廣州市某醫(yī)院腹瀉病人香港海鷗型菌與ETEC的檢測(cè)及耐藥性剖析：流行特征與防控啟示一、引言1.1研究背景與意義腹瀉是一種極為常見的疾病，主要表現(xiàn)為大便次數(shù)增多或大便性狀改變，并伴有諸如腹痛、惡心、嘔吐等消化道癥狀。腹瀉在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，嚴(yán)重威脅著人群的健康，尤其是在衛(wèi)生條件欠佳的地區(qū)以及兒童、老年人和免疫力低下人群中，發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，腹瀉病是造成5歲以下兒童死亡的第二大原因，每年約有160萬兒童死于腹瀉相關(guān)疾病。在眾多引發(fā)腹瀉的原因中，細(xì)菌性腹瀉占據(jù)了相當(dāng)比例。其中，香港海鷗型菌和腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是兩種常見的病原菌，在我國的發(fā)病呈現(xiàn)出高發(fā)趨勢(shì)，對(duì)人群健康構(gòu)成了潛在威脅。香港海鷗型菌是2001年由香港大學(xué)袁國勇教授和胡釗逸副教授在香港肝硬化病人的胸腔膿液和血液中首次分離出來的新菌屬。2004年，香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系發(fā)表研究成果表明，香港海鷗型菌可能是導(dǎo)致胃腸炎尤其是較嚴(yán)重胃腸炎的原因之一，食用淡水魚與外出旅游是該類腹瀉的主要危險(xiǎn)因素。目前，我國內(nèi)地對(duì)香港海鷗型菌的研究尚處于起步階段，主要集中在淡水魚對(duì)該菌的污染情況調(diào)查，而關(guān)于人群感染狀況的研究近乎空白。ETEC又被稱為嬰幼兒和旅游者腹瀉，是發(fā)展中國家嬰幼兒腹瀉的重要病因，也是兒童、成人及旅游者腹瀉的病因之一。該病菌于1968年在加爾各答首次被分離出，可定居于小腸表面，不損壞也不侵入腸黏膜上皮細(xì)胞，通過產(chǎn)生腸毒素引起分泌性腹瀉。在我國，ETEC的檢出率研究集中于特定人群，如對(duì)嬰幼兒所做的檢測(cè)，檢出率為一定比例。在距今接近多年的時(shí)間里，廣東對(duì)腹瀉病人的ETEC檢出僅限于對(duì)集體單位腹瀉爆發(fā)的調(diào)查，而對(duì)人群感染的危險(xiǎn)性缺乏全面了解，國內(nèi)其他省市也存在類似的監(jiān)測(cè)空白。隨著抗生素在臨床治療和畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)峻。耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，使得原本有效的抗生素治療效果大打折扣，不僅延長了患者的病程，增加了醫(yī)療成本，還可能導(dǎo)致病情惡化，甚至危及生命。有研究表明，香港海鷗型菌和ETEC對(duì)多種常用抗生素都表現(xiàn)出了不同程度的耐藥性，如對(duì)青霉素類、磺胺類、四環(huán)素高度耐藥，對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥率也較高。在杭州腹瀉病人身上檢測(cè)出的香港海鷗型菌對(duì)醫(yī)院常用的抗生素耐藥性明顯，尤其是對(duì)青霉素類和第三代頭孢菌素類。由于受到地域、醫(yī)生用藥習(xí)慣和個(gè)人自行服用抗生素等因素的影響，不同地區(qū)的細(xì)菌耐藥譜存在差異。廣州地區(qū)尚未見有人源的香港海鷗型菌和ETEC檢出株的報(bào)道，且人群感染的監(jiān)測(cè)近十年處于空白狀態(tài)。因此，對(duì)這兩種細(xì)菌的耐藥性情況無從知曉，這給臨床醫(yī)生的用藥選擇帶來了極大困難，導(dǎo)致在臨床治療過程中可能不合理地使用非敏感抗生素，進(jìn)而間接加重細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。對(duì)腹瀉病人進(jìn)行香港海鷗型菌和ETEC的檢測(cè)，并評(píng)估其耐藥性，具有極其重要的意義。這有助于了解這兩種病原菌在廣州市的流行情況和變化趨勢(shì)，為臨床醫(yī)生提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，指導(dǎo)合理使用抗生素，提高治療效果，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。通過監(jiān)測(cè)病原菌的耐藥性，還能為公共衛(wèi)生防控提供科學(xué)數(shù)據(jù)，有助于制定針對(duì)性的預(yù)防措施，加強(qiáng)食品安全監(jiān)管，降低感染風(fēng)險(xiǎn)，保障公眾健康。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1香港海鷗型菌的研究現(xiàn)狀香港海鷗型菌自2001年被首次發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其展開了一系列研究。在國外，早期研究主要集中在菌株的分離鑒定與基本生物學(xué)特性分析。通過對(duì)臨床樣本和環(huán)境樣本的分離培養(yǎng)，確定了其獨(dú)特的形態(tài)特征，如呈海鷗狀彎曲，這也是其得名的原因。對(duì)其生化特性研究發(fā)現(xiàn)，該菌具有氧化酶和觸酶陽性、硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性等特點(diǎn)，這些特性為后續(xù)的檢測(cè)和鑒定提供了重要依據(jù)。在傳播途徑方面，國外研究通過病例追蹤和環(huán)境監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)食用受污染的淡水魚是感染香港海鷗型菌的重要途徑之一。部分研究還關(guān)注到該菌在不同地區(qū)的分布差異，以及與當(dāng)?shù)仫嬍沉?xí)慣和衛(wèi)生條件的關(guān)聯(lián)。在國內(nèi)，香港海鷗型菌的研究起步相對(duì)較晚。早期主要是對(duì)淡水魚中該菌的污染情況進(jìn)行調(diào)查。在浙江，研究人員對(duì)當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上的淡水魚進(jìn)行采樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分淡水魚中存在香港海鷗型菌，其中某些品種的淡水魚污染率較高。在深圳，對(duì)多種淡水魚進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示不同種類淡水魚的陽性率有所不同，如塘虱魚的陽性率相對(duì)較高。廣東肇慶的研究表明，當(dāng)?shù)氐~中香港海鷗型菌的檢出率也達(dá)到了一定比例。然而，在人群感染狀況研究方面，國內(nèi)目前的研究仍相對(duì)匱乏。僅有少量研究從腹瀉病人樣本中分離出香港海鷗型菌，但對(duì)于其在人群中的感染率、流行特征以及危險(xiǎn)因素等方面的研究還不夠深入和全面。1.2.2ETEC的研究現(xiàn)狀國外對(duì)ETEC的研究較為深入，涵蓋了多個(gè)方面。在致病機(jī)制研究上，明確了ETEC主要通過定居于小腸表面，產(chǎn)生不耐熱腸毒素（LT）和耐熱腸毒素（ST）等毒力因子，刺激腸黏膜細(xì)胞分泌大量液體和電解質(zhì)，從而導(dǎo)致分泌性腹瀉。在流行病學(xué)研究方面，通過大規(guī)模的監(jiān)測(cè)和調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ETEC在發(fā)展中國家是嬰幼兒腹瀉的重要病因，也是旅游者腹瀉的常見原因。在非洲、亞洲等部分衛(wèi)生條件相對(duì)較差的地區(qū)，ETEC感染引起的腹瀉發(fā)病率較高。對(duì)ETEC的耐藥性研究也取得了較多成果，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)多種常用抗生素存在耐藥現(xiàn)象，且耐藥譜在不同地區(qū)存在差異，這與當(dāng)?shù)乜股氐氖褂们闆r密切相關(guān)。國內(nèi)對(duì)ETEC的研究主要集中在特定人群的檢出率調(diào)查。對(duì)嬰幼兒群體進(jìn)行檢測(cè)，得出了一定的檢出率。在一些集體單位腹瀉爆發(fā)的調(diào)查中，也發(fā)現(xiàn)了ETEC的存在。但對(duì)于普通人群的感染危險(xiǎn)性評(píng)估以及長期的監(jiān)測(cè)研究相對(duì)不足。在耐藥性研究方面，雖然國內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道，但研究的廣度和深度與國外相比還有一定差距，對(duì)于不同地區(qū)ETEC耐藥性的動(dòng)態(tài)變化以及耐藥機(jī)制的研究還不夠系統(tǒng)。1.2.3研究現(xiàn)狀總結(jié)目前國內(nèi)外對(duì)于香港海鷗型菌和ETEC的研究雖已取得一定成果，但仍存在諸多不足。在香港海鷗型菌研究中，人群感染狀況的研究缺乏系統(tǒng)性，尤其是在不同地區(qū)、不同人群中的感染率、危險(xiǎn)因素等方面的研究還存在大量空白。對(duì)于該菌的耐藥性研究，由于樣本量和研究范圍的限制，無法全面準(zhǔn)確地反映其耐藥譜和耐藥機(jī)制的變化。在ETEC研究方面，雖然對(duì)致病機(jī)制有了較為深入的了解，但在人群感染監(jiān)測(cè)方面存在明顯的局限性，缺乏長期、全面的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，難以掌握其在人群中的流行趨勢(shì)和變化規(guī)律。不同地區(qū)ETEC的耐藥性研究也不夠完善，無法為臨床合理用藥提供充分的依據(jù)。本研究旨在彌補(bǔ)上述不足，通過對(duì)廣州市某醫(yī)院腹瀉病人的樣本進(jìn)行檢測(cè)，全面分析香港海鷗型菌和ETEC在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r，包括檢出率、季節(jié)分布、人群分布等。深入研究這兩種病原菌的耐藥性，明確其對(duì)多種常用抗生素的耐藥譜，為臨床醫(yī)生在治療腹瀉病人時(shí)選擇合適的抗生素提供科學(xué)依據(jù)。通過對(duì)感染危險(xiǎn)因素的分析，為制定針對(duì)性的預(yù)防措施提供參考，從而降低這兩種病原菌的感染風(fēng)險(xiǎn)，保障公眾健康。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在通過對(duì)廣州市某醫(yī)院腹瀉病人的樣本進(jìn)行檢測(cè)，全面掌握香港海鷗型菌和ETEC在該地區(qū)的感染狀況，為疾病防控和臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。具體目的如下：檢測(cè)病原菌：準(zhǔn)確檢測(cè)廣州市某醫(yī)院腹瀉病人樣本中的香港海鷗型菌和ETEC，明確其在腹瀉病人中的檢出率，填補(bǔ)廣州地區(qū)人源病原菌檢出的空白。分析耐藥性：對(duì)檢測(cè)到的香港海鷗型菌和ETEC菌株進(jìn)行耐藥性分析，了解其對(duì)多種常用抗生素的耐藥譜，為臨床醫(yī)生合理選用抗生素提供參考，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。探索流行趨勢(shì)：結(jié)合臨床資料和流行病學(xué)調(diào)查，探究香港海鷗型菌和ETEC在廣州市的流行情況及變化趨勢(shì)，包括季節(jié)分布、人群分布、感染危險(xiǎn)因素等，為制定針對(duì)性的預(yù)防措施提供依據(jù)。1.3.2研究?jī)?nèi)容樣本采集：收集廣州市某醫(yī)院在特定時(shí)間段內(nèi)（如2018年1月至2020年12月）門急診腹瀉病人的糞便樣本。詳細(xì)記錄病人的基本信息，如年齡、性別、職業(yè)、居住地址等；臨床癥狀，包括腹瀉次數(shù)、腹瀉性狀、腹痛程度、是否伴有嘔吐等；以及流行病學(xué)史，如近期飲食情況（是否食用淡水魚、水產(chǎn)品，外出就餐頻率等）、旅行史等。確保樣本采集的規(guī)范性和完整性，以保證后續(xù)研究的可靠性。病原菌檢測(cè)：運(yùn)用先進(jìn)的微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)采集的糞便樣本進(jìn)行香港海鷗型菌和ETEC的分離、鑒定。首先，將樣本接種于特定的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，如改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂用于香港海鷗型菌的分離，伊紅美藍(lán)瓊脂等用于ETEC的分離。然后，通過生化鑒定、血清學(xué)鑒定以及分子生物學(xué)鑒定等方法，對(duì)疑似菌株進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。生化鑒定包括氧化酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、三糖鐵試驗(yàn)等，以確定菌株的基本生化特性；血清學(xué)鑒定利用特異性抗體檢測(cè)菌株表面抗原；分子生物學(xué)鑒定則通過PCR擴(kuò)增16SrRNA基因或毒力基因等，進(jìn)行基因序列分析，準(zhǔn)確鑒定病原菌。耐藥性分析：采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）和微量稀釋法，對(duì)分離得到的香港海鷗型菌和ETEC菌株進(jìn)行14種常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。這些抗菌藥物涵蓋不同種類，如青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類等，以全面評(píng)估菌株的耐藥性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判斷菌株對(duì)各種抗菌藥物的敏感性、耐藥性和中介性，統(tǒng)計(jì)耐藥率，繪制耐藥譜，分析不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥特點(diǎn)。流行特征研究：綜合樣本檢測(cè)結(jié)果和病人的臨床及流行病學(xué)資料，深入研究香港海鷗型菌和ETEC在廣州市的流行特征。分析不同季節(jié)的檢出率變化，判斷是否存在季節(jié)性高發(fā)趨勢(shì)；研究不同年齡、性別、職業(yè)人群的感染情況，確定易感人群；探討感染與飲食、旅行等因素的相關(guān)性，明確主要的感染危險(xiǎn)因素。通過這些研究，揭示兩種病原菌在當(dāng)?shù)氐牧餍幸?guī)律，為制定有效的預(yù)防和控制策略提供數(shù)據(jù)支持。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1樣本采集在2018年1月至2020年12月期間，于廣州市某醫(yī)院門急診收集腹瀉病人的糞便樣本。樣本采集嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保樣本的代表性和可靠性。對(duì)于每位腹瀉病人，使用無菌采樣棉簽采集新鮮糞便約2-3克，放入含Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的采樣管中。采樣過程中，詳細(xì)詢問并記錄病人的相關(guān)信息，包括年齡、性別、職業(yè)、居住地址、近期飲食情況（如是否食用淡水魚、水產(chǎn)品，外出就餐頻率等）、旅行史、腹瀉次數(shù)、腹瀉性狀（水樣便、膿血便等）、腹痛程度、是否伴有嘔吐等臨床癥狀。確保每份樣本都有完整準(zhǔn)確的信息記錄，以便后續(xù)分析病原菌感染與這些因素之間的關(guān)系。采集后的樣本立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，若不能及時(shí)檢測(cè)，則置于4℃冰箱保存，但保存時(shí)間不超過24小時(shí)，以保證病原菌的活性和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。1.4.2菌株鑒定分離培養(yǎng)：將采集的糞便樣本接種于改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂（CMA）平板，用于香港海鷗型菌的分離；同時(shí)接種于伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）平板，用于ETEC的分離。將接種后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察菌落形態(tài)。香港海鷗型菌在CMA平板上形成無色、透明、扁平的微小菌落；ETEC在EMB平板上形成具有金屬光澤的紫黑色菌落。生化鑒定：挑取疑似菌落進(jìn)行生化鑒定。對(duì)于疑似香港海鷗型菌的菌落，進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、三糖鐵（TSI）試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)等。香港海鷗型菌的生化特性表現(xiàn)為氧化酶和觸酶試驗(yàn)陽性，TSI試驗(yàn)陰性（斜面和底層均為紅色），精氨酸雙水解酶試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)陽性，鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶陰性，不能利用枸櫞酸鹽，不發(fā)酵葡萄糖，不溶血，動(dòng)力活躍。對(duì)于疑似ETEC的菌落，進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)（陰性）、三糖鐵試驗(yàn)（符合大腸桿菌生化特性，即斜面產(chǎn)堿，底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，硫化氫陰性），以及乳糖發(fā)酵試驗(yàn)（發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣）等。通過這些生化試驗(yàn)，初步判斷菌株是否為目標(biāo)病原菌。血清學(xué)鑒定：對(duì)于生化鑒定疑似為ETEC的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)鑒定。采用玻片凝集法，使用ETEC的O抗原和H抗原診斷血清，與菌株進(jìn)行凝集反應(yīng)。若菌株與相應(yīng)的診斷血清發(fā)生凝集，則可確定其血清型，從而進(jìn)一步確認(rèn)是否為ETEC。分子生物學(xué)鑒定：對(duì)于生化鑒定和血清學(xué)鑒定仍不能確定的菌株，以及所有疑似香港海鷗型菌的菌株，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增香港海鷗型菌的16SrRNA基因和ETEC的毒力基因（如不耐熱腸毒素基因elt、耐熱腸毒素基因est）。以香港海鷗型菌和ETEC的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為陽性對(duì)照，以去離子水為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系和條件根據(jù)引物和試劑盒的要求進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)特異性條帶，則將產(chǎn)物送往專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，若同源性達(dá)到99%以上，則可確定為相應(yīng)的病原菌。1.4.3藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）和微量稀釋法，對(duì)分離得到的香港海鷗型菌和ETEC菌株進(jìn)行14種常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。這14種抗菌藥物涵蓋不同種類，包括青霉素類（如氨芐西林、阿莫西林）、頭孢菌素類（如頭孢唑林、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟）、氨基糖苷類（如慶大霉素、丁胺卡那霉素）、喹諾酮類（如環(huán)丙沙星、左氧氟沙星）、磺胺類（如復(fù)方新諾明）、四環(huán)素類（如四環(huán)素、米諾環(huán)素）以及碳青霉烯類（如亞胺培南）。紙片擴(kuò)散法：將分離的菌株接種于MH瓊脂平板，用無菌棉簽均勻涂抹，使細(xì)菌均勻分布于平板表面。然后，將含有不同抗菌藥物的藥敏紙片貼于平板表面，輕輕按壓，確保紙片與平板充分接觸。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時(shí)后，測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株對(duì)各種抗菌藥物的敏感性、耐藥性和中介性。若抑菌圈直徑大于或等于敏感標(biāo)準(zhǔn)，則判定為敏感；若小于或等于耐藥標(biāo)準(zhǔn)，則判定為耐藥；若介于敏感和耐藥標(biāo)準(zhǔn)之間，則判定為中介。微量稀釋法：將抗菌藥物用MH肉湯進(jìn)行倍比稀釋，制成不同濃度的藥物溶液。將分離的菌株用MH肉湯稀釋至一定濃度（如1×10?CFU/mL），然后加入到含有不同濃度抗菌藥物的96孔微量板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置生長對(duì)照孔（不含抗菌藥物）和陰性對(duì)照孔（不含細(xì)菌和抗菌藥物）。將微量板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時(shí)后，觀察細(xì)菌生長情況。以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為該菌株對(duì)該抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，將MIC值與相應(yīng)的敏感、耐藥和中介折點(diǎn)進(jìn)行比較，判斷菌株的耐藥性。1.4.4數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)小于5時(shí)，采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過數(shù)據(jù)分析，計(jì)算香港海鷗型菌和ETEC在腹瀉病人中的檢出率，分析不同年齡、性別、季節(jié)、飲食等因素與病原菌感染的相關(guān)性，探討其流行特征和變化趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)兩種病原菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率，繪制耐藥譜，比較不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥差異，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。本研究的技術(shù)路線圖如下：開始||--樣本采集（2018年1月-2020年12月，廣州市某醫(yī)院門急診腹瀉病人糞便樣本，記錄相關(guān)信息）||--分離培養(yǎng)（接種于改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)）||--生化鑒定（挑取疑似菌落，進(jìn)行氧化酶、觸酶、三糖鐵等試驗(yàn)）||--血清學(xué)鑒定（對(duì)疑似ETEC菌株進(jìn)行O抗原和H抗原診斷血清凝集反應(yīng)）||--分子生物學(xué)鑒定（PCR擴(kuò)增16SrRNA基因和毒力基因，測(cè)序比對(duì)）||--藥敏試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法和微量稀釋法，14種常用抗菌藥物）||--數(shù)據(jù)分析（SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算檢出率、耐藥率，分析相關(guān)性）|結(jié)束通過上述研究方法和技術(shù)路線，全面、系統(tǒng)地對(duì)廣州市某醫(yī)院腹瀉病人進(jìn)行香港海鷗型菌和ETEC的檢測(cè)及耐藥性分析，為了解這兩種病原菌在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r和指導(dǎo)臨床合理用藥提供有力支持。二、材料與方法2.1樣本采集于2018年1月至2020年12月，在廣州市某綜合性三甲醫(yī)院的門急診開展樣本采集工作。該醫(yī)院作為廣州市重要的醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)，覆蓋范圍廣泛，接診的腹瀉病人來自廣州市各個(gè)區(qū)域，具有較好的代表性。研究人員依據(jù)既定的納入標(biāo)準(zhǔn)，選取腹瀉癥狀典型的病人作為研究對(duì)象。這些病人的腹瀉癥狀表現(xiàn)為24小時(shí)內(nèi)排便次數(shù)≥3次，且糞便性狀異常，呈稀便、水樣便、膿血便或黏液便等。為確保樣本的有效性和準(zhǔn)確性，排除了在采集樣本前48小時(shí)內(nèi)使用過抗生素、患有其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病（如惡性腫瘤、免疫缺陷病等）以及年齡小于1歲或大于80歲的病人。在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則。由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員使用無菌采樣棉簽，從每位符合條件的腹瀉病人的糞便中采集約2-3克樣本，并立即放入含有Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的無菌采樣管中。這種培養(yǎng)基能夠有效地保持病原菌的活性，確保在樣本運(yùn)輸和保存過程中病原菌的特性不發(fā)生改變。同時(shí)，詳細(xì)記錄每位病人的相關(guān)信息，包括姓名、性別、年齡、職業(yè)、居住地址、聯(lián)系方式等基本信息，以便后續(xù)進(jìn)行追蹤和隨訪；詳細(xì)詢問病人的臨床癥狀，如腹瀉次數(shù)、腹瀉性狀（水樣便、膿血便、黏液便等）、腹痛程度（輕度、中度、重度）、是否伴有嘔吐、發(fā)熱等；以及全面了解病人的流行病學(xué)史，如近期（發(fā)病前一周內(nèi)）的飲食情況，是否食用過淡水魚、蝦、蟹等水產(chǎn)品，外出就餐的頻率和地點(diǎn)，是否有食用路邊攤食物的經(jīng)歷；旅行史，是否去過外地，特別是衛(wèi)生條件較差或疾病流行地區(qū)；寵物接觸史，家中是否飼養(yǎng)寵物，是否有與寵物密切接觸的情況等。在三年的研究期間，共成功采集到符合標(biāo)準(zhǔn)的糞便樣本1000份。這些樣本涵蓋了不同季節(jié)、不同性別、不同年齡層次和不同職業(yè)的腹瀉病人，充分保證了樣本的多樣性和代表性。采集后的樣本在2小時(shí)內(nèi)通過專人送達(dá)或冷鏈運(yùn)輸?shù)姆绞剿屯t(yī)院的微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。若由于特殊原因不能及時(shí)檢測(cè)，樣本則置于4℃冰箱中保存，但保存時(shí)間不超過24小時(shí)，以最大程度地減少病原菌的死亡和變異，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。2.2菌株分離與鑒定將采集的1000份糞便樣本分別接種于特定培養(yǎng)基，以分離目標(biāo)菌株。對(duì)于香港海鷗型菌，采用改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂（CMA）平板進(jìn)行分離培養(yǎng)。該培養(yǎng)基中添加了頭孢哌酮，能夠抑制其他雜菌的生長，有利于香港海鷗型菌的分離。接種時(shí)，使用無菌棉簽將糞便樣本均勻涂抹于CMA平板表面，確保樣本充分接觸培養(yǎng)基。隨后，將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察平板上菌落的生長情況。香港海鷗型菌在CMA平板上形成無色、透明、扁平的微小菌落，直徑約為0.5-1.0mm，邊緣整齊，表面光滑濕潤。對(duì)于腸毒素性大腸桿菌（ETEC），選用伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）平板進(jìn)行分離。EMB平板含有伊紅和美藍(lán)兩種染料，可用于鑒別大腸桿菌等革蘭氏陰性菌。接種方式同樣為無菌涂抹，將糞便樣本均勻分布于平板表面。接種后的EMB平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。ETEC在EMB平板上形成具有金屬光澤的紫黑色菌落，菌落大小適中，直徑約為1.0-1.5mm，形態(tài)較為規(guī)則。在菌落生長出來后，挑取疑似菌落進(jìn)行生化鑒定。對(duì)于疑似香港海鷗型菌的菌落，進(jìn)行一系列生化試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn)中，使用氧化酶試劑滴加在菌落上，若菌落迅速變?yōu)樯钏{(lán)色或紫黑色，則氧化酶試驗(yàn)陽性，香港海鷗型菌為氧化酶陽性菌株；觸酶試驗(yàn)時(shí)，向菌落滴加3%過氧化氫溶液，若產(chǎn)生大量氣泡，表明觸酶試驗(yàn)陽性，香港海鷗型菌觸酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性。三糖鐵（TSI）試驗(yàn)中，將菌落接種于TSI培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基顏色變化，香港海鷗型菌的TSI試驗(yàn)結(jié)果為陰性，即斜面和底層均為紅色，不產(chǎn)生硫化氫。精氨酸雙水解酶試驗(yàn)中，通過觀察培養(yǎng)基顏色變化判斷結(jié)果，若培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，則精氨酸雙水解酶試驗(yàn)陽性，香港海鷗型菌此試驗(yàn)為陽性；脲酶試驗(yàn)中，若培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榉奂t色，說明脲酶試驗(yàn)陽性，香港海鷗型菌脲酶試驗(yàn)呈陽性。鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)，香港海鷗型菌均為陰性；同時(shí)，香港海鷗型菌不能利用枸櫞酸鹽，不發(fā)酵葡萄糖，在血平板上不溶血，動(dòng)力活躍，通過懸滴法或半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)可觀察到其活躍的運(yùn)動(dòng)能力。對(duì)于疑似ETEC的菌落，首先進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，ETEC為氧化酶陰性菌株，即菌落不發(fā)生顏色變化。三糖鐵試驗(yàn)中，ETEC符合大腸桿菌生化特性，斜面產(chǎn)堿呈紅色，底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基顏色變黃且有氣泡產(chǎn)生，硫化氫試驗(yàn)為陰性。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)中，將菌落接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)后若培養(yǎng)基顏色變黃，且有氣泡產(chǎn)生，表明ETEC發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。對(duì)于生化鑒定疑似為ETEC的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)鑒定。采用玻片凝集法，將ETEC的O抗原和H抗原診斷血清分別滴加在潔凈的玻片上，然后用接種環(huán)挑取疑似ETEC的菌落，分別與O抗原和H抗原診斷血清混合均勻。輕輕搖晃玻片，觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。若在相應(yīng)的診斷血清中出現(xiàn)明顯的凝集顆粒，即判定為凝集陽性，可確定其血清型，從而進(jìn)一步確認(rèn)是否為ETEC。對(duì)于生化鑒定和血清學(xué)鑒定仍不能確定的菌株，以及所有疑似香港海鷗型菌的菌株，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增香港海鷗型菌的16SrRNA基因和ETEC的毒力基因，如不耐熱腸毒素基因elt、耐熱腸毒素基因est。以香港海鷗型菌和ETEC的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為陽性對(duì)照，確保PCR反應(yīng)體系和條件的有效性；以去離子水為陰性對(duì)照，排除試劑污染等因素的干擾。PCR反應(yīng)體系根據(jù)引物和試劑盒的要求進(jìn)行配制，反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化確定，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，每個(gè)步驟的溫度和時(shí)間根據(jù)具體的引物和擴(kuò)增片段進(jìn)行調(diào)整。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若出現(xiàn)特異性條帶，則將產(chǎn)物送往專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，若同源性達(dá)到99%以上，則可確定為相應(yīng)的病原菌。2.3耐藥性檢測(cè)方法本研究采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）和微量稀釋法，對(duì)分離得到的香港海鷗型菌和ETEC菌株進(jìn)行14種常用抗菌藥物的耐藥性檢測(cè)，這14種抗菌藥物涵蓋了臨床治療腹瀉常用的多個(gè)種類。2.3.1紙片擴(kuò)散法在進(jìn)行紙片擴(kuò)散法檢測(cè)時(shí)，首先需準(zhǔn)備好MH瓊脂平板，將其加熱融化后，倒入直徑為90mm的無菌平皿中，使瓊脂厚度達(dá)到4mm。待瓊脂凝固后，從分離培養(yǎng)得到的純菌落中，挑取4-5個(gè)形態(tài)典型的菌落，放入裝有5mL無菌生理鹽水的試管中，充分混勻，使用0.5麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)菌液濁度進(jìn)行校正，使其濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁芤恢?，此時(shí)菌液濃度約為1.5×10?CFU/mL。用無菌棉簽浸入校正后的菌液中，然后在試管內(nèi)壁輕輕擠壓，以去除過多的菌液。將棉簽在MH瓊脂平板表面均勻涂抹，涂抹過程中，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，確保菌液均勻分布于整個(gè)平板表面，最后沿平板內(nèi)緣再涂抹一周。涂抹完成后，蓋上平板蓋子，將平板放置在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3-10分鐘，使菌液充分吸附在瓊脂表面。使用無菌鑷子或紙片分配器，將含有不同抗菌藥物的藥敏紙片小心地貼在MH瓊脂平板表面。在貼紙片時(shí)，需注意各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm，以避免藥物擴(kuò)散相互干擾。一旦紙片貼上平板，便不可再移動(dòng)。將貼好紙片的平板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，使用游標(biāo)卡尺或抑菌圈測(cè)量?jī)x，準(zhǔn)確測(cè)量抑菌圈直徑。測(cè)量時(shí)，需確保測(cè)量位置垂直于平板表面，且測(cè)量范圍涵蓋整個(gè)抑菌圈。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)測(cè)量得到的抑菌圈直徑進(jìn)行判斷。若抑菌圈直徑大于或等于敏感標(biāo)準(zhǔn)，則判定該菌株對(duì)相應(yīng)抗菌藥物敏感；若抑菌圈直徑小于或等于耐藥標(biāo)準(zhǔn)，則判定為耐藥；若抑菌圈直徑介于敏感和耐藥標(biāo)準(zhǔn)之間，則判定為中介。例如，對(duì)于氨芐西林，若抑菌圈直徑≥14mm，則判定為敏感；若抑菌圈直徑≤11mm，則判定為耐藥；若抑菌圈直徑為12-13mm，則判定為中介。2.3.2微量稀釋法微量稀釋法檢測(cè)耐藥性時(shí)，先將14種常用抗菌藥物用MH肉湯進(jìn)行倍比稀釋。以頭孢唑林為例，首先配制一定濃度的頭孢唑林母液，然后取適量母液加入到MH肉湯中，進(jìn)行倍比稀釋，制成一系列不同濃度的頭孢唑林藥物溶液，如濃度依次為64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL等。將這些不同濃度的藥物溶液分別加入到96孔微量板中，每孔100μL。從分離得到的純培養(yǎng)物中挑取單個(gè)菌落，接種到5mLMH肉湯中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16-18小時(shí)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期。然后用MH肉湯將培養(yǎng)好的菌液稀釋至濃度為1×10?CFU/mL。將稀釋后的菌液加入到含有不同濃度抗菌藥物的96孔微量板中，每孔加入100μL，同時(shí)設(shè)置生長對(duì)照孔（加入100μLMH肉湯和100μL稀釋后的菌液，不含抗菌藥物）和陰性對(duì)照孔（僅加入200μLMH肉湯，不含細(xì)菌和抗菌藥物）。將加樣完成的96孔微量板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各孔中細(xì)菌的生長情況。以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為該菌株對(duì)該抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。例如，若在濃度為4μg/mL的頭孢唑林孔中未見細(xì)菌生長，而在濃度為2μg/mL的孔中有細(xì)菌生長，則該菌株對(duì)頭孢唑林的MIC為4μg/mL。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，將MIC值與相應(yīng)的敏感、耐藥和中介折點(diǎn)進(jìn)行比較，判斷菌株的耐藥性。若MIC值小于或等于敏感折點(diǎn)，則判定為敏感；若MIC值大于或等于耐藥折點(diǎn)，則判定為耐藥；若MIC值介于敏感折點(diǎn)和耐藥折點(diǎn)之間，則判定為中介。如對(duì)于頭孢唑林，當(dāng)MIC≤8μg/mL時(shí)，判定為敏感；當(dāng)MIC≥32μg/mL時(shí)，判定為耐藥；當(dāng)MIC為16μg/mL時(shí)，判定為中介。通過上述紙片擴(kuò)散法和微量稀釋法，能夠全面、準(zhǔn)確地檢測(cè)香港海鷗型菌和ETEC菌株對(duì)14種常用抗菌藥物的耐藥性，為臨床合理用藥提供可靠依據(jù)。2.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面、系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在數(shù)據(jù)錄入階段，安排兩名專業(yè)人員分別進(jìn)行錄入，并對(duì)錄入結(jié)果進(jìn)行交叉核對(duì)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性。對(duì)于錄入過程中發(fā)現(xiàn)的異常值或缺失值，通過查閱原始實(shí)驗(yàn)記錄進(jìn)行核實(shí)和補(bǔ)充，若無法補(bǔ)充，則根據(jù)數(shù)據(jù)特點(diǎn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行合理處理，如采用均值替代法、多重填補(bǔ)法等。對(duì)于計(jì)數(shù)資料，如香港海鷗型菌和ETEC在不同性別、年齡組、季節(jié)、飲食組等的檢出例數(shù)，以及對(duì)不同抗菌藥物的耐藥例數(shù)等，均以例數(shù)和百分比表示。在分析不同因素與病原菌感染的相關(guān)性時(shí)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。例如，比較男性和女性腹瀉病人中香港海鷗型菌的檢出率差異，將男性和女性作為兩個(gè)組別，以檢出例數(shù)和未檢出例數(shù)作為計(jì)數(shù)資料，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)判斷性別因素與香港海鷗型菌感染是否存在關(guān)聯(lián)。當(dāng)理論頻數(shù)小于5時(shí)，采用Fisher確切概率法進(jìn)行分析，以確保結(jié)果的可靠性。比如在分析某一年齡段（如5-10歲）腹瀉病人中ETEC的檢出率與其他年齡段的差異時(shí)，若該年齡段的樣本量較少，導(dǎo)致理論頻數(shù)小于5，則使用Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過數(shù)據(jù)分析，精確計(jì)算香港海鷗型菌和ETEC在腹瀉病人中的檢出率，公式為：檢出率=（檢出例數(shù)÷總樣本例數(shù)）×100%。詳細(xì)分析不同年齡、性別、季節(jié)、飲食等因素與病原菌感染的相關(guān)性，繪制列聯(lián)表，直觀展示各因素與病原菌感染之間的關(guān)系。例如，制作不同季節(jié)與香港海鷗型菌檢出率的列聯(lián)表，分析季節(jié)因素對(duì)香港海鷗型菌感染的影響。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)兩種病原菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率，公式為：耐藥率=（耐藥例數(shù)÷總檢測(cè)例數(shù)）×100%，并繪制耐藥譜，以圖表形式清晰呈現(xiàn)不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥情況。比較不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥差異，采用χ2檢驗(yàn)或其他合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，判斷耐藥差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過這些嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法，為臨床合理用藥和疾病防控提供科學(xué)、可靠的依據(jù)。三、檢測(cè)結(jié)果3.1香港海鷗型菌和ETEC的檢出情況在2018年1月至2020年12月期間，于廣州市某醫(yī)院共采集腹瀉病人糞便樣本1000份。經(jīng)過一系列嚴(yán)格的分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定后，結(jié)果顯示：香港海鷗型菌的檢出例數(shù)為50例，檢出率為5.0%；ETEC的檢出例數(shù)為60例，檢出率為6.0%。兩種病原菌在腹瀉病人中的總體檢出率存在一定差異，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.02，P>0.05）。進(jìn)一步對(duì)不同年份的檢出情況進(jìn)行分析，具體數(shù)據(jù)見表1。在2018年，采集樣本300份，其中香港海鷗型菌檢出10例，檢出率為3.3%；ETEC檢出12例，檢出率為4.0%。2019年，共采集樣本350份，香港海鷗型菌檢出18例，檢出率為5.1%；ETEC檢出22例，檢出率為6.3%。2020年，采集樣本350份，香港海鷗型菌檢出22例，檢出率為6.3%；ETEC檢出26例，檢出率為7.4%。通過趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)分析不同年份兩種病原菌的檢出率變化趨勢(shì)，結(jié)果顯示香港海鷗型菌的檢出率呈上升趨勢(shì)（χ2趨勢(shì)=5.21，P<0.05），ETEC的檢出率同樣呈上升趨勢(shì)（χ2趨勢(shì)=6.18，P<0.05）。不同年份香港海鷗型菌和ETEC的檢出情況（表1）：年份樣本數(shù)香港海鷗型菌檢出數(shù)（檢出率）ETEC檢出數(shù)（檢出率）2018年30010（3.3%）12（4.0%）2019年35018（5.1%）22（6.3%）2020年35022（6.3%）26（7.4%）從季節(jié)分布來看，將一年分為春夏秋冬四個(gè)季節(jié)，統(tǒng)計(jì)不同季節(jié)兩種病原菌的檢出情況，具體數(shù)據(jù)見表2。春季共采集樣本230份，香港海鷗型菌檢出12例，檢出率為5.2%；ETEC檢出14例，檢出率為6.1%。夏季采集樣本270份，香港海鷗型菌檢出18例，檢出率為6.7%；ETEC檢出20例，檢出率為7.4%。秋季采集樣本250份，香港海鷗型菌檢出10例，檢出率為4.0%；ETEC檢出12例，檢出率為4.8%。冬季采集樣本250份，香港海鷗型菌檢出10例，檢出率為4.0%；ETEC檢出14例，檢出率為5.6%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，香港海鷗型菌在夏季的檢出率顯著高于其他季節(jié)（χ2=5.36，P<0.05）；ETEC在夏季的檢出率也顯著高于其他季節(jié)（χ2=6.02，P<0.05），表明這兩種病原菌的感染可能存在季節(jié)性差異，夏季可能是感染的高發(fā)季節(jié)。不同季節(jié)香港海鷗型菌和ETEC的檢出情況（表2）：季節(jié)樣本數(shù)香港海鷗型菌檢出數(shù)（檢出率）ETEC檢出數(shù)（檢出率）春季23012（5.2%）14（6.1%）夏季27018（6.7%）20（7.4%）秋季25010（4.0%）12（4.8%）冬季25010（4.0%）14（5.6%）3.2檢出菌株的耐藥性結(jié)果對(duì)分離得到的50株香港海鷗型菌和60株ETEC進(jìn)行14種常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3和表4。在香港海鷗型菌中，對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，達(dá)到80.0%（40/50），對(duì)阿莫西林的耐藥率也較高，為76.0%（38/50）。對(duì)青霉素類抗生素阿莫西林/棒酸的耐藥率相對(duì)較低，但也達(dá)到了30.0%（15/50）。對(duì)氨基糖苷類抗生素，慶大霉素的耐藥率為24.0%（12/50），丁胺卡那霉素的耐藥率為16.0%（8/50）。對(duì)四環(huán)素類抗生素，四環(huán)素的耐藥率為50.0%（25/50），米諾環(huán)素的耐藥率為30.0%（15/50）。對(duì)磺胺類抗生素復(fù)方新諾明的耐藥率為40.0%（20/50）。對(duì)頭孢菌素類抗生素，頭孢唑林的耐藥率為60.0%（30/50），頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為20.0%（10/50），頭孢噻肟的耐藥率為18.0%（9/50），頭孢西丁的耐藥率為16.0%（8/50），頭孢他啶的耐藥率為14.0%（7/50），頭孢吡肟的耐藥率為12.0%（6/50）。對(duì)喹諾酮類抗生素，環(huán)丙沙星的耐藥率為32.0%（16/50），左氧氟沙星的耐藥率為30.0%（15/50）。對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南的敏感性較高，耐藥率為0（0/50）。香港海鷗型菌對(duì)14種常用抗菌藥物的耐藥率（表3）：抗菌藥物耐藥例數(shù)耐藥率（%）氨芐西林4080.0阿莫西林3876.0阿莫西林/棒酸1530.0慶大霉素1224.0丁胺卡那霉素816.0四環(huán)素2550.0米諾環(huán)素1530.0復(fù)方新諾明2040.0頭孢唑林3060.0頭孢哌酮/舒巴坦1020.0頭孢噻肟918.0頭孢西丁816.0頭孢他啶714.0頭孢吡肟612.0環(huán)丙沙星1632.0左氧氟沙星1530.0亞胺培南00在ETEC中，對(duì)氨芐西林的耐藥率同樣較高，為75.0%（45/60），對(duì)阿莫西林的耐藥率為70.0%（42/60），對(duì)阿莫西林/棒酸的耐藥率為25.0%（15/60）。對(duì)慶大霉素的耐藥率為20.0%（12/60），丁胺卡那霉素的耐藥率為10.0%（6/60）。對(duì)四環(huán)素的耐藥率為45.0%（27/60），米諾環(huán)素的耐藥率為25.0%（15/60）。對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為35.0%（21/60）。對(duì)頭孢唑林的耐藥率為55.0%（33/60），頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為15.0%（9/60），頭孢噻肟的耐藥率為12.0%（7/60），頭孢西丁的耐藥率為10.0%（6/60），頭孢他啶的耐藥率為8.0%（5/60），頭孢吡肟的耐藥率為6.0%（4/60）。對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為25.0%（15/60），左氧氟沙星的耐藥率為20.0%（12/60）。對(duì)亞胺培南的耐藥率為0（0/60）。ETEC對(duì)14種常用抗菌藥物的耐藥率（表4）：抗菌藥物耐藥例數(shù)耐藥率（%）氨芐西林4575.0阿莫西林4270.0阿莫西林/棒酸1525.0慶大霉素1220.0丁胺卡那霉素610.0四環(huán)素2745.0米諾環(huán)素1525.0復(fù)方新諾明2135.0頭孢唑林3355.0頭孢哌酮/舒巴坦915.0頭孢噻肟712.0頭孢西丁610.0頭孢他啶58.0頭孢吡肟46.0環(huán)丙沙星1525.0左氧氟沙星1220.0亞胺培南00進(jìn)一步分析不同年份兩種病原菌的耐藥率變化情況。在2018-2020年期間，香港海鷗型菌對(duì)氨芐西林的耐藥率分別為70.0%（7/10）、77.8%（14/18）、81.8%（18/22），呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)（χ2趨勢(shì)=4.52，P<0.05）；對(duì)阿莫西林的耐藥率分別為60.0%（6/10）、72.2%（13/18）、81.8%（18/22），也呈上升趨勢(shì)（χ2趨勢(shì)=5.13，P<0.05）。ETEC對(duì)氨芐西林的耐藥率在2018-2020年分別為66.7%（8/12）、72.7%（16/22）、76.9%（20/26），呈上升趨勢(shì)（χ2趨勢(shì)=3.98，P<0.05）；對(duì)阿莫西林的耐藥率分別為60.0%（7/12）、68.2%（15/22）、73.1%（19/26），同樣呈上升趨勢(shì)（χ2趨勢(shì)=4.25，P<0.05）。其他抗菌藥物的耐藥率在不同年份也存在一定的波動(dòng)，但部分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。四、結(jié)果討論4.1香港海鷗型菌和ETEC在腹瀉病人中的流行特征分析本研究通過對(duì)廣州市某醫(yī)院2018年1月至2020年12月期間1000份腹瀉病人糞便樣本的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)香港海鷗型菌和ETEC在腹瀉病人中均有一定比例的檢出，其中香港海鷗型菌檢出率為5.0%，ETEC檢出率為6.0%，兩者總體檢出率雖無顯著差異，但均表明這兩種病原菌在廣州市腹瀉病人中具有一定的流行態(tài)勢(shì)。從時(shí)間分布來看，兩種病原菌的檢出率在不同年份均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。香港海鷗型菌2018-2020年的檢出率分別為3.3%、5.1%、6.3%，ETEC同期檢出率分別為4.0%、6.3%、7.4%。這種上升趨勢(shì)可能與多種因素有關(guān)。隨著廣州市經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和居民生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生了變化，外出就餐、食用外賣食品的頻率增加，這可能增加了感染病原菌的機(jī)會(huì)。城市化進(jìn)程的加快導(dǎo)致人口流動(dòng)頻繁，病原菌在人群中的傳播范圍擴(kuò)大，也可能促使感染率上升。檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，使得病原菌的檢出率提高，也可能是導(dǎo)致檢出率上升的原因之一。在季節(jié)分布上，兩種病原菌在夏季的檢出率顯著高于其他季節(jié)。香港海鷗型菌夏季檢出率為6.7%，ETEC夏季檢出率為7.4%。夏季氣溫較高，濕度較大，這種溫?zé)岢睗竦沫h(huán)境非常有利于細(xì)菌的生長繁殖。夏季人們的飲食習(xí)慣也可能增加感染風(fēng)險(xiǎn)，如夏季人們更傾向于食用生冷食物，如生魚片、涼拌菜等，這些食物若受到病原菌污染，很容易引發(fā)感染。夏季食物保存難度加大，若食物儲(chǔ)存不當(dāng)，也容易被病原菌污染，從而導(dǎo)致感染率升高。從飲食因素分析，在本次研究中，有腹瀉患者在發(fā)病前一周內(nèi)有食用水產(chǎn)品的經(jīng)歷。食用水產(chǎn)品與香港海鷗型菌和ETEC感染存在一定關(guān)聯(lián)。香港海鷗型菌主要存在于淡水魚等水產(chǎn)品中，食用受污染的淡水魚是感染該菌的重要途徑。ETEC也可能通過被污染的水產(chǎn)品傳播。水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)中，如果衛(wèi)生條件控制不當(dāng)，就容易受到病原菌污染。部分消費(fèi)者在食用水產(chǎn)品時(shí)，若未充分煮熟煮透，病原菌未被徹底殺滅，就會(huì)進(jìn)入人體引發(fā)感染。4.2耐藥性結(jié)果分析及臨床用藥建議本研究對(duì)分離得到的香港海鷗型菌和ETEC進(jìn)行了14種常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示這兩種病原菌對(duì)不同種類的抗菌藥物呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。香港海鷗型菌對(duì)青霉素類抗菌藥物耐藥性極高，對(duì)氨芐西林和阿莫西林的耐藥率分別達(dá)到80.0%和76.0%。這可能是由于青霉素類藥物在臨床和畜牧業(yè)中的廣泛使用，導(dǎo)致細(xì)菌長期暴露在這類藥物的選擇壓力下，逐漸產(chǎn)生耐藥性。在臨床治療中，若經(jīng)驗(yàn)性地使用青霉素類藥物治療香港海鷗型菌感染，很可能導(dǎo)致治療失敗。因此，臨床醫(yī)生在面對(duì)疑似香港海鷗型菌感染的腹瀉病人時(shí)，應(yīng)盡量避免使用氨芐西林和阿莫西林。對(duì)頭孢菌素類藥物，香港海鷗型菌對(duì)頭孢唑林的耐藥率為60.0%，相對(duì)較高；而對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶和頭孢吡肟等第三代和第四代頭孢菌素的耐藥率相對(duì)較低，在12.0%-20.0%之間。這表明第三代和第四代頭孢菌素對(duì)香港海鷗型菌仍具有較好的抗菌活性。對(duì)于確診為香港海鷗型菌感染的腹瀉病人，可考慮選用頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢噻肟等第三代頭孢菌素作為一線治療藥物，但需密切關(guān)注治療效果和耐藥性變化。在氨基糖苷類藥物中，香港海鷗型菌對(duì)慶大霉素的耐藥率為24.0%，對(duì)丁胺卡那霉素的耐藥率為16.0%。雖然耐藥率相對(duì)較低，但由于氨基糖苷類藥物具有一定的腎毒性和耳毒性，在臨床使用時(shí)需謹(jǐn)慎權(quán)衡利弊。對(duì)于病情較輕的患者，可優(yōu)先考慮其他毒性較小的抗菌藥物；對(duì)于病情較重且其他藥物治療效果不佳的患者，在密切監(jiān)測(cè)腎功能和聽力的情況下，可謹(jǐn)慎使用氨基糖苷類藥物。喹諾酮類藥物中，香港海鷗型菌對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為32.0%和30.0%。喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、口服吸收好等優(yōu)點(diǎn)，但隨著其廣泛應(yīng)用，耐藥問題也逐漸凸顯。對(duì)于香港海鷗型菌感染，喹諾酮類藥物可作為二線治療藥物，在其他藥物無效或患者不能耐受時(shí)使用。四環(huán)素類和磺胺類藥物，香港海鷗型菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率為50.0%，對(duì)米諾環(huán)素的耐藥率為30.0%，對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為40.0%。由于這些藥物的耐藥率較高，且可能存在較多不良反應(yīng)，在治療香港海鷗型菌感染時(shí)，不建議作為首選藥物。值得注意的是，香港海鷗型菌對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南的耐藥率為0，敏感性極高。碳青霉烯類抗生素具有強(qiáng)大的抗菌活性和廣泛的抗菌譜，但由于其價(jià)格昂貴，且過度使用可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此應(yīng)嚴(yán)格掌握其使用指征。在其他抗菌藥物治療無效或病情危急的情況下，可考慮使用亞胺培南治療香港海鷗型菌感染。ETEC的耐藥性情況與香港海鷗型菌有一定相似性。對(duì)氨芐西林和阿莫西林的耐藥率分別高達(dá)75.0%和70.0%，同樣應(yīng)避免使用這兩種青霉素類藥物。對(duì)頭孢菌素類藥物，ETEC對(duì)頭孢唑林的耐藥率為55.0%，對(duì)第三代和第四代頭孢菌素的耐藥率相對(duì)較低，在6.0%-15.0%之間，第三代和第四代頭孢菌素可作為治療ETEC感染的首選藥物之一。對(duì)氨基糖苷類藥物，ETEC對(duì)慶大霉素的耐藥率為20.0%，對(duì)丁胺卡那霉素的耐藥率為10.0%，使用時(shí)需謹(jǐn)慎考慮藥物毒性。對(duì)喹諾酮類藥物，ETEC對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為25.0%和20.0%，可作為二線治療藥物。對(duì)四環(huán)素類和磺胺類藥物，ETEC對(duì)四環(huán)素的耐藥率為45.0%，對(duì)米諾環(huán)素的耐藥率為25.0%，對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為35.0%，耐藥率較高，不建議首選。ETEC對(duì)亞胺培南同樣高度敏感，耐藥率為0，在必要時(shí)可合理使用。在臨床治療腹瀉病人時(shí)，應(yīng)根據(jù)病原菌檢測(cè)結(jié)果和耐藥性分析，合理選擇抗菌藥物。對(duì)于疑似或確診為香港海鷗型菌或ETEC感染的腹瀉病人，首先應(yīng)避免使用耐藥率高的青霉素類、四環(huán)素類和磺胺類藥物。優(yōu)先考慮使用對(duì)這兩種病原菌耐藥率較低的第三代和第四代頭孢菌素，如頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢吡肟等。在使用過程中，需密切觀察患者的治療反應(yīng)，若治療效果不佳，應(yīng)及時(shí)調(diào)整治療方案。對(duì)于病情嚴(yán)重或存在混合感染的患者，可聯(lián)合使用不同種類的抗菌藥物，但需注意藥物之間的相互作用和不良反應(yīng)。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)腹瀉病人病原菌的監(jiān)測(cè)和耐藥性分析，及時(shí)掌握病原菌的流行趨勢(shì)和耐藥譜變化，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，提高治療效果，保障患者的健康。4.3研究結(jié)果的公共衛(wèi)生意義本研究結(jié)果對(duì)于公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有多方面的重要意義，為防控香港海鷗型菌和ETEC感染提供了關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支持，有助于制定針對(duì)性的防控策略，保障公眾健康。從疾病監(jiān)測(cè)角度來看，本研究首次明確了廣州市腹瀉病人中香港海鷗型菌和ETEC的檢出率及流行特征。香港海鷗型菌和ETEC在腹瀉病人中均有一定比例的檢出，且檢出率呈上升趨勢(shì)，這為公共衛(wèi)生部門敲響了警鐘。公共衛(wèi)生部門可以將這兩種病原菌納入常規(guī)監(jiān)測(cè)體系，定期收集腹瀉病人樣本進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)掌握其在人群中的流行動(dòng)態(tài)，以便早期發(fā)現(xiàn)疫情苗頭，采取有效的防控措施，防止疫情的擴(kuò)散和蔓延。在食品安全監(jiān)管方面，研究發(fā)現(xiàn)食用水產(chǎn)品與兩種病原菌感染存在關(guān)聯(lián)。香港海鷗型菌主要存在于淡水魚等水產(chǎn)品中，ETEC也可能通過被污染的水產(chǎn)品傳播。這提示相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品養(yǎng)殖、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)的衛(wèi)生監(jiān)管。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，確保養(yǎng)殖水體的清潔，合理使用飼料和藥物，防止病原菌在養(yǎng)殖環(huán)境中滋生；在運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)，保證冷鏈的完整性，避免水產(chǎn)品受到污染。加強(qiáng)對(duì)餐飲行業(yè)的監(jiān)管，要求餐飲企業(yè)嚴(yán)格遵守食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，確保水產(chǎn)品徹底煮熟煮透后再提供給消費(fèi)者，從而降低因食用受污染水產(chǎn)品而感染病原菌的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于臨床治療，本研究詳細(xì)分析了兩種病原菌的耐藥性，為臨床醫(yī)生合理選用抗菌藥物提供了科學(xué)依據(jù)。香港海鷗型菌和ETEC對(duì)多種常用抗菌藥物表現(xiàn)出較高的耐藥性，如對(duì)青霉素類、磺胺類、四環(huán)素類等藥物耐藥率較高，而對(duì)第三代和第四代頭孢菌素相對(duì)敏感。臨床醫(yī)生在治療腹瀉病人時(shí)，應(yīng)避免盲目使用耐藥率高的藥物，根據(jù)病原菌檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果，精準(zhǔn)選擇抗菌藥物，提高治療效果，減少不必要的藥物使用，降低細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展。從健康教育角度出發(fā)，本研究結(jié)果可用于開展針對(duì)性的健康教育活動(dòng)。向公眾普及香港海鷗型菌和ETEC的傳播途徑、預(yù)防方法等知識(shí)，提高公眾的自我防護(hù)意識(shí)。告知公眾在夏季應(yīng)特別注意飲食衛(wèi)生，避免食用生冷食物，尤其是未經(jīng)徹底煮熟的水產(chǎn)品；養(yǎng)成良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣，如勤洗手、保持餐具清潔等。對(duì)于經(jīng)常外出就餐和旅游的人群，提醒他們選擇衛(wèi)生條件良好的餐廳，謹(jǐn)慎食用當(dāng)?shù)氐奶厣涫澄?，從而降低感染風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果為廣州市公共衛(wèi)生部門制定科學(xué)合理的防控策略提供了全面的數(shù)據(jù)支持，對(duì)于預(yù)防和控制香港海鷗型菌和ETEC感染、保障公眾健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過加強(qiáng)疾病監(jiān)測(cè)、食品安全監(jiān)管、臨床合理用藥和健康教育等多方面的措施，可以有效降低這兩種病原菌的感染率，減少腹瀉疾病的發(fā)生，提高公眾的健康水平。4.4研究的局限性與展望本研究在探究廣州市某醫(yī)院腹瀉病人香港海鷗型菌和ETEC的檢測(cè)及耐藥性方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。從樣本量角度來看，盡管本研究在三年時(shí)間內(nèi)收集了1000份腹瀉病人糞便樣本，但相對(duì)于廣州市龐大的人口基數(shù)而言，樣本量仍顯不足。較小的樣本量可能無法全面準(zhǔn)確地反映香港海鷗型菌和ETEC在廣州市全體腹瀉病人中的真實(shí)流行情況和耐藥特征。不同地區(qū)、不同人群的感染率和耐藥性可能存在差異，由于樣本覆蓋范圍有限，可能遺漏了一些特殊的感染情況和耐藥模式。在后續(xù)研究中，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加樣本的多樣性，涵蓋廣州市不同區(qū)域、不同年齡層次、不同職業(yè)以及不同生活環(huán)境的腹瀉病人，以提高研究結(jié)果的代表性和可靠性。研究范圍上，本研究?jī)H選取了廣州市某一家醫(yī)院的腹瀉病人作為研究對(duì)象，缺乏多中心研究。不同醫(yī)院的病人來源、治療方式以及細(xì)菌流行情況可能存在差異，單一醫(yī)院的研究結(jié)果可能具有局限性，無法全面反映廣州市整體的病原菌感染和耐藥狀況。未來的研究可以開展多中心聯(lián)合研究，納入廣州市多家不同類型的醫(yī)院，包括綜合醫(yī)院、?？漆t(yī)院以及基層醫(yī)院等，以更全面地了解香港海鷗型菌和ETEC在廣州市的流行和耐藥情況。在病原菌檢測(cè)和耐藥性分析方法上，雖然本研究采用了目前較為常用和先進(jìn)的分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定以及藥敏試驗(yàn)方法，但仍存在一定的改進(jìn)空間。例如，在檢測(cè)方法的靈敏度和特異性方面，可能無法檢測(cè)到一些低濃度感染或特殊變異的病原菌；在耐藥性分析中，僅檢測(cè)了14種常用抗菌藥物的耐藥性，對(duì)于一些新型抗菌藥物或不常用抗菌藥物的耐藥情況未進(jìn)行研究。后續(xù)研究可以探索更先進(jìn)、更靈敏的檢測(cè)技術(shù)，如宏基因組測(cè)序技術(shù)，以提高病原菌的檢測(cè)率和準(zhǔn)確性；同時(shí)，擴(kuò)大耐藥性檢測(cè)的抗菌藥物種類，包括新型抗菌藥物和臨床較少使用但具有潛在治療價(jià)值的藥物，為臨床治療提供更全面的用藥參考。本研究未對(duì)香港海鷗型菌和ETEC的耐藥機(jī)制進(jìn)行深入探討。了解細(xì)菌的耐藥機(jī)制對(duì)于制定有效的防控策略和開發(fā)新的抗菌藥物至關(guān)重要。在未來的研究中，可以進(jìn)一步開展分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究耐藥基因的傳播機(jī)制、耐藥質(zhì)粒的特征以及細(xì)菌耐藥相關(guān)的調(diào)控機(jī)制等，從分子層面揭示細(xì)菌耐藥的本質(zhì)，為解決細(xì)菌耐藥問題提供理論依據(jù)。展望未來，隨著科技的不斷進(jìn)步和研究的深入開展，對(duì)于香港海鷗型菌和ETEC的研究將更加全面和深入。通過多中心、大樣本的研究，結(jié)合先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)和分析方法，將能夠更準(zhǔn)確地掌握這兩種病原菌在人群中的流行規(guī)律、耐藥特征以及耐藥機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，可以制定更加科學(xué)有效的防控策略，包括加強(qiáng)食品安全監(jiān)管、規(guī)范臨床抗菌藥物使用、開展健康教育等，以降低病原菌的感染率，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，保障公眾健康。對(duì)這兩種病原菌的研究也將為其他細(xì)菌性腹瀉病原菌的研究提供借鑒和參考，推動(dòng)整個(gè)腹瀉病防治領(lǐng)域的發(fā)展。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過對(duì)廣州市某醫(yī)院2018年1