìn)化產(chǎn)生影響。廣州作為一個經(jīng)濟發(fā)達(dá)、人口流動頻繁的城市，大量的人員往來使得病毒更容易輸入和輸出。外來的登革病毒1型毒株可能在廣州地區(qū)的人群中傳播，與本地毒株相互作用，促進(jìn)病毒的基因重組和進(jìn)化。從東南亞等登革熱高發(fā)地區(qū)輸入的病毒株，可能攜帶新的基因變異，這些變異在廣州地區(qū)的人群和蚊媒中傳播，可能導(dǎo)致本地登革病毒1型的進(jìn)化方向發(fā)生改變。5.2環(huán)境因素環(huán)境因素在廣州地區(qū)登革病毒1型的分子進(jìn)化過程中扮演著重要角色，其中溫度、濕度和蚊蟲密度是關(guān)鍵的影響因素。溫度對登革病毒1型的進(jìn)化有著多方面的影響。適宜的溫度是登革病毒在蚊媒體內(nèi)復(fù)制和傳播的重要條件。當(dāng)環(huán)境溫度在25℃-30℃之間時，白紋伊蚊體內(nèi)的登革病毒1型復(fù)制效率較高。在這個溫度范圍內(nèi)，病毒的RNA聚合酶等關(guān)鍵酶的活性較高，能夠高效地進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而增加病毒在蚊體內(nèi)的滴度。溫度還會影響白紋伊蚊的生理活動和繁殖能力。在適宜溫度下，白紋伊蚊的新陳代謝加快，繁殖周期縮短，產(chǎn)卵量增加，這使得蚊媒種群數(shù)量迅速增長，進(jìn)而增加了登革病毒1型的傳播機會。當(dāng)溫度過高或過低時，都會對病毒的復(fù)制和蚊媒的生存產(chǎn)生不利影響。當(dāng)溫度超過35℃時，白紋伊蚊的壽命會縮短，其體內(nèi)的病毒復(fù)制也會受到抑制，這可能是由于高溫導(dǎo)致蚊媒體內(nèi)的生理環(huán)境發(fā)生變化，影響了病毒與蚊媒細(xì)胞之間的相互作用。而當(dāng)溫度低于16℃時，白紋伊蚊的活動能力和繁殖能力會顯著下降，甚至進(jìn)入滯育狀態(tài)，這使得登革病毒1型在蚊媒體內(nèi)的傳播和進(jìn)化受到阻礙。長期的溫度變化還可能促使登革病毒1型發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化。在溫暖的氣候條件下，病毒可能會逐漸適應(yīng)較高的溫度環(huán)境，通過基因突變等方式調(diào)整自身的生物學(xué)特性，以更好地在這種環(huán)境中生存和傳播。一些研究發(fā)現(xiàn)，在高溫環(huán)境下長期流行的登革病毒1型毒株，其基因序列中可能存在與溫度適應(yīng)性相關(guān)的突變，這些突變可能影響病毒的包膜蛋白結(jié)構(gòu)，使其在高溫下仍能保持穩(wěn)定的感染能力。濕度也是影響登革病毒1型進(jìn)化的重要環(huán)境因素。高濕度環(huán)境有利于白紋伊蚊的孳生和繁殖。白紋伊蚊的卵、幼蟲和蛹都需要在水中發(fā)育，高濕度可以保持積水環(huán)境的穩(wěn)定，為蚊媒的生長提供適宜的條件。在濕度較高的季節(jié)或地區(qū)，白紋伊蚊的繁殖速度加快，蚊蟲密度增加，從而增加了登革病毒1型的傳播風(fēng)險。濕度還會影響病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性。在高濕度環(huán)境下，病毒的包膜結(jié)構(gòu)可能會更加穩(wěn)定，有利于病毒在蚊媒與宿主之間的傳播。相反，在低濕度環(huán)境下，病毒的包膜可能會受到損傷，導(dǎo)致病毒的感染能力下降。濕度還可能影響宿主的免疫功能。高濕度環(huán)境可能會使人體的呼吸道黏膜等免疫屏障功能減弱，增加人體對登革病毒1型的易感性。在潮濕的環(huán)境中，人們的汗液蒸發(fā)減少，皮膚表面的微生物群落可能發(fā)生變化，這也可能影響人體的免疫狀態(tài)，進(jìn)而為病毒的傳播和進(jìn)化創(chuàng)造條件。蚊蟲密度與登革病毒1型的進(jìn)化密切相關(guān)。白紋伊蚊作為登革病毒1型的主要傳播媒介，其種群密度直接影響病毒的傳播效率。當(dāng)蚊蟲密度較高時，人與蚊子接觸的機會增加，病毒更容易在人群中傳播。在蚊蟲密集的地區(qū)，一個登革熱患者可能會被多只蚊子叮咬，這些蚊子再叮咬其他健康人，就會導(dǎo)致病毒的快速傳播。蚊蟲密度的增加還會加劇病毒在蚊媒體內(nèi)的傳播和進(jìn)化。大量的蚊子攜帶病毒，使得病毒在蚊媒群體中不斷傳播和變異，增加了病毒進(jìn)化的機會。在蚊蟲密度高的環(huán)境中，病毒可能會面臨不同蚊媒個體的免疫壓力和生理環(huán)境差異，這促使病毒發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化，以更好地在蚊媒群體中生存和傳播。蚊蟲密度的變化還會影響病毒的傳播范圍。如果某個地區(qū)的蚊蟲密度突然增加，病毒可能會迅速擴散到周邊地區(qū)，導(dǎo)致疫情的爆發(fā)和擴散。5.3病毒自身因素病毒自身的一些特性在廣州地區(qū)登革病毒1型的分子進(jìn)化過程中起著關(guān)鍵作用，其中突變和重組是兩個重要的方面。登革病毒1型的高突變率是其進(jìn)化的重要驅(qū)動力。作為單股正鏈RNA病毒，登革病毒1型缺乏有效的RNA校對機制。在病毒的復(fù)制過程中，依賴RNA的RNA聚合酶在合成子代病毒RNA時，容易出現(xiàn)堿基錯配的情況。這種錯配無法像DNA病毒那樣通過高效的校對機制進(jìn)行糾正，從而導(dǎo)致病毒基因組中不斷積累突變。據(jù)研究，登革病毒1型的突變率約為每年每核苷酸位點[X]×10?3替換，這一突變率相對較高，使得病毒在進(jìn)化過程中能夠快速產(chǎn)生遺傳變異。這些突變可能發(fā)生在病毒基因組的各個區(qū)域，對病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生多方面的影響。在結(jié)構(gòu)蛋白基因中，突變可能改變病毒的形態(tài)、包膜結(jié)構(gòu)以及與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力。包膜蛋白E基因的突變可能導(dǎo)致E蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響其與宿主細(xì)胞表面受體的親和力，進(jìn)而改變病毒的感染效率。一些突變可能使病毒更容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，增強其傳播能力。在非結(jié)構(gòu)蛋白基因中，突變可能影響病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及免疫逃逸等過程。NS5基因編碼的RNA聚合酶若發(fā)生突變，可能改變酶的活性，影響病毒基因組的復(fù)制速度和準(zhǔn)確性。NS1基因的突變可能影響NS1蛋白與宿主免疫細(xì)胞的相互作用，幫助病毒逃避宿主的免疫監(jiān)視?；蛑亟M也是登革病毒1型進(jìn)化的重要機制。登革病毒1型在自然感染過程中，可能會同時感染同一個宿主細(xì)胞或蚊媒細(xì)胞。當(dāng)兩種或多種不同的登革病毒1型毒株同時存在于一個細(xì)胞內(nèi)時，就有可能發(fā)生基因重組。在蚊媒體內(nèi)，當(dāng)蚊子叮咬了感染不同毒株的人后，不同毒株的病毒在蚊媒細(xì)胞內(nèi)相遇，就可能發(fā)生重組?；蛑亟M的過程涉及到病毒基因組的斷裂和重新連接。不同毒株的基因組在復(fù)制過程中可能發(fā)生錯配，導(dǎo)致部分基因片段的交換和重組。這種重組可能產(chǎn)生新的病毒基因型，具有不同的生物學(xué)特性。基因重組對登革病毒1型的進(jìn)化和傳播有著重要的影響。它可以產(chǎn)生具有新的生物學(xué)特性的病毒株，這些新毒株可能具有更強的傳播能力、更高的致病力或更好的免疫逃逸能力。一些重組毒株可能能夠更好地適應(yīng)新的宿主環(huán)境或蚊媒傳播條件，從而在人群中迅速傳播。重組還可能導(dǎo)致病毒的抗原性發(fā)生改變，使得原有的免疫記憶難以識別變異后的病毒，增加了人群再次感染的風(fēng)險。如果一個重組毒株的抗原表位發(fā)生了顯著變化，那么之前感染過登革病毒1型的人所產(chǎn)生的抗體可能無法有效地中和這種新的重組毒株，從而導(dǎo)致再次感染的發(fā)生。六、廣州地區(qū)登革病毒1型的傳播與溯源6.1傳播途徑分析登革病毒1型在廣州地區(qū)主要通過蚊媒叮咬進(jìn)行傳播，其中白紋伊蚊是最主要的傳播媒介。白紋伊蚊廣泛分布于廣州的各個區(qū)域，包括居民區(qū)、公園、學(xué)校、建筑工地等。其繁殖能力強，適應(yīng)環(huán)境能力也很強，能夠在各種小型積水容器中孳生，如花盆托盤、花瓶、廢舊輪胎、水桶等。在廣州溫暖濕潤的氣候條件下，白紋伊蚊全年都有活動，5-10月是其繁殖高峰期，這也與登革熱在廣州地區(qū)的流行季節(jié)相吻合。當(dāng)白紋伊蚊叮咬感染登革病毒1型的患者或隱性感染者后，病毒會在蚊體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和增殖。在適宜的溫度和濕度條件下，病毒在蚊體內(nèi)經(jīng)過一段時間的潛伏期后，會進(jìn)入蚊子的唾液腺。當(dāng)蚊子再次叮咬健康人時，病毒會隨著蚊子的唾液進(jìn)入人體，從而引發(fā)感染。病毒進(jìn)入人體后，首先在局部的巨噬細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，然后通過血液循環(huán)擴散到全身，感染其他細(xì)胞，如肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。除了白紋伊蚊，埃及伊蚊在廣州部分區(qū)域也有分布，雖然數(shù)量相對較少，但同樣具有傳播登革病毒1型的能力。埃及伊蚊與白紋伊蚊在生態(tài)習(xí)性上有所不同，它更喜歡棲息在室內(nèi)，對人類的叮咬更為頻繁。在一些老舊小區(qū)或衛(wèi)生條件較差的區(qū)域，埃及伊蚊可能更容易孳生，增加了登革病毒1型的傳播風(fēng)險。雖然登革病毒1型主要通過蚊媒傳播，但在特殊情況下，也可能存在其他傳播途徑。在實驗室研究中，已經(jīng)證實登革病毒1型可以通過血液傳播。在輸血過程中，如果供血者感染了登革病毒1型且處于病毒血癥期，受血者就有可能通過輸血感染病毒。在母嬰傳播方面，雖然這種情況較為罕見，但也有相關(guān)報道。感染登革病毒1型的孕婦在懷孕期間，病毒有可能通過胎盤傳播給胎兒，導(dǎo)致胎兒感染。在器官移植過程中，如果供體感染了登革病毒1型，也可能將病毒傳播給受體。不過，這些非蚊媒傳播途徑在廣州地區(qū)的登革熱傳播中所占比例較小，目前仍以蚊媒傳播為主。6.2輸入性病例與本地傳播廣州作為一個國際化大都市，人員往來頻繁，輸入性病例對本地登革病毒1型的傳播產(chǎn)生了重要影響。以2006-2010年為例，廣州市共報告916例登革熱病例，其中輸入性病例66例（7.21%），這些輸入性病例成為本地疫情的重要潛在傳染源。從輸入性病例的來源地來看，亞洲是最主要的輸入來源，占比高達(dá)89.39%，其中東南亞國家的輸入病例最多，共49例（74.24%）。像越南、泰國、印度尼西亞、柬埔寨等國家，與廣州在經(jīng)濟、貿(mào)易和人員往來上十分密切，這些國家是登革熱的高發(fā)地區(qū)，輸入病例將登革病毒1型帶入廣州的風(fēng)險較高。2006年廣州出現(xiàn)的DEN-1可能與泰國2002年的流行株輸入有關(guān)。當(dāng)輸入性病例進(jìn)入廣州后，如果在病毒血癥期被本地的白紋伊蚊叮咬，蚊子就會感染登革病毒1型。感染病毒的蚊子再叮咬其他健康人，就會導(dǎo)致病毒在本地人群中傳播，從而引發(fā)本地疫情。在輸入性病例的居住地或活動區(qū)域，如果蚊媒控制措施不到位，存在大量的白紋伊蚊孳生地，就為病毒的本地傳播創(chuàng)造了條件。在一些老舊小區(qū)，衛(wèi)生條件較差，積水容器較多，容易滋生白紋伊蚊，輸入性病例一旦在此停留，就可能導(dǎo)致病毒的傳播擴散。輸入性病例引發(fā)的本地傳播還可能受到本地人群免疫水平和環(huán)境因素的影響。如果本地人群對登革病毒1型的免疫水平較低，易感人群較多，輸入的病毒就更容易在人群中傳播和擴散。環(huán)境因素方面，如溫度、濕度等適宜白紋伊蚊孳生和繁殖的條件，也會增加病毒本地傳播的風(fēng)險。在廣州的夏季，氣溫高、濕度大，白紋伊蚊繁殖活躍，此時輸入性病例引發(fā)本地傳播的可能性更大。通過對輸入性病例的監(jiān)測和分析，可以及時發(fā)現(xiàn)潛在的疫情風(fēng)險，采取針對性的防控措施。加強對來自登革熱流行地區(qū)人員的健康監(jiān)測，在機場、港口等交通樞紐設(shè)置體溫檢測點，對有發(fā)熱、頭痛等癥狀的人員進(jìn)行及時排查和診斷。對輸入性病例的密切接觸者進(jìn)行追蹤和醫(yī)學(xué)觀察，對其居住地和活動場所進(jìn)行蚊媒消殺和環(huán)境清理，以切斷病毒的傳播途徑。6.3病毒溯源研究利用分子進(jìn)化分析方法對廣州地區(qū)登革病毒1型進(jìn)行溯源研究，發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)的登革病毒1型存在多種可能的來源。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將廣州地區(qū)的毒株與全球不同地區(qū)的參考毒株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)部分廣州地區(qū)的毒株與東南亞地區(qū)的毒株具有較高的同源性，提示這些毒株可能來源于東南亞。如前文所述，在2002-2003年廣州的登革熱疫情中，分離的毒株與柬埔寨、泰國等東南亞國家的毒株在進(jìn)化樹上緊密相鄰。這可能是由于東南亞地區(qū)登革熱流行較為頻繁，病毒在當(dāng)?shù)夭粩噙M(jìn)化和傳播。廣州與東南亞地區(qū)在地理位置上相對接近，人員和貿(mào)易往來頻繁，為病毒的輸入提供了便利條件。一些從東南亞地區(qū)返回廣州的旅行者，可能在感染登革病毒1型后，將病毒帶回廣州。貨物運輸過程中，受污染的貨物或運輸工具上攜帶的蚊子也可能將病毒傳播到廣州。除了東南亞地區(qū)，廣州地區(qū)的登革病毒1型還可能來源于其他地區(qū)。在對部分毒株的分析中發(fā)現(xiàn)，它們與南亞、非洲等地區(qū)的毒株也存在一定的親緣關(guān)系。2006-2010年廣州市輸入性登革熱病例中，有來自非洲和南亞的病例。這些輸入性病例有可能將當(dāng)?shù)氐牡歉锊《?型毒株帶入廣州，在適宜的條件下，這些毒株可能在廣州地區(qū)傳播和進(jìn)化。隨著全球化進(jìn)程的加速，人員和物資的流動更加頻繁，登革病毒1型的傳播范圍也在不斷擴大，其來源也更加多樣化。為了更準(zhǔn)確地追溯病毒的來源，結(jié)合了流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)。對輸入性病例的旅行史、感染時間、活動軌跡等信息進(jìn)行詳細(xì)記錄和分析，能夠更好地確定病毒的傳播路徑。如果一個輸入性病例在發(fā)病前曾在某個登革熱流行地區(qū)停留，且該地區(qū)的毒株與廣州地區(qū)的毒株在分子進(jìn)化分析中表現(xiàn)出親緣關(guān)系，那么就可以進(jìn)一步推測該病例可能是病毒輸入的源頭。對本地病例與輸入性病例之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行追蹤，通過調(diào)查病例之間的接觸史、共同活動區(qū)域等，判斷本地病例是否是由輸入性病例傳播而來。通過分子進(jìn)化分析和流行病學(xué)調(diào)查相結(jié)合的方法，能夠更全面、準(zhǔn)確地追溯廣州地區(qū)登革病毒1型的來源。這對于制定針對性的防控策略具有重要意義。如果確定病毒主要來源于某個地區(qū)，可以加強對該地區(qū)輸入人員和貨物的檢疫和監(jiān)測，采取更嚴(yán)格的防控措施，如加強機場、港口等交通樞紐的體溫檢測和健康申報，對來自疫情高發(fā)地區(qū)的人員進(jìn)行隔離觀察等。了解病毒的來源還可以為疫苗研發(fā)提供參考，選擇與本地流行毒株同源性較高的病毒株作為疫苗研發(fā)的候選毒株，提高疫苗的保護(hù)效果。七、結(jié)論與展望7.1研究總結(jié)本研究對廣州地區(qū)登革病毒1型的分子進(jìn)化進(jìn)行了全面深入的研究，取得了一系列重要成果。通過對廣州地區(qū)不同年份登革熱患者血清樣本的采集、處理以及病毒RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增和測序等實驗操作，成功獲得了登革病毒1型的基因序列。在基因序列分析方面，發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)登革病毒1型毒株的基因序列存在一定程度的變異，核苷酸同源性在[具體范圍]之間。在包膜蛋白E基因和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因等關(guān)鍵區(qū)域檢測到多個突變位點，部分突變位點導(dǎo)致了氨基酸的變化。這些突變和氨基酸變化可能對病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生重要影響，如影響病毒的感染能力、免疫原性、傳播能力和致病力等。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，廣州地區(qū)的登革病毒1型毒株分布在不同的進(jìn)化分支上。部分毒株與東南亞地區(qū)的毒株處于同一分支，顯示出較高的同源性，提示廣州地區(qū)的登革病毒1型可能有一部分來源于東南亞地區(qū)。另一部分毒株形成了獨特的進(jìn)化分支，表明它們在廣州地區(qū)經(jīng)歷了獨立的進(jìn)化過程，呈現(xiàn)出一定的本地化特征。不同年份廣州地區(qū)登革病毒1型的進(jìn)化分支存在變化，這可能與病毒的輸入、基因變異以及重組等因素有關(guān)?；蛐头植继卣餮芯堪l(fā)現(xiàn)，廣州地區(qū)存在多種基因型的登革病毒1型，主要包括基因I型、基因IV型和基因V型等。在不同年份，基因型分布存在變化，2002-2003年疫情中部分