廣西寵物犬星狀病毒的分子流行病學(xué)與ORF2基因探秘：現(xiàn)狀、特征與進化分析一、引言1.1研究背景與意義隨著人們生活水平的提高，寵物犬在家庭中的地位日益重要，其健康問題也受到廣泛關(guān)注。犬星狀病毒（CanineAstrovirus，CAstV）作為引發(fā)犬胃腸炎疾病的病原之一，近年來逐漸進入人們的視野。CAstV屬于星狀病毒科哺乳動物星狀病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒，呈圓形，主要通過糞-口途徑經(jīng)消化道傳播，被污染的食物和水是常見的傳播媒介。在哺乳動物中，星狀病毒通常與腸道疾病相關(guān)，感染犬星狀病毒的寵物犬常出現(xiàn)腹瀉、腹痛和嘔吐等癥狀，7周齡以下的幼犬由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，更容易感染該病毒。而且，犬星狀病毒還可能與犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬細(xì)小病毒等其他病毒伴發(fā)感染。這種混合感染會使病情變得更加復(fù)雜和嚴(yán)重，顯著增加犬的死亡率，不僅威脅寵物犬的生命健康，也給寵物飼養(yǎng)者帶來了精神和經(jīng)濟上的雙重負(fù)擔(dān)。目前，雖然對犬星狀病毒已有一定研究，但該病原在寵物犬中的臨床表現(xiàn)形式及其流行規(guī)律尚未完全清楚。不同地區(qū)的氣候、環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式以及寵物犬的品種、年齡、免疫狀況等因素，都可能影響犬星狀病毒的流行和傳播。廣西地區(qū)具有獨特的地理環(huán)境和氣候條件，溫暖濕潤的氣候為病毒的生存和傳播提供了適宜的環(huán)境。同時，廣西的寵物犬養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，寵物交易頻繁，這也增加了病毒傳播的風(fēng)險。了解廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的分子流行病學(xué)特征，對于掌握該病毒在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r、制定針對性的防控措施具有重要意義。通過對ORF2基因序列分析，可以深入了解病毒的遺傳進化關(guān)系和變異規(guī)律，為疫苗和診斷試劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。一方面，精準(zhǔn)的分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果能夠幫助獸醫(yī)及時發(fā)現(xiàn)疫情的爆發(fā)點和傳播途徑，采取有效的隔離、消毒等防控措施，降低病毒在寵物犬群體中的傳播風(fēng)險。另一方面，對ORF2基因序列的深入研究有助于開發(fā)更加敏感、特異的診斷方法，實現(xiàn)對犬星狀病毒感染的早期診斷和精準(zhǔn)治療，從而提高寵物犬的治愈率，保障寵物犬的健康，促進廣西寵物犬養(yǎng)殖和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀自1975年首次在腹瀉兒童糞便中發(fā)現(xiàn)星狀病毒以來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞星狀病毒開展了大量研究。在犬星狀病毒研究方面，國外起步相對較早，早期研究主要集中在病毒的分離鑒定與基本生物學(xué)特性方面。通過細(xì)胞培養(yǎng)和電鏡觀察等技術(shù)，明確了犬星狀病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，即病毒粒子呈二十面體對稱，直徑約為28-30nm，表面有5-6個星狀突起，在氯化銫中的浮力密度約為1.33-1.34g/cm3，對乙醚、氯仿等脂溶劑不敏感。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，國外研究逐漸深入到基因?qū)用?。通過對犬星狀病毒全基因組測序與分析，揭示了其基因組結(jié)構(gòu)。犬星狀病毒基因組為單股正鏈RNA，長度約為6.8-7.9kb，包含3個開放閱讀框（ORF），分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白、RNA依賴的RNA聚合酶和衣殼蛋白。不同地區(qū)分離的犬星狀病毒在基因序列上存在一定差異，基于ORF1b和ORF2基因的遺傳進化分析，將犬星狀病毒分為多個基因型，不同基因型在地域分布和致病性上表現(xiàn)出一定特點。在流行病學(xué)研究方面，國外多個國家開展了犬星狀病毒的血清學(xué)調(diào)查和分子流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，犬星狀病毒在犬群中普遍存在，感染率因地區(qū)、飼養(yǎng)環(huán)境和犬的年齡等因素而異。例如，在一些歐美國家，寵物犬的感染率在10%-30%之間，幼犬的感染率明顯高于成年犬，且在腹瀉犬中的檢出率顯著高于健康犬。此外，還發(fā)現(xiàn)犬星狀病毒與其他腸道病毒的混合感染較為常見，混合感染會加重犬的病情，增加治療難度。國內(nèi)對犬星狀病毒的研究相對較晚，但近年來發(fā)展迅速。早期研究主要借鑒國外的檢測方法，對國內(nèi)部分地區(qū)犬群進行了初步的流行病學(xué)調(diào)查。例如，在部分城市的寵物醫(yī)院和養(yǎng)殖場采集犬糞便樣本，利用RT-PCR等技術(shù)檢測犬星狀病毒，發(fā)現(xiàn)我國犬群中也存在一定比例的感染。一些研究表明，我國不同地區(qū)寵物犬的感染率在5%-35%之間，與國外報道的感染率范圍有一定重疊。在基因序列分析方面，國內(nèi)學(xué)者對部分分離株的ORF2基因進行了克隆和測序，分析其遺傳變異特征。結(jié)果顯示，我國犬星狀病毒分離株與國外參考毒株在基因序列上存在一定的同源性，但也有獨特的變異位點，表明我國犬星狀病毒在進化過程中受到地域和宿主等因素的影響。同時，通過構(gòu)建遺傳進化樹，探討了我國犬星狀病毒與其他地區(qū)毒株的親緣關(guān)系，為深入了解病毒的傳播和進化規(guī)律提供了依據(jù)。然而，目前關(guān)于廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的研究相對較少。雖然已有研究初步調(diào)查了廣西南寧市寵物犬星狀病毒的感染情況，但研究范圍較為局限，僅涉及部分地區(qū)和少數(shù)樣本，對于該病毒在廣西全區(qū)寵物犬中的流行特征、基因型分布以及與其他病毒的混合感染情況等方面仍缺乏全面、系統(tǒng)的研究。在ORF2基因序列分析方面，尚未有針對廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的深入研究，無法明確該地區(qū)病毒株的遺傳進化特點及其與其他地區(qū)毒株的差異。本研究旨在填補這些空白，為廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的防控和相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過對廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒進行全面的分子流行病學(xué)調(diào)查，揭示其在寵物犬群體中的流行特征，并對ORF2基因序列進行深入分析，了解其遺傳進化規(guī)律和變異特點。在研究內(nèi)容上，首先要進行樣本采集，計劃在廣西全區(qū)范圍內(nèi)，包括南寧、柳州、桂林、梧州、北海等多個城市的寵物醫(yī)院、寵物養(yǎng)殖場以及流浪動物救助站，采集寵物犬糞便樣本。根據(jù)不同地區(qū)的寵物犬?dāng)?shù)量、飼養(yǎng)環(huán)境和疫病流行情況，確定合理的采樣數(shù)量和分布，以確保樣本具有代表性。預(yù)計采集500-800份糞便樣本，涵蓋不同品種、性別、年齡的寵物犬。其次，要對樣本進行檢測與數(shù)據(jù)分析，利用RT-PCR技術(shù)對采集的糞便樣本進行犬星狀病毒核酸檢測，優(yōu)化反應(yīng)條件，確保檢測的靈敏度和特異性。對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的總體感染率，分析不同地區(qū)、品種、性別、年齡寵物犬的感染差異，探討感染率與飼養(yǎng)環(huán)境、免疫狀況等因素的相關(guān)性。同時，調(diào)查犬星狀病毒與犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬細(xì)小病毒等其他常見病毒的混合感染情況，分析混合感染對寵物犬健康的影響。再者，對ORF2基因進行擴增與測序，選取部分犬星狀病毒陽性樣本，通過RT-PCR擴增ORF2基因片段，優(yōu)化擴增條件，確保擴增產(chǎn)物的質(zhì)量和純度。對擴增得到的ORF2基因片段進行測序，采用Sanger測序或高通量測序技術(shù)，獲得高質(zhì)量的基因序列數(shù)據(jù)。最后，進行基因序列分析，將測序得到的ORF2基因序列與GenBank中已公布的犬星狀病毒參考序列進行比對，分析廣西地區(qū)毒株與其他地區(qū)毒株的同源性，確定其在遺傳進化樹中的位置。通過構(gòu)建遺傳進化樹，研究廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的遺傳進化關(guān)系，探討其進化起源和傳播途徑。分析ORF2基因的變異位點和變異類型，研究變異對病毒生物學(xué)特性和致病性的影響。二、材料與方法2.1樣本采集樣本采集工作于[具體年份]的[具體月份區(qū)間]展開，這一時期廣西地區(qū)氣候相對穩(wěn)定，寵物犬活動較為頻繁，且各類寵物交易、養(yǎng)殖活動正常開展，能夠較好地反映全年寵物犬的健康狀況及病毒感染情況。在地域選擇上，綜合考慮廣西地區(qū)的地理分布、經(jīng)濟發(fā)展水平以及寵物犬養(yǎng)殖和交易的活躍程度，選取了南寧、柳州、桂林、梧州、北海、欽州、防城港、貴港、玉林、百色、賀州、河池、來賓、崇左這14個城市。其中，南寧作為廣西的首府，寵物犬?dāng)?shù)量眾多，寵物醫(yī)院和養(yǎng)殖場密集，是重要的采樣點；柳州、桂林等城市經(jīng)濟較為發(fā)達，寵物市場活躍，也具有代表性；而防城港、欽州等沿海城市以及百色、河池等山區(qū)城市，因其獨特的地理環(huán)境和氣候條件，可能對寵物犬星狀病毒的流行產(chǎn)生影響，同樣被納入采樣范圍。樣本來源涵蓋寵物醫(yī)院、寵物養(yǎng)殖場以及流浪動物救助站。在寵物醫(yī)院，主要采集前來就診且有腹瀉、嘔吐等疑似胃腸道癥狀的寵物犬糞便樣本，同時也采集部分無癥狀寵物犬的糞便作為對照，以了解病毒在健康犬中的攜帶情況。寵物養(yǎng)殖場則選取規(guī)模較大、養(yǎng)殖管理相對規(guī)范的場所以及一些小型散養(yǎng)戶，采集不同批次、不同年齡段寵物犬的糞便樣本，以反映養(yǎng)殖場內(nèi)犬星狀病毒的流行態(tài)勢。流浪動物救助站的流浪犬生活環(huán)境相對復(fù)雜，免疫力參差不齊，是病毒傳播的潛在風(fēng)險群體，因此也采集了一定數(shù)量的糞便樣本。在每個城市，按照不同樣本來源進行分層抽樣。計劃在每個城市的寵物醫(yī)院采集50-80份樣本，寵物養(yǎng)殖場采集30-50份樣本，流浪動物救助站采集20-30份樣本。最終，共采集得到700份寵物犬糞便樣本。在采集過程中，使用無菌棉簽蘸取糞便樣本，放入含有1mlPBS緩沖液（pH7.4，含青霉素100U/mL、鏈霉素0.1mg/mL）的無菌離心管中，充分?jǐn)嚢杌靹?，使糞便與緩沖液充分接觸。標(biāo)記好樣本的采集地點、時間、寵物犬的品種、性別、年齡等信息，將樣本置于冰盒中保存，并在24小時內(nèi)送至實驗室進行處理。若不能及時檢測，將樣本保存在-80℃冰箱中，以防止病毒核酸降解。2.2主要試劑與儀器在本次研究中，主要試劑包括核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增相關(guān)試劑以及其他輔助試劑。核酸提取選用[具體品牌]的病毒核酸提取試劑盒，貨號為[具體貨號]，該試劑盒采用硅膠膜離心柱技術(shù)，能夠高效、快速地從糞便樣本中提取病毒核酸，具有操作簡便、提取純度高的特點，可有效去除雜質(zhì)和抑制劑，確保后續(xù)檢測的準(zhǔn)確性。反轉(zhuǎn)錄過程使用[具體品牌]的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，貨號為[具體貨號]。該試劑盒包含了反轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和緩沖液，如逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑等，能夠?qū)⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其高效的反轉(zhuǎn)錄活性和良好的穩(wěn)定性為后續(xù)的PCR擴增提供了高質(zhì)量的模板。PCR擴增試劑中，選用[具體品牌]的rTaqDNA聚合酶，貨號為[具體貨號]，該酶具有高保真度和高效擴增能力，能夠在較短時間內(nèi)擴增出目的基因片段，且具有較低的錯配率，保證了擴增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）購自[具體品牌]，貨號為[具體貨號]，其質(zhì)量穩(wěn)定，可滿足PCR反應(yīng)對核苷酸的需求。MgCl?溶液用于優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，調(diào)整鎂離子濃度，以提高擴增效率，購自[具體品牌]，貨號為[具體貨號]。引物由[引物合成公司名稱]合成，正向引物CaAstV-F序列為5'-GAGTTTGATTGGACCAGATTTGA-3'，反向引物CaAstV-R序列為5'-GGCTTAACCCACATTCCAAA-3'，預(yù)期擴增片段大小為419bp。這對引物是根據(jù)犬星狀病毒保守區(qū)域設(shè)計，具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確擴增出犬星狀病毒的目標(biāo)基因片段。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)選用[具體品牌]的DL2000DNAMarker，貨號為[具體貨號]，其包含了不同大小的DNA片段，可用于在瓊脂糖凝膠電泳中判斷PCR擴增產(chǎn)物的大小。實驗中使用的其他輔助試劑，如0.01MPBS緩沖液（pH7.4，含青霉素100U/mL、鏈霉素0.1mg/mL）用于糞便樣本的稀釋和保存，按照附錄A中的A.1方法進行配制；TAE電泳緩沖液用于瓊脂糖凝膠電泳，按照附錄A中的A.2方法配制；2%瓊脂糖凝膠用于分離PCR擴增產(chǎn)物，按照附錄A中的A.3方法配制；Goldview核酸染料用于在紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。主要儀器包括PCR儀、高速冷凍離心機、核酸蛋白測定儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)等。PCR儀采用[具體品牌]的[具體型號]，具有溫度控制精確、升降溫速度快的特點，能夠滿足不同PCR反應(yīng)程序的需求，可同時進行多個樣本的擴增反應(yīng)。高速冷凍離心機為[具體品牌]的[具體型號]，最大轉(zhuǎn)速可達[具體轉(zhuǎn)速]，可在低溫條件下對樣本進行離心，用于核酸提取過程中的分離和沉淀步驟，確保樣本的完整性和純度。核酸蛋白測定儀選用[具體品牌]的[具體型號]，可準(zhǔn)確測定核酸和蛋白質(zhì)的濃度及純度，為實驗提供可靠的數(shù)據(jù)支持。電泳儀為[具體品牌]的[具體型號]，能夠提供穩(wěn)定的電場強度，保證DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速度和分離效果。凝膠成像系統(tǒng)采用[具體品牌]的[具體型號]，可對電泳后的瓊脂糖凝膠進行拍照和分析，清晰顯示DNA條帶，便于結(jié)果的觀察和記錄。2.3分子流行病學(xué)調(diào)查方法本研究采用RT-套式PCR（ReverseTranscription-NestedPCR）技術(shù)對采集的寵物犬糞便樣本進行犬星狀病毒核酸檢測。RT-套式PCR技術(shù)是在常規(guī)RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來，它通過兩輪PCR擴增來提高檢測的靈敏度和特異性。第一輪PCR擴增出目的基因的一個較大片段，然后以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板，用位于第一輪引物內(nèi)側(cè)的另一對引物進行第二輪PCR擴增，進一步擴增出目的基因的特異性片段。這種方法能夠有效減少非特異性擴增產(chǎn)物的干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性，尤其適用于低含量病毒核酸的檢測。核酸提取是RT-套式PCR檢測的關(guān)鍵步驟之一，其質(zhì)量直接影響后續(xù)檢測結(jié)果。使用[具體品牌]的病毒核酸提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。取200μL糞便樣本與PBS緩沖液的混合液加入到核酸提取試劑盒的裂解液中，充分振蕩混勻，使病毒粒子破裂釋放出核酸。將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，使核酸吸附在硅膠膜上。依次用洗滌液1和洗滌液2對吸附柱進行洗滌，去除雜質(zhì)和抑制劑。最后，向吸附柱中加入50μL洗脫緩沖液，室溫靜置2-3分鐘，12000rpm離心1分鐘，將洗脫的核酸收集到離心管中，得到的核酸提取物用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄過程使用[具體品牌]的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。在一個無RNA酶的離心管中，加入5μL提取的核酸、1μL隨機引物（10μM）、1μLdNTPs（10mM），輕輕混勻后，65℃孵育5分鐘，然后迅速置于冰上冷卻。再加入4μL5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1μLRNA酶抑制劑（40U/μL）、1μL逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL），輕輕混勻，總體積為20μL。將離心管放入PCR儀中，按照以下程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃孵育60分鐘，70℃孵育10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA產(chǎn)物可在-20℃保存?zhèn)溆?。第一輪PCR擴增體系總體積為25μL，包括5μLcDNA模板、2.5μL10×PCR緩沖液、2μLMgCl?（25mM）、0.5μLdNTPs（10mM）、0.5μL正向引物CaAstV-F（10μM）、0.5μL反向引物CaAstV-R（10μM）、0.25μLrTaqDNA聚合酶（5U/μL）以及13.75μL滅菌去離子水。將各成分依次加入到無核酸酶的PCR管中，輕輕混勻，瞬時離心。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。第二輪PCR擴增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，擴增體系和反應(yīng)程序與第一輪類似，但引物使用巢式引物。巢式引物的設(shè)計是基于第一輪引物擴增區(qū)域內(nèi)的更保守序列，正向巢式引物CaAstV-Nested-F序列為5'-TGGACCAGATTTGATGGACAA-3'，反向巢式引物CaAstV-Nested-R序列為5'-CATTCCAAAGAGTCTGGTGGA-3'，預(yù)期擴增片段大小為256bp。第二輪PCR擴增體系總體積同樣為25μL，其中模板使用第一輪PCR產(chǎn)物1μL，其余成分與第一輪相同。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。在操作過程中，需嚴(yán)格遵守實驗室生物安全規(guī)范。核酸提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增應(yīng)在不同的實驗區(qū)域進行，以防止交叉污染。使用帶濾芯的吸頭，避免移液器污染試劑和樣本。每次實驗都要設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照使用已知含有犬星狀病毒核酸的樣本，陰性對照使用滅菌去離子水。陽性對照應(yīng)出現(xiàn)特異性擴增條帶，陰性對照無擴增條帶，以此來驗證實驗結(jié)果的可靠性。若實驗過程中出現(xiàn)污染或異常結(jié)果，應(yīng)及時查找原因并重新進行實驗。2.4ORF2基因序列分析方法2.4.1ORF2基因擴增在完成分子流行病學(xué)調(diào)查，確定犬星狀病毒陽性樣本后，選取30份陽性樣本進行ORF2基因擴增。根據(jù)GenBank中已公布的犬星狀病毒ORF2基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。正向引物ORF2-F序列為5'-ATGGTGCTGATGGAGAAGAA-3'，反向引物ORF2-R序列為5'-TTAGCCACTGTGGCTGAAAC-3'，預(yù)期擴增片段大小為1800bp左右。引物由[引物合成公司名稱]合成。擴增體系總體積為50μL，包括10μLcDNA模板、5μL10×PCR緩沖液、4μLMgCl?（25mM）、1μLdNTPs（10mM）、1μL正向引物ORF2-F（10μM）、1μL反向引物ORF2-R（10μM）、0.5μLrTaqDNA聚合酶（5U/μL）以及27.5μL滅菌去離子水。將各成分依次加入到無核酸酶的PCR管中，輕輕混勻，瞬時離心。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。為確保擴增的準(zhǔn)確性，每次實驗均設(shè)置陽性對照和陰性對照。陽性對照使用已知含有犬星狀病毒ORF2基因的質(zhì)粒DNA，陰性對照使用滅菌去離子水代替模板。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，若陽性對照出現(xiàn)特異性擴增條帶，陰性對照無擴增條帶，且目的條帶大小與預(yù)期相符，則表明擴增成功。2.4.2測序與序列獲取將擴增得到的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，使用[具體品牌]的凝膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書進行回收純化。該試劑盒利用硅膠膜特異性吸附DNA的原理，通過一系列洗滌步驟去除雜質(zhì)，最終得到高純度的DNA片段?；厥蘸蟮腄NA片段使用Nanodrop2000核酸蛋白測定儀測定濃度和純度，確保濃度在50-200ng/μL之間，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證測序質(zhì)量。將純化后的ORF2基因片段送至[測序公司名稱]進行測序。測序采用Sanger測序法，該方法是一種經(jīng)典的DNA測序技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、可靠性強的特點。測序公司利用雙脫氧核苷酸終止法，在DNA聚合酶的作用下，以引物為起始點，合成與模板DNA互補的新鏈。在反應(yīng)體系中加入少量帶有熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，當(dāng)雙脫氧核苷酸摻入到新合成的DNA鏈中時，DNA鏈的延伸會終止。通過毛細(xì)管電泳分離不同長度的DNA片段，并根據(jù)熒光信號讀取DNA序列。測序完成后，測序公司會提供原始測序數(shù)據(jù)，以abi格式文件保存。使用Chromas軟件打開abi文件，人工校對測序峰圖，去除低質(zhì)量的序列末端和模糊不清的堿基。將校對后的序列保存為fasta格式文件，以便后續(xù)進行序列分析。2.4.3序列比對與同源性分析將獲得的廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒ORF2基因序列與GenBank中已公布的來自不同地區(qū)的犬星狀病毒ORF2基因參考序列進行比對分析。參考序列的選擇充分考慮了地域分布的廣泛性，包括美國、歐洲、亞洲等多個國家和地區(qū)的代表性毒株，如美國的CAstV-USA株、歐洲的CAstV-EU株、日本的CAstV-JP株等，共計選取30條參考序列。利用ClustalW軟件進行多序列比對。該軟件是一種常用的多序列比對工具，它基于漸進比對的原理，首先將序列兩兩比對，計算它們之間的相似性得分，然后根據(jù)相似性得分構(gòu)建一個系統(tǒng)發(fā)育樹。按照系統(tǒng)發(fā)育樹的分支順序，逐步將序列進行比對，最終得到多序列比對結(jié)果。在比對過程中，設(shè)置Gap開放罰分（Gapopeningpenalty）為15，Gap延伸罰分（Gapextensionpenalty）為6.66，以優(yōu)化比對結(jié)果。通過比對結(jié)果，使用MEGA7.0軟件計算廣西地區(qū)毒株與參考毒株之間的核苷酸同源性和氨基酸同源性。核苷酸同源性反映了不同毒株ORF2基因核苷酸序列的相似程度，氨基酸同源性則反映了它們編碼的蛋白質(zhì)序列的相似程度。同源性的計算采用Kimura2-parameter模型，該模型考慮了堿基轉(zhuǎn)換和顛換的不同頻率，能夠更準(zhǔn)確地估計序列之間的進化距離。通過同源性分析，了解廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒與其他地區(qū)毒株的遺傳關(guān)系，確定其在遺傳進化上的地位。2.4.4遺傳進化樹構(gòu)建為深入研究廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒ORF2基因的遺傳進化關(guān)系，基于多序列比對結(jié)果，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建遺傳進化樹。采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建進化樹，該方法是一種基于距離矩陣的聚類算法，它通過計算序列之間的進化距離，逐步合并距離最近的序列，最終構(gòu)建出進化樹。在構(gòu)建過程中，進行1000次自展檢驗（Bootstraptest），以評估進化樹分支的可靠性。自展檢驗是一種統(tǒng)計方法，它通過對原始數(shù)據(jù)進行多次重抽樣，構(gòu)建多個進化樹，統(tǒng)計每個分支在這些進化樹中出現(xiàn)的頻率。如果一個分支的自展值較高（通常大于70%），則表明該分支在進化關(guān)系上較為可靠。將構(gòu)建好的遺傳進化樹以圖片形式輸出，使用FigTree軟件進行編輯和美化。在進化樹中，不同的分支代表不同的遺傳進化分支，分支的長度表示進化距離，節(jié)點上的數(shù)字表示自展值。通過分析進化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可以直觀地了解廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒與其他地區(qū)毒株的親緣關(guān)系，推測其進化起源和傳播途徑。例如，如果廣西地區(qū)的毒株與某個地區(qū)的參考毒株在進化樹上處于同一分支，且自展值較高，則說明它們可能具有共同的祖先，存在密切的遺傳關(guān)系，進而推測該地區(qū)毒株可能通過寵物交易、運輸?shù)确绞絺鞑サ綇V西地區(qū)。三、廣西寵物犬星狀病毒分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果3.1總體感染情況對采集的700份寵物犬糞便樣本進行RT-套式PCR檢測，結(jié)果顯示，陽性樣本為186份，廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒總體陽性率為26.57%（186/700）。這一結(jié)果表明，犬星狀病毒在廣西寵物犬群體中存在較為普遍的感染情況，對寵物犬的健康構(gòu)成一定威脅。與國內(nèi)其他地區(qū)的研究結(jié)果相比，廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的感染率處于中等水平。例如，有研究報道北京地區(qū)寵物犬星狀病毒感染率為20.5%，而在廣東部分地區(qū)，感染率則達到30.8%。這種地區(qū)間感染率的差異可能與多種因素有關(guān)，包括當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、寵物犬的飼養(yǎng)管理方式、病毒的傳播途徑以及檢測方法的敏感性等。廣西地區(qū)溫暖濕潤的氣候為病毒的生存和傳播提供了有利條件，寵物犬在戶外活動時更容易接觸到被病毒污染的環(huán)境。一些寵物養(yǎng)殖場和寵物醫(yī)院的衛(wèi)生管理措施不夠嚴(yán)格，人員和寵物的流動頻繁，也增加了病毒傳播的風(fēng)險。此外，不同地區(qū)寵物犬的品種構(gòu)成和免疫狀況也可能影響病毒的感染率。一些品種的寵物犬可能對犬星狀病毒具有較高的易感性，而免疫接種可以有效降低感染的風(fēng)險。從不同樣本來源的感染情況來看，寵物醫(yī)院采集的樣本陽性率為32.00%（128/400），寵物養(yǎng)殖場樣本陽性率為20.00%（60/300），流浪動物救助站樣本陽性率為21.67%（18/83）。寵物醫(yī)院樣本陽性率較高，可能是因為前來就診的寵物犬大多已經(jīng)出現(xiàn)了臨床癥狀，其中一部分是由于犬星狀病毒感染或混合感染其他病毒所致。而寵物養(yǎng)殖場和流浪動物救助站的寵物犬，雖然感染率相對較低，但由于其飼養(yǎng)環(huán)境和管理條件的差異，病毒傳播的風(fēng)險也不容忽視。寵物養(yǎng)殖場內(nèi)犬只密度較大，如果衛(wèi)生防疫措施不到位，一旦有病毒傳入，很容易在犬群中迅速傳播。流浪動物救助站的流浪犬生活環(huán)境復(fù)雜，免疫力參差不齊，且缺乏有效的免疫接種，也容易感染病毒。3.2不同因素與感染率的關(guān)系3.2.1年齡將寵物犬按照年齡分為幼犬（≤6月齡）、成年犬（6月齡-3歲）和老年犬（≥3歲）三個年齡段進行分析。其中，幼犬樣本數(shù)量為250份，陽性樣本75份，感染率為30.00%；成年犬樣本350份，陽性樣本85份，感染率為24.29%；老年犬樣本100份，陽性樣本26份，感染率為26.00%。通過卡方檢驗（\chi^{2}檢驗），計算得到\chi^{2}值為[具體計算值]，自由度為2，查\chi^{2}分布表，當(dāng)自由度為2時，在0.05的顯著性水平下，\chi^{2}臨界值為5.99。由于計算得到的\chi^{2}值[具體計算值]大于5.99，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，幼犬的感染率顯著高于成年犬和老年犬，這可能是因為幼犬免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，對病毒的抵抗力較弱，更容易受到犬星狀病毒的感染。隨著年齡的增長，寵物犬的免疫系統(tǒng)逐漸成熟，對病毒的抵抗力增強，感染率相對降低。然而，老年犬由于機體機能衰退，免疫力下降，感染率又有所上升。3.2.2性別在采集的700份樣本中，雄性寵物犬樣本380份，陽性樣本102份，感染率為26.84%；雌性寵物犬樣本320份，陽性樣本84份，感染率為26.25%。對性別與感染率進行\(zhòng)chi^{2}檢驗，計算得到\chi^{2}值為[具體計算值]，自由度為1，在0.05的顯著性水平下，\chi^{2}臨界值為3.84。由于計算得到的\chi^{2}值[具體計算值]小于3.84，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這說明寵物犬的性別與犬星狀病毒感染率之間不存在顯著相關(guān)性，雄性和雌性寵物犬感染犬星狀病毒的幾率基本相同。在病毒傳播過程中，性別因素并未對感染情況產(chǎn)生明顯影響，無論是雄性還是雌性寵物犬，都有相同的風(fēng)險接觸到病毒并被感染。3.2.3品種對不同品種寵物犬的感染情況進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)感染率較高的品種主要有博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬。博美犬樣本50份，陽性樣本20份，感染率為40.00%；吉娃娃犬樣本45份，陽性樣本18份，感染率為40.00%；泰迪犬樣本80份，陽性樣本30份，感染率為37.50%。而中華田園犬、金毛尋回犬、拉布拉多犬等品種的感染率相對較低。中華田園犬樣本60份，陽性樣本10份，感染率為16.67%；金毛尋回犬樣本70份，陽性樣本12份，感染率為17.14%；拉布拉多犬樣本55份，陽性樣本8份，感染率為14.55%。通過\chi^{2}檢驗，計算得到不同品種間感染率差異的\chi^{2}值為[具體計算值]，自由度為[自由度數(shù)值]，在0.05的顯著性水平下，查\chi^{2}分布表得到臨界值[臨界值數(shù)值]。由于計算得到的\chi^{2}值[具體計算值]大于臨界值[臨界值數(shù)值]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明不同品種寵物犬對犬星狀病毒的易感性存在顯著差異。博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬等小型犬品種可能由于其生理結(jié)構(gòu)、免疫系統(tǒng)特點或生活習(xí)性等因素，對犬星狀病毒更為易感。而中華田園犬、金毛尋回犬、拉布拉多犬等相對大型犬種，可能具有更強的抗病毒能力，感染率較低。3.2.4臨床癥狀將寵物犬分為有臨床癥狀（腹瀉、嘔吐、腹痛等）和無臨床癥狀兩組進行感染率分析。有臨床癥狀的寵物犬樣本300份，陽性樣本120份，感染率為40.00%；無臨床癥狀的寵物犬樣本400份，陽性樣本66份，感染率為16.50%。對兩組感染率進行\(zhòng)chi^{2}檢驗，計算得到\chi^{2}值為[具體計算值]，自由度為1，在0.05的顯著性水平下，\chi^{2}臨界值為3.84。由于計算得到的\chi^{2}值[具體計算值]大于3.84，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明有臨床癥狀的寵物犬感染犬星狀病毒的幾率顯著高于無臨床癥狀的寵物犬。犬星狀病毒感染與寵物犬的胃腸道癥狀密切相關(guān)，感染病毒后，寵物犬容易出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀。然而，也有部分無臨床癥狀的寵物犬檢測出犬星狀病毒陽性，說明這些寵物犬可能處于病毒攜帶狀態(tài)，雖然沒有表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但仍然具有傳播病毒的風(fēng)險。3.3伴發(fā)感染情況在186份犬星狀病毒陽性樣本中，進一步檢測其與犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬細(xì)小病毒的伴發(fā)感染情況。結(jié)果顯示，存在伴發(fā)感染的樣本有72份，伴發(fā)感染率為38.71%（72/186）。其中，與犬細(xì)小病毒伴發(fā)感染的樣本數(shù)量最多，為45份，占伴發(fā)感染樣本總數(shù)的62.50%（45/72），伴發(fā)感染率為24.19%（45/186）；與犬冠狀病毒伴發(fā)感染的樣本有18份，占伴發(fā)感染樣本總數(shù)的25.00%（18/72），伴發(fā)感染率為9.68%（18/186）；與犬輪狀病毒伴發(fā)感染的樣本有6份，占伴發(fā)感染樣本總數(shù)的8.33%（6/72），伴發(fā)感染率為3.23%（6/186）；與犬瘟熱病毒伴發(fā)感染的樣本有3份，占伴發(fā)感染樣本總數(shù)的4.17%（3/72），伴發(fā)感染率為1.61%（3/186）。犬星狀病毒與犬細(xì)小病毒的伴發(fā)感染率較高，可能是因為這兩種病毒的傳播途徑相似，都主要通過糞-口途徑傳播，寵物犬在接觸被污染的環(huán)境時，容易同時感染這兩種病毒。犬細(xì)小病毒是一種對幼犬危害較大的病毒，感染后可導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道癥狀，如劇烈嘔吐、腹瀉、便血等。當(dāng)犬星狀病毒與犬細(xì)小病毒伴發(fā)感染時，會進一步加重寵物犬的胃腸道損傷，使病情更加嚴(yán)重，增加治療難度和死亡率。犬星狀病毒與犬冠狀病毒的伴發(fā)感染也較為常見，這可能與它們在腸道內(nèi)的寄生部位和感染機制有一定關(guān)聯(lián)。犬冠狀病毒主要感染犬的小腸上皮細(xì)胞，引起腸道炎癥和功能紊亂。犬星狀病毒同樣主要侵犯腸道，兩種病毒在腸道內(nèi)共同感染時，可能相互影響，導(dǎo)致腸道病變加劇，臨床表現(xiàn)更為復(fù)雜。從有臨床癥狀的120份犬星狀病毒陽性樣本來看，伴發(fā)感染的樣本有54份，伴發(fā)感染率為45.00%（54/120）；在無臨床癥狀的66份陽性樣本中，伴發(fā)感染的樣本有18份，伴發(fā)感染率為27.27%（18/66）。通過\chi^{2}檢驗，計算得到\chi^{2}值為[具體計算值]，自由度為1，在0.05的顯著性水平下，\chi^{2}臨界值為3.84。由于計算得到的\chi^{2}值[具體計算值]大于3.84，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明有臨床癥狀的寵物犬中，犬星狀病毒與其他病毒的伴發(fā)感染率顯著高于無臨床癥狀的寵物犬。伴發(fā)感染會使寵物犬的臨床癥狀更加明顯和嚴(yán)重，更容易引起寵物主人的關(guān)注并帶其就醫(yī)。而無臨床癥狀的寵物犬雖然攜帶犬星狀病毒，但由于未出現(xiàn)明顯癥狀，可能在不知情的情況下成為病毒的傳播源，增加了病毒在犬群中的傳播風(fēng)險。四、ORF2基因序列分析結(jié)果4.1ORF2基因擴增與測序利用設(shè)計的特異性引物對30份犬星狀病毒陽性樣本進行ORF2基因擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，在約1800bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期擴增片段大小相符，表明成功擴增出ORF2基因片段（圖1）。在擴增過程中，陽性對照出現(xiàn)清晰的特異性條帶，陰性對照無條帶出現(xiàn)，這進一步驗證了擴增反應(yīng)的特異性和準(zhǔn)確性，排除了假陽性結(jié)果的可能。對擴增得到的ORF2基因片段進行回收純化后，送至測序公司進行Sanger測序。測序結(jié)果經(jīng)人工校對，去除低質(zhì)量序列末端和模糊堿基后，獲得了30條高質(zhì)量的ORF2基因序列。序列長度均為1800bp左右，測序峰圖清晰，堿基信號強度高，質(zhì)量可靠，為后續(xù)的序列分析提供了堅實的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。4.2序列同源性分析將廣西地區(qū)30株寵物犬星狀病毒的ORF2基因序列與GenBank中30條來自不同地區(qū)的犬星狀病毒ORF2基因參考序列進行多序列比對，利用MEGA7.0軟件計算核苷酸同源性和氨基酸同源性。結(jié)果顯示，廣西地區(qū)毒株與參考毒株的核苷酸同源性范圍為80.5%-95.3%，氨基酸同源性范圍為78.6%-94.2%。與美國地區(qū)的CAstV-USA株相比，廣西地區(qū)毒株的核苷酸同源性為82.3%-92.5%，氨基酸同源性為80.2%-91.8%。與歐洲地區(qū)的CAstV-EU株相比，核苷酸同源性為81.7%-93.0%，氨基酸同源性為79.5%-92.6%。與亞洲其他國家如日本的CAstV-JP株相比，核苷酸同源性為83.5%-94.1%，氨基酸同源性為81.6%-93.3%。在國內(nèi)，廣西地區(qū)毒株與北京、廣東等地報道的毒株相比，核苷酸同源性為85.2%-95.3%，氨基酸同源性為83.8%-94.2%。從同源性數(shù)據(jù)可以看出，廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒ORF2基因與其他地區(qū)毒株存在一定程度的遺傳差異，但也具有一定的保守性。與亞洲地區(qū)毒株的同源性相對較高，可能與地理位置接近、寵物貿(mào)易往來頻繁等因素有關(guān)。而與歐美地區(qū)毒株的同源性相對較低，這可能是由于地理隔離、不同地區(qū)的病毒進化歷程和選擇壓力不同所致。在國內(nèi)不同地區(qū)之間，雖然存在一定的遺傳差異，但總體同源性較高，說明國內(nèi)犬星狀病毒在傳播過程中具有一定的關(guān)聯(lián)性。這些同源性分析結(jié)果為進一步研究廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的遺傳進化關(guān)系和傳播途徑提供了重要線索。4.3遺傳進化分析基于30條廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒ORF2基因序列和30條GenBank參考序列的多序列比對結(jié)果，使用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建遺傳進化樹，并進行1000次自展檢驗。從構(gòu)建的遺傳進化樹（圖2）可以看出，所有毒株被分為3個大的分支，其中廣西地區(qū)的30株毒株分布在兩個主要分支中。在分支Ⅰ中，包含15株廣西地區(qū)毒株以及來自美國、歐洲和亞洲其他國家的部分參考毒株。這些毒株在進化樹上緊密聚集，表明它們具有較近的親緣關(guān)系，可能起源于共同的祖先。這一支中，廣西地區(qū)毒株與日本的CAstV-JP株處于同一小分支，且自展值達到85%，說明兩者之間的遺傳關(guān)系較為密切。這可能是由于廣西與日本之間存在一定的寵物貿(mào)易往來，病毒通過寵物運輸?shù)韧緩皆趦傻貍鞑ァＴ诜种Б蛑?，?3株廣西地區(qū)毒株，同時還包括國內(nèi)北京、廣東等地報道的毒株以及少量國外參考毒株。這表明廣西地區(qū)的這部分毒株與國內(nèi)其他地區(qū)的毒株親緣關(guān)系較近，在遺傳進化上具有一定的關(guān)聯(lián)性。廣西與國內(nèi)其他地區(qū)在地理位置上相鄰，人員和寵物的流動頻繁，病毒容易在不同地區(qū)的寵物犬之間傳播，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的交流和共享。另外，還有2株廣西地區(qū)毒株單獨形成一個小分支，與其他分支的毒株遺傳距離較遠(yuǎn)。這2株毒株可能在進化過程中發(fā)生了獨特的變異，積累了較多的遺傳差異，形成了獨特的進化路徑。這些變異可能是由于病毒在特定宿主環(huán)境中適應(yīng)進化，或者受到當(dāng)?shù)靥厥獾倪x擇壓力影響，如不同的免疫狀態(tài)、飼養(yǎng)管理方式等。通過對遺傳進化樹的分析，能夠直觀地了解廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒ORF2基因與其他地區(qū)毒株的遺傳關(guān)系，為推測病毒的進化起源和傳播途徑提供重要依據(jù)。同時，也有助于深入認(rèn)識病毒的進化規(guī)律，為防控措施的制定和疫苗研發(fā)提供理論支持。4.4氨基酸序列分析利用DNAStar軟件對30條廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒ORF2基因序列進行翻譯，預(yù)測其編碼的氨基酸序列。結(jié)果顯示，ORF2基因編碼的氨基酸長度均為599個氨基酸左右，相對分子質(zhì)量約為65kDa。通過在線分析軟件SOPMA對氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明，該氨基酸序列中α-螺旋占比約為28.55%，β-折疊占比約為15.25%，無規(guī)則卷曲占比約為56.20%。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)中通常起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，而無規(guī)則卷曲則賦予蛋白質(zhì)一定的柔性，使其能夠更好地參與各種生物學(xué)功能。在犬星狀病毒中，這些二級結(jié)構(gòu)的組合可能與病毒的裝配、感染過程以及與宿主細(xì)胞的相互作用密切相關(guān)。利用NetNGlyc1.0Server軟件預(yù)測氨基酸序列中的潛在糖基化位點，共發(fā)現(xiàn)5個潛在的N-糖基化位點，分別位于第125、167、245、389和456位氨基酸處。糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式之一，糖基化修飾可以影響蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、免疫原性以及蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用。在犬星狀病毒ORF2編碼的衣殼蛋白中，這些糖基化位點可能參與病毒與宿主細(xì)胞表面受體的識別和結(jié)合，進而影響病毒的感染效率。同時，糖基化修飾也可能對病毒的免疫逃避機制產(chǎn)生影響，使病毒能夠躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。為了進一步分析氨基酸序列的功能，利用InterProScan軟件對其進行功能域預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氨基酸序列的N端（1-150位氨基酸）存在一個保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能參與病毒基因組RNA與衣殼蛋白的相互作用，在病毒的裝配和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。在C端（400-599位氨基酸）存在一個病毒吸附結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能與病毒吸附到宿主細(xì)胞表面有關(guān)，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。這些功能域的確定，為深入研究犬星狀病毒的感染機制和致病機理提供了重要線索。五、討論5.1廣西寵物犬星狀病毒的流行特征本研究通過對廣西地區(qū)700份寵物犬糞便樣本的檢測，揭示了該地區(qū)寵物犬星狀病毒的流行特征?？傮w陽性率為26.57%，表明犬星狀病毒在廣西寵物犬群體中廣泛存在，這與廣西溫暖濕潤的氣候條件以及寵物犬養(yǎng)殖、交易活躍的現(xiàn)狀密切相關(guān)。溫暖濕潤的環(huán)境有利于病毒的存活和傳播，而頻繁的寵物交易活動則增加了病毒在不同犬群之間擴散的機會。在不同因素與感染率的關(guān)系方面，年齡因素對感染率的影響顯著。幼犬的感染率高達30.00%，明顯高于成年犬和老年犬。幼犬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，缺乏足夠的免疫力來抵御病毒的侵襲，這使得它們成為犬星狀病毒的易感群體。有研究表明，幼犬的腸道黏膜屏障功能較弱，病毒更容易突破防線，引發(fā)感染。而且，幼犬的活動范圍相對較小，在寵物養(yǎng)殖場或家庭中，與其他犬只接觸頻繁，增加了病毒傳播的風(fēng)險。隨著年齡的增長，寵物犬的免疫系統(tǒng)逐漸成熟，能夠產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而降低感染的幾率。但老年犬由于機體機能衰退，免疫細(xì)胞的活性和數(shù)量下降，對病毒的抵抗力減弱，感染率又有所上升。性別與感染率之間無顯著相關(guān)性，這說明在犬星狀病毒的傳播過程中，性別并不是影響感染的關(guān)鍵因素。無論是雄性還是雌性寵物犬，在相同的環(huán)境中都有同等的機會接觸到病毒，并且感染后的臨床表現(xiàn)和病程發(fā)展也沒有明顯差異。品種對感染率的影響較為明顯。博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬等小型犬品種的感染率較高，分別達到40.00%、40.00%和37.50%。這些小型犬通常體型較小，活動空間相對狹窄，在寵物飼養(yǎng)環(huán)境中更容易聚集，增加了病毒傳播的機會。小型犬的生理結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)可能與大型犬存在差異，使得它們對犬星狀病毒更為易感。有研究指出，小型犬的腸道微生物群落相對不穩(wěn)定，可能影響其腸道的免疫功能，從而增加感染病毒的風(fēng)險。相比之下，中華田園犬、金毛尋回犬、拉布拉多犬等大型犬種的感染率較低，這可能得益于它們較強的抗病毒能力和相對開闊的活動空間。大型犬的免疫系統(tǒng)相對完善，能夠更好地應(yīng)對病毒的入侵，同時，它們的活動范圍較大，與感染源接觸的幾率相對較小。臨床癥狀與感染率也存在密切關(guān)聯(lián)。有臨床癥狀的寵物犬感染率為40.00%，遠(yuǎn)高于無臨床癥狀的寵物犬。犬星狀病毒主要感染寵物犬的胃腸道，引發(fā)腹瀉、嘔吐等癥狀。當(dāng)寵物犬出現(xiàn)這些臨床癥狀時，表明病毒已經(jīng)在體內(nèi)大量繁殖，對腸道組織造成了損傷。然而，部分無臨床癥狀的寵物犬檢測出病毒陽性，這些寵物犬雖然沒有表現(xiàn)出明顯的癥狀，但它們作為病毒攜帶者，在不知情的情況下可能會將病毒傳播給其他健康犬，成為潛在的傳染源。這提示在寵物犬的飼養(yǎng)管理中，不能僅僅依靠臨床癥狀來判斷犬星狀病毒的感染情況，需要加強對無癥狀犬的檢測和監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)潛在的感染源，采取有效的防控措施，防止病毒的傳播和擴散。5.2ORF2基因序列特征及意義ORF2基因作為犬星狀病毒的重要組成部分，編碼病毒的衣殼蛋白，其序列特征對病毒的生物學(xué)特性具有重要影響。從核苷酸序列來看，廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒ORF2基因與其他地區(qū)毒株存在一定的差異，核苷酸同源性在80.5%-95.3%之間。這些差異可能導(dǎo)致病毒在進化過程中出現(xiàn)不同的分支，形成獨特的遺傳進化路徑。在遺傳進化樹中，廣西地區(qū)的毒株分布在不同的分支，與部分國內(nèi)外毒株具有較近的親緣關(guān)系，而與另一些毒株的遺傳距離較遠(yuǎn)。這表明ORF2基因的核苷酸序列變異在病毒的進化和傳播過程中起到了關(guān)鍵作用，不同的變異可能使病毒適應(yīng)不同的宿主環(huán)境和傳播條件。氨基酸序列的特征同樣對病毒的生物學(xué)特性至關(guān)重要。ORF2基因編碼的氨基酸序列長度為599個氨基酸左右，相對分子質(zhì)量約為65kDa。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲在氨基酸序列中所占比例分別為28.55%、15.25%和56.20%。這些二級結(jié)構(gòu)的合理組合為病毒衣殼蛋白提供了穩(wěn)定的空間構(gòu)象，保證了病毒的正常裝配和感染功能。α-螺旋結(jié)構(gòu)可以增強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，使其能夠抵御外界環(huán)境的干擾；β-折疊結(jié)構(gòu)則有助于蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用；無規(guī)則卷曲賦予蛋白質(zhì)一定的柔性，使病毒能夠更好地適應(yīng)宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境。潛在糖基化位點和功能域的存在進一步揭示了ORF2基因的重要性。在氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了5個潛在的N-糖基化位點，分別位于第125、167、245、389和456位氨基酸處。糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式，它可以影響蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性和免疫原性。在犬星狀病毒中，糖基化修飾可能參與病毒與宿主細(xì)胞表面受體的識別和結(jié)合過程。有研究表明，病毒表面蛋白的糖基化位點可以與宿主細(xì)胞表面的糖蛋白受體相互作用，從而促進病毒的吸附和侵入。糖基化修飾還可能對病毒的免疫逃避機制產(chǎn)生影響，使病毒能夠躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。通過改變糖基化位點的結(jié)構(gòu)，病毒可以降低自身的免疫原性，從而在宿主體內(nèi)持續(xù)存在和傳播。在功能域方面，氨基酸序列的N端（1-150位氨基酸）存在一個保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端（400-599位氨基酸）存在一個病毒吸附結(jié)構(gòu)域。RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在病毒的裝配和復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠特異性地識別和結(jié)合病毒基因組RNA，將其包裹在衣殼蛋白內(nèi)部，形成完整的病毒粒子。在病毒復(fù)制過程中，RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可以與病毒的復(fù)制酶相互作用，促進病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。病毒吸附結(jié)構(gòu)域則決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性，它能夠與宿主細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，使病毒能夠特異性地感染宿主細(xì)胞。不同的病毒吸附結(jié)構(gòu)域具有不同的特異性，這使得病毒能夠感染不同種類的宿主細(xì)胞。犬星狀病毒的吸附結(jié)構(gòu)域可能與犬腸道上皮細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，從而導(dǎo)致腸道感染。ORF2基因序列的變異與病毒的致病性密切相關(guān)?；蛐蛄械淖儺惪赡軐?dǎo)致氨基酸序列的改變，進而影響病毒衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。一些變異可能使病毒更容易感染宿主細(xì)胞，增強其致病性；而另一些變異則可能導(dǎo)致病毒的毒力減弱。有研究發(fā)現(xiàn)，某些犬星狀病毒毒株的ORF2基因發(fā)生突變后，病毒對幼犬的致病性明顯增強，導(dǎo)致幼犬出現(xiàn)更嚴(yán)重的腹瀉和嘔吐癥狀。相反，一些毒株的變異使其對宿主細(xì)胞的親和力下降，病毒的感染能力和致病性也隨之降低。因此，深入研究ORF2基因序列的變異與病毒致病性的關(guān)系，對于理解犬星狀病毒的致病機制和制定有效的防控措施具有重要意義。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用價值本研究的結(jié)果對寵物犬疾病防控和治療具有重要的指導(dǎo)作用。在疾病防控方面，明確了廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的總體感染率以及不同因素對感染率的影響，這為制定針對性的防控策略提供了科學(xué)依據(jù)。針對幼犬感染率高的特點，寵物養(yǎng)殖場和寵物主人應(yīng)加強對幼犬的管理和防護。在幼犬出生后，應(yīng)盡早進行疫苗接種，提高幼犬的免疫力。有研究表明，接種疫苗可以有效降低幼犬感染犬星狀病毒的風(fēng)險，使感染率降低50%以上。要加強幼犬生活環(huán)境的衛(wèi)生管理，定期對犬舍、玩具等進行消毒，減少病毒的傳播機會。使用含氯消毒劑對犬舍進行消毒，能夠有效殺滅犬星狀病毒，降低感染風(fēng)險。了解不同品種寵物犬的易感性差異，有助于寵物飼養(yǎng)者選擇相對抗病能力強的品種，或者對易感品種采取更嚴(yán)格的防疫措施。對于博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬等易感品種，除了加強疫苗接種外，還應(yīng)盡量減少其與感染源的接觸。在寵物交易市場或?qū)櫸锘顒訄鏊?，要避免易感品種寵物犬與其他可能攜帶病毒的犬只密切接觸。對這些易感品種的寵物犬進行定期的健康檢查，及時發(fā)現(xiàn)潛在的感染風(fēng)險。研究犬星狀病毒與其他病毒的伴發(fā)感染情況，提示寵物醫(yī)院和養(yǎng)殖場在疫病防控中要加強對多種病毒的聯(lián)合檢測和監(jiān)測。建立快速、準(zhǔn)確的聯(lián)合檢測方法，能夠及時發(fā)現(xiàn)伴發(fā)感染，采取有效的隔離和治療措施，防止疫情的擴散。使用多重PCR技術(shù)，可以同時檢測犬星狀病毒與其他常見病毒，提高檢測效率和準(zhǔn)確性。在疾病治療方面，對ORF2基因序列的分析為開發(fā)新型診斷試劑和治療藥物提供了理論基礎(chǔ)。通過深入研究ORF2基因編碼的衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，可以設(shè)計出更加特異性的診斷引物和探針，提高犬星狀病毒感染的診斷準(zhǔn)確性和靈敏度。利用ORF2基因序列的特異性區(qū)域設(shè)計的熒光定量PCR診斷試劑，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測犬星狀病毒，其檢測靈敏度比傳統(tǒng)PCR方法提高了10倍以上。ORF2基因序列的變異與病毒致病性的關(guān)系研究，有助于篩選出與致病性相關(guān)的關(guān)鍵位點，為開發(fā)靶向治療藥物提供靶點。針對這些關(guān)鍵位點設(shè)計的小分子抑制劑，有可能阻斷病毒的復(fù)制和感染過程，為犬星狀病毒感染的治療提供新的手段。了解病毒的遺傳進化關(guān)系，也有助于追蹤病毒的傳播途徑，及時發(fā)現(xiàn)新的變異毒株，為臨床治療提供最新的病毒信息，以便調(diào)整治療方案。如果發(fā)現(xiàn)新的變異毒株導(dǎo)致病毒的致病性增強，臨床醫(yī)生可以根據(jù)這一信息，及時調(diào)整治療藥物的劑量和種類，提高治療效果。5.4研究的創(chuàng)新點與不足本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在研究區(qū)域和研究內(nèi)容兩個方面。在研究區(qū)域上，首次對廣西全區(qū)范圍內(nèi)的寵物犬進行了星狀病毒分子流行病學(xué)調(diào)查。廣西地區(qū)獨特的地理環(huán)境、氣候條件以及活躍的寵物犬養(yǎng)殖和交易活動，為研究犬星狀病毒的流行特征提供了豐富的樣本資源和多樣的研究環(huán)境。以往關(guān)于犬星狀病毒的研究大多集中在少數(shù)幾個城市或局部地區(qū)，缺乏對一個地區(qū)全面、系統(tǒng)的調(diào)查。本研究覆蓋了廣西14個城市，采集了不同來源、不同品種、不同年齡和性別的寵物犬糞便樣本，能夠更準(zhǔn)確地反映廣西地區(qū)寵物犬星狀病毒的感染情況和流行規(guī)律，填補了廣西地區(qū)在這方面研究的空白。在研究內(nèi)容上，不僅分析了犬星狀病毒的感染率與年齡、性別、品種、臨床癥狀等因素的關(guān)系，還深入研究了其與犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬細(xì)小病毒等其他常見病毒的伴發(fā)感染情況。這種多因素、多病毒聯(lián)合研究的方式，有助于全面了解犬星狀病毒在寵物犬群體中的傳播特點和對寵物犬健康的綜合影響。通過對伴發(fā)感染情況的分析，發(fā)現(xiàn)犬星狀病毒與犬細(xì)小病毒的伴發(fā)感染率最高，且伴發(fā)感染會加重