ICS71.100.70

CCSY40

GDCA

廣東省化妝品學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDCA018—2021

化妝品抗氧化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲法

Cosmetics-Determinationofantioxidant-Caenorhabditiselegans

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

2021-XX-XX發(fā)布2021-XX-XX實(shí)施

廣東省化妝品學(xué)會(huì)發(fā)布

T/GDCA018—2021

化妝品抗氧化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲法

1范圍

本文件規(guī)定了運(yùn)用秀麗線蟲評(píng)價(jià)化妝品抗氧化活性的方法原理及操作。

本文件適用于化妝品原料及化妝品（精華、乳液、膏霜等）的抗氧化活性的功效評(píng)價(jià)。

本文件不適用于完全抑制大腸桿菌生長的物質(zhì)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件

線蟲生命周期LifeCycleofC.elegans（見附錄A）

線蟲的生命周期可以分為胚胎發(fā)育期（受精卵至Ll幼蟲）、生長發(fā)育期（Ll幼蟲至成蟲早期）、生

殖期（產(chǎn)卵階段）及生殖后期。20℃標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，野生型線蟲可存活約20天。

生存曲線SurvivalCurves

個(gè)體從幼體到死亡所能存活的比率所做出的統(tǒng)計(jì)曲線。一般以存活率為縱坐標(biāo)，以蟲齡為橫坐標(biāo)作

圖。

同期化synchronized

在所有實(shí)驗(yàn)開始前需將線蟲進(jìn)行同期化處理，得到L4期線蟲，在相同發(fā)育階段進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

4檢測(cè)原理

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是線蟲衰老的關(guān)鍵因素，線蟲的抗氧化應(yīng)激能力和壽命有較好的相關(guān)性，壽命會(huì)隨

著抗氧化應(yīng)激能力的提高而延長。H2O2常用于誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，它能有效地模擬自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

的生物過程。線粒體超氧自由基制造者百草枯（PQ，1，1'-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶二氯化物）在以秀麗

線蟲為模型探究線粒體氧化損傷的實(shí)驗(yàn)中有非常廣泛的應(yīng)用。PQ可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而產(chǎn)生

過量ROS，造成線粒體功能障礙。在PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境下，線蟲機(jī)體受到損傷，主要體現(xiàn)在其運(yùn)動(dòng)

能力的下降及壽命的縮短。利用不同化妝品/原料對(duì)線蟲進(jìn)行處理，將其暴露在H2O2或PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)

激環(huán)境下，并對(duì)其壽命進(jìn)行記錄，與對(duì)照組相比，從而反映受試樣品的抗氧化活性。

5材料與試劑

材料

5.1.1秀麗線蟲（以下簡稱線蟲）：N2野生型秀麗線蟲（Caenorhabditiselegans，theBridtolstrainN2）

購自秀麗線蟲遺傳學(xué)中心（CaenorhabditisGeneticsCenter，USA）

1

T/GDCA018—2021

5.1.260mm培養(yǎng)皿

5.1.3挑蟲器wormpicker

試劑

除非另有說明，化學(xué)試劑使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?。配制方法見附錄B

5.2.1尿嘧啶合成缺陷菌株大腸桿菌（Escherichiacoli，OP50）購自秀麗線蟲遺傳學(xué)中心（Caenorhabditis

GeneticsCenter，USA）

5.2.2基礎(chǔ)試劑：氯化鈉（NaCl）、硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈣（CaCl2）、次氯酸鈉（NaClO）、氫

氧化鈉（NaOH）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）、

膽固醇、無水乙醇、硫酸鏈霉素、技術(shù)瓊脂粉、LB肉湯、胰蛋白胨、二甲基亞砜（DMSO）、30%過氧

化氫（H2O2）、百草枯CAS:75365-73-0美國Simga-Aldrich貿(mào)易有限公司，試劑純度均為分析純。

5.2.3實(shí)驗(yàn)用水：采用符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水

對(duì)照品

5.3.1水溶性

VC標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，CAS號(hào)：50-81-7。

VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1mg/mL）：稱取0.001g（精確到0.0001g）VC于離心管中，加入1mL三級(jí)水，

振蕩至粉末完全溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.3.2醇溶性

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥97%，PubChemCID：2246。

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（3mM）：稱取0.001g（精確到0.0001g）蝦青素于2mL離心管中，加入558μ

L二甲基亞砜（DMSO）。將離心管超聲30min后置于80℃水浴鍋中加熱30s至完全溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.3.3醇溶性

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥97%，PubChemCID：2246。

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（3mM）：稱取0.001g（精確到0.0001g）蝦青素于2mL離心管中，加入558μL

二甲基亞砜（DMSO）。將離心管超聲30min后置于80℃水浴鍋中加熱30s至完全溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

6實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

連續(xù)變倍體式顯微鏡：物鏡變倍范圍0.7X-4.5X

震蕩培養(yǎng)箱：精度±1℃

生化培養(yǎng)箱：精度±1℃

超凈工作臺(tái)

分析天平：精度0.1mg

高壓滅菌鍋

電熱恒溫水浴鍋

7實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

繁殖期（3-5天齡）野生型秀麗線蟲用于同期化。

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T/GDCA018—2021

受試物

受試物包含化妝品原料及產(chǎn)品。配制受試物測(cè)試溶液時(shí)，首選溶劑是M9緩沖液，如需用到有機(jī)溶

劑助溶，可選用二甲基亞砜，溶劑于測(cè)試溶液中的濃度要≤2%。針對(duì)不同受試物，需結(jié)合其特性調(diào)整

前處理方法，具體可參照附錄C。

線蟲NGM的配制：

7.3.1含樣品NGM的配制：

①水溶性樣品：

樣品組：將樣品溶解在無菌水中配制成一定濃度的母液，取E.coliOP50菌液和樣品按95：5比例混

合均勻，用移液槍吸取150μL菌液輕緩的打在每個(gè)NGM平板上中央。樣品最終上樣有效濃度根據(jù)預(yù)實(shí)

驗(yàn)確定（見8.2）。用移液槍吸取150μL菌液輕緩的打在每個(gè)NGM平板上中央。

空白組：取E.coliOP50菌液輕緩的打在NGM平板上中央，避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②非水溶性樣品：

樣品組：將樣品溶解在二甲基亞砜（DMSO）溶液中配制成一定濃度的母液，取E.coliOP50菌液和

樣品按98：2比例混合均勻，樣品最終上樣有效濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定（見8.2）。用移液槍吸取150μL

菌液輕緩的打在每個(gè)NGM平板上中央。

空白組：取E.coliOP50菌液和DMSO按98：2比例混合均勻進(jìn)行涂布。將涂布好細(xì)菌的NGM平板避

光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

7.3.2H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制

NGM培養(yǎng)基滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃。將30%H2O2溶液稀釋至10%，再以體積分?jǐn)?shù)為0.1%

加入NGM培養(yǎng)基中。為保證過氧化氫活性，誘導(dǎo)板限制在一周內(nèi)使用，建議每批次實(shí)驗(yàn)配置100mLH2O2

誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

7.3.3PQ誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：

10mMPQ溶液：稱取0.257g，溶于適量M9緩沖液，得到PQ溶液；

NGM培養(yǎng)基滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃，將PQ溶液于無菌環(huán)境加入NGM培養(yǎng)基中，得到含有

PQ的NGM培養(yǎng)基（10mM即為0.257gPQ/100mLNGM培養(yǎng)基）。為保證百草枯活性，誘導(dǎo)板限制

在一周內(nèi)使用，建議每批次實(shí)驗(yàn)配置200mLPQ誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

7.3.4對(duì)照組

水溶性陽性對(duì)照（VC）：取E.coliOP50菌液和VC母液按95：5比例混合均勻，用移液槍吸取150μ

L菌液輕緩的打在每個(gè)NGM平板上中央；

非水溶性陽性對(duì)照（蝦青素）：取E.coliOP50菌液和蝦青素母液按98：2比例混合均勻，用移液槍

吸取150μL菌液輕緩的打在每個(gè)NGM平板上中央。

NGM平板避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆?。為保證樣品活性，各樣品板限制在一周內(nèi)使用。

8實(shí)驗(yàn)方法

線蟲同期化

用1mLM9緩沖溶液將NGM平板上的年輕成蟲反復(fù)沖洗兩次再轉(zhuǎn)移至無菌2mL離心管中，加入1

mL現(xiàn)配的裂解液，充分振蕩3-5min后，在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，棄上清。再用1mLM9緩沖液

沖洗線蟲及以同樣條件離心2次，棄上清，余下0.3-0.4mL的含蟲卵緩沖液。然后用移液槍輕輕吹打混

勻蟲卵，吸取100μL左右含蟲卵的緩沖液滴于NGM平板上靠近OP50的無菌區(qū)域。待線蟲受精卵基本

發(fā)育成L4期幼蟲，完成同期化。挑取L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至藥物板用于壽命實(shí)驗(yàn)。

預(yù)測(cè)試

3

T/GDCA018—2021

受試物在進(jìn)行正式測(cè)試之前，如不確定安全濃度范圍，建議進(jìn)行預(yù)測(cè)試，可選擇倍數(shù)稀釋間隔如0.1

mg/L，1mg/L，10mg/L受試物濃度，按照標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試程序，確定安全濃度范圍。如受試物在該測(cè)試濃度

下，線蟲生存曲線相比于空白對(duì)照組有顯著左移的現(xiàn)象（p<0.05），則該濃度視為毒性濃度。

氧化應(yīng)激壽命實(shí)驗(yàn)

8.3.1H2O2誘導(dǎo)法

挑取L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至空白組和樣品組培養(yǎng)基中，經(jīng)藥物作用3天后，每個(gè)培養(yǎng)基再挑取30只線蟲暴

露于H2O2NGM培養(yǎng)基上（為避免子代影響及食物不足，建議兩天將線蟲挑至新的樣品NGM板），進(jìn)行

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)干預(yù)。每隔30min記錄線蟲生存、逃逸、死亡數(shù)，直至線蟲全部死亡，得到線蟲在H2O2氧

化應(yīng)激環(huán)境下生存曲線。

8.3.2PQ誘導(dǎo)法

挑取L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至空白組和樣品組培養(yǎng)基中（為避免線蟲在NGM上丟失，建議每板60-70條蟲），

經(jīng)藥物作用3天后（為避免子代影響及食物不足，建議兩天將線蟲挑至新的樣品NGM板），每個(gè)培養(yǎng)基

再挑取50只線蟲暴露于PQ培養(yǎng)基上，進(jìn)行氧化應(yīng)激誘導(dǎo)干預(yù)。初期（線蟲轉(zhuǎn)到PQ誘導(dǎo)培養(yǎng)基1-2天）每

隔24h，記錄線蟲生存、逃逸、死亡數(shù)；后期（大約第3天后）每隔12h記錄線蟲生存、逃逸、死亡數(shù)，

直至線蟲全部死亡，得到線蟲在PQ氧化應(yīng)激環(huán)境下生存曲線。

9結(jié)果評(píng)價(jià)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPadPrism8軟件繪制survival生存曲線圖（數(shù)字0代表線蟲逃逸，1代表線蟲死亡），log-

rank檢驗(yàn)分析生存曲線顯著性，p<0.05表示有顯著性差異。各組平均壽命數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（`X

±SD）表示，通過SPSS軟件ANOVA分析組間差異，p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1xj＋xj＋1

（1）平均壽命dj

nj2

其中j生存時(shí)間(d)，dj是在年齡間隔(xj，xj+1)內(nèi)死亡的線蟲數(shù)量，n是線蟲總數(shù)。

樣品組平均壽命

（2）壽命延長率%（-1）×100%

空白組平均壽命

結(jié)果判定及說明

在實(shí)驗(yàn)滿足有效性的基礎(chǔ)上，受試物測(cè)試組與對(duì)照組對(duì)比，生存曲線有顯著右移（p<0.05），平

均壽命顯著大于對(duì)照組線蟲（p<0.05）且壽命延長率>0%（p<0.05），說明該受試物在該濃度下，

能保護(hù)線蟲免受氧化應(yīng)激損傷，可作為抗氧化活性評(píng)價(jià)的證據(jù)支撐之一。

10實(shí)驗(yàn)有效性的條件

樣本量要求：每項(xiàng)壽命實(shí)驗(yàn)的線蟲數(shù)量不少于90只。

同期化實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制：同期化實(shí)驗(yàn)得到受精卵后26小時(shí)左右孵化為L1期的幼蟲。若同期化后

1-2天沒有觀察到幼蟲孵化，則同期化實(shí)驗(yàn)失敗。

空白組與陽性對(duì)照組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，則該次壽命實(shí)驗(yàn)視為失敗。

空白組與受試物組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，或者受試物組壽命顯著短于空白組，則該

受試物不具有抗氧化活性。

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A

A

附錄A

（資料性）

線蟲生命周期LifeCycleofC.elegans

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B

B

附錄B

（資料性）

培養(yǎng)基、試劑配置

B1.培養(yǎng)基、試劑配置

①1M磷酸鉀緩沖液

KH2PO4108.39g

K2HPO435.69g

加水至1L，調(diào)pH值至6.0。

②M9緩沖液

Na2HPO46g或Na2HPO4·12H2O15.12g

KH2PO43g

NaCl5g

MgSO4·7H2O0.25g

加水至1L，121℃滅菌15分鐘，宜現(xiàn)用現(xiàn)配。

③LB液體培養(yǎng)基

LB肉湯20g/L

蒸餾水配制，用1M的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH7.0，121℃滅菌15分鐘。

④線蟲生長固體培養(yǎng)基(NematodeGrowthMedium，NGM)，按1L計(jì)

NaCl3g

Agar（瓊脂）17g

TryPtone（胰蛋白胨）2.5g

Streptomycin（鏈霉素）0.2g

蒸餾水975mL

搖勻后，121℃滅菌30分鐘，80℃恒溫15分鐘，然后加入下列溶液(膽固醇過濾除菌，其余高溫滅菌)。

1MCaCl2lmL

1MMgSO4lmL

5mg/mL溶解于無水乙醇的膽固醇lmL

1M的磷酸鉀25mL

⑤裂解液

用4mL蒸餾水溶解0.1gNaOH后和1.4mLNaClO混合均勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

B2.線蟲基本操作方法

（1）大腸桿菌OP50的培養(yǎng)

取OP50的菌種于LB平板劃線，挑取單菌落于在10mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)

12h，至OD600等于0.4-0.6，用于接種NGM喂養(yǎng)正常組線蟲。

（2）E.coliOP50的涂布

在每個(gè)NGM平板上加適量的菌液(一般直徑60mm平板加150μL)，用無菌的涂布器或玻璃試管

底部將菌液均勻地涂布在NGM平板上，注意菌液邊緣應(yīng)距離平板邊緣0.5cm左右。涂布好細(xì)菌的NGM

平板在室溫(21-25℃)下過夜后即可使用，如果不是立即使用則應(yīng)將其置于冷室或4℃冰箱中待用。

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C

C

附錄C

（資料性）

化妝品前處理參考方法

受試物前處理方法不同受試物的特性不同，前處理方法也不一樣。對(duì)于化妝品原料，可直接將受試

物溶解到M9緩沖液中配置成儲(chǔ)存液，進(jìn)一步用大腸桿菌稀釋到相應(yīng)的測(cè)試濃度進(jìn)行測(cè)試。如需用到有機(jī)

溶劑助溶，選用二甲基亞砜，且溶劑在測(cè)試溶液中的濃度要≤2%。但化妝品有精華、乳液、膏霜、啫

喱等不同劑型，對(duì)于眾多產(chǎn)品而言，因質(zhì)地復(fù)雜需要進(jìn)行樣本前處理，具體可參考下列方法。將受試物

與二甲基亞砜按1：3（g：mL；如0.4g：1.2mL）混勻、超聲波處理后15000×g離心，取上清液，將

上清液用大腸桿菌稀釋到相應(yīng)的測(cè)試濃度進(jìn)行測(cè)試。二甲基亞砜在實(shí)驗(yàn)溶液中的最終濃度≤2%。

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D

D

附錄D

（資料性）

附表1H2O2氧化應(yīng)激條件下線蟲生存情況記錄表

受試物信息

實(shí)驗(yàn)時(shí)間

數(shù)據(jù)記錄

空白組受試物組陽性對(duì)照組

組別

平行1平行2平行3平行1平行2平行3平行1平行2平行3

0hour303030303030303030

0.5hour25s3p229s125s53025s2p328s228s226s3p126s4

1hour

1.5hour

2hour

2.5hour

3hour

3.5hour

4hour

4.5hour

5hour

注：數(shù)據(jù)記錄時(shí)，s代表死亡，p代表逃逸。例如25s3p2，即生存數(shù)25，死亡數(shù)3，逃逸數(shù)2

附表2H2O2氧化應(yīng)激條件下線蟲生存情況記錄表

處理?xiàng)l件平均壽命壽命延長率（%）

空白組（H2O2）

受試物（H2O2）

陽性對(duì)照（H2O2）

8

T/GDCA018—2021

圖1H2O2氧化應(yīng)激條件下線蟲生存曲線（示例）

實(shí)驗(yàn)人員：_______________審核人員：_______________檢測(cè)單位：_______________

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T/GDCA018—2021

附表3PQ氧化應(yīng)激條件下線蟲生存情況記錄表

受試物信息

實(shí)驗(yàn)時(shí)間

數(shù)據(jù)記錄

空白組受試物組陽性對(duì)照組

組別

平行1平行2平行3平行1平行2平行3平行1平行2平行3

0day505050505050505050

1day45s3p249s145s55045s2p348s248s246s3p146s4

2day

3day

3.5day

4day

4.5day

5day

5.5day

6day

6.5day

7day

7.5day

8day

注：數(shù)據(jù)記錄時(shí)，s代表死亡，p代表逃逸。例如55s3p2，即生存數(shù)55，死亡數(shù)3，逃逸數(shù)2

附表4PQ氧化應(yīng)激條件下線蟲生存情況記錄表

處理?xiàng)l件平均壽命壽命延長率（%）

空白組（PQ）

受試物（PQ）

陽性對(duì)照（PQ）

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T/GDCA018—2021

圖2PQ氧化應(yīng)激條件下線蟲生存曲線（示例）

實(shí)驗(yàn)人員：_______________審核人員：_______________檢測(cè)單位：_______________

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E

E

附錄E

（資料性）

線蟲培養(yǎng)及維護(hù)

1.線蟲培養(yǎng)環(huán)境

培養(yǎng)溫度：20℃；培養(yǎng)濕度：50%

2.線蟲維護(hù)

①Dauer現(xiàn)象抵御惡劣環(huán)境（短期保存）

線蟲在缺少食物或生存環(huán)境不適宜的條件下，會(huì)由L1-L2期進(jìn)入一種稱之為dauer的時(shí)期（停育

期），出于該狀態(tài)的線蟲可以存活兩三個(gè)月之久，當(dāng)又遇到食物充足或環(huán)境適宜的時(shí)候，dauer期線蟲

立即恢復(fù)發(fā)育，跳過L3期直接進(jìn)入L4期，繼續(xù)生長以完成整個(gè)生命周期。該特點(diǎn)可用于線蟲的短暫保存，

定期每2個(gè)月將Dauer期線蟲轉(zhuǎn)移至食物充足的NGM中的方式進(jìn)行線蟲維護(hù)。

②線蟲凍存（長期保存）

線蟲凍存緩沖液（100mL）配置：

NaCl0.585g

K2HPO40.68g

Glycerol（甘油）30mL

NaOH（1M）0.56mL

Water70mL

121℃，30min滅菌后使用，室溫保存。

將大量的處于L1-L2期的幼蟲（將健康成蟲饑餓2-4d可得）用M9緩沖液沖下，定容于1mLM9緩沖

液中，加入等體積的線蟲凍存液，輕輕混勻，分裝到500μL凍存管中，然后放到泡沫聚苯乙烯盒（保

持溫度下降速度不會(huì)過快）轉(zhuǎn)到-80℃過夜，后期可轉(zhuǎn)到液氮中長期保存。線蟲在-80℃放置48h后取

出1管來復(fù)蘇檢測(cè)凍存效果。

復(fù)蘇線蟲時(shí)，將線蟲凍存管握于手中或37℃水浴使凍存液迅速融化。1500rpm離心1min，讓線

蟲幼蟲沉淀到凍存管底部，棄去上清的凍存液至約50μL左右（盡可能使線蟲富集到少量凍存液中），

沉淀全部轉(zhuǎn)移到鋪有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基的菌苔外緣。將培養(yǎng)基蓋子稍微打開，待溶液吸干，關(guān)蓋。

復(fù)蘇過來的線蟲就已經(jīng)能夠開始蠕動(dòng)并最終爬到菌苔中。

12

T/GDCA018—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

本文件由廣東省化妝品學(xué)會(huì)提出。

本文件由廣東省化妝品學(xué)會(huì)歸口。

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

I

T/GDCA018—2021

化妝品抗氧化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲法

1范圍

本文件規(guī)定了運(yùn)用秀麗線蟲評(píng)價(jià)化妝品抗氧化活性的方法原理及操作。

本文件適用于化妝品原料及化妝品（精華、乳液、膏霜等）的抗氧化活性的功效評(píng)價(jià)。

本文件不適用于完全抑制大腸桿菌生長的物質(zhì)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件

線蟲生命周期LifeCycleofC.elegans（見附錄A）

線蟲的生命周期可以分為胚胎發(fā)育期（受精卵至Ll幼蟲）、生長發(fā)育期（Ll幼蟲至成蟲早期）、生

殖期（產(chǎn)卵階段）及生殖后期。20℃標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，野生型線蟲可存活約20天。

生存曲線SurvivalCurves

個(gè)體從幼體到死亡所能存活的比率所做出的統(tǒng)計(jì)曲線。一般以存活率為縱坐標(biāo)，以蟲齡為橫坐標(biāo)作

圖。

同期化synchronized

在所有實(shí)驗(yàn)開始前需將線蟲進(jìn)行同期化處理，得到L4期線蟲，在相同發(fā)育階段進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

4檢測(cè)原理

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是線蟲衰老的關(guān)鍵因素，線蟲的抗氧化應(yīng)激能力和壽命有較好的相關(guān)性，壽命會(huì)隨

著抗氧化應(yīng)激能力的提高而延長。H2O2常用于誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，它能有效地模擬自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

的生物過程。線粒體超氧自由基制造者百草枯（PQ，1，1'-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶二氯化物）在以秀麗

線蟲為模型探究線粒體氧化損傷的實(shí)驗(yàn)中有非常廣泛的應(yīng)用。PQ可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而產(chǎn)生

過量ROS，造成線粒體功能障礙。在PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境下，線蟲機(jī)體受到損傷，主要體現(xiàn)在其運(yùn)動(dòng)

能力的下降及壽命的縮短。利用不同化妝品/原料對(duì)線蟲進(jìn)行處理，將其暴露在H2O2或PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)

激環(huán)境下，并對(duì)其壽命進(jìn)行記錄，與對(duì)照組相比，從而反映受試樣品的抗氧化活性。

5材料與試劑

材料

5.1.1秀麗線蟲（以下簡稱線蟲）：N2野生型秀麗線蟲（Caenorhabditiselegans，theBridtolstrainN2）

購自秀麗線蟲遺傳學(xué)中心（CaenorhabditisGeneticsCenter，USA）

1

T/GDCA018—2021

5.1.260mm培養(yǎng)皿

5.1.3挑蟲器wormpicker

試劑

除非另有說明，化學(xué)試劑使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭Ｅ渲品椒ㄒ姼戒汢

5.2.1尿嘧啶合成缺陷菌株大腸桿菌（Escherichiacoli，OP50）購自秀麗線蟲遺傳學(xué)中心（Caenorhabditis

GeneticsCenter，USA）

5.2.2基礎(chǔ)試劑：氯化鈉（NaCl）、硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈣（CaCl2）、次氯酸鈉（NaClO）、氫

氧化鈉（NaOH）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）、

膽固醇、無水乙醇、硫酸鏈霉素、技術(shù)瓊脂粉、LB肉湯、胰蛋白胨、二甲基亞砜（DMSO）、30%過氧

化氫（H2O2）、百草枯CAS:75365-73-0美國Simga-Aldrich貿(mào)易有限公司，試劑純度均為分析純。

5.2.3實(shí)驗(yàn)用水：采用符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水

對(duì)照品

5.3.1水溶性

VC標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，CAS號(hào)：50-81-7。

VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1mg/mL）：稱取0.001g（精確到0.0001g）VC于離心管中，加入1mL三級(jí)水，

振蕩至粉末完全溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.3.2醇溶性

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥97%，PubChemCID：2246。

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（3mM）：稱取0.001g（精確到0.0001g）蝦青素于2mL離心管中，加入558μ

L二甲基亞砜（DMSO）。將離心管超聲30min后置于80