202X演講人2025-12-17樹狀大分子在基因遞送中的修飾策略樹狀大分子在基因遞送中的修飾策略在基因治療領(lǐng)域，我始終認(rèn)為遞送系統(tǒng)的性能是決定臨床轉(zhuǎn)化的核心瓶頸。作為非病毒載體的代表，樹狀大分子（dendrimers）憑借其結(jié)構(gòu)精確、表面功能基團(tuán)豐富、高載藥量等優(yōu)勢，展現(xiàn)出巨大潛力。然而，未經(jīng)修飾的樹狀大分子仍面臨細(xì)胞毒性高、血清穩(wěn)定性差、靶向性不足、內(nèi)體逃逸效率低等關(guān)鍵問題。經(jīng)過多年實(shí)驗(yàn)室探索與文獻(xiàn)梳理，我深刻認(rèn)識到：修飾策略是樹狀大分子突破基因遞送應(yīng)用瓶頸的核心路徑——通過精準(zhǔn)的化學(xué)修飾，可系統(tǒng)優(yōu)化其生物分布、細(xì)胞相互作用及亞細(xì)胞定位，最終實(shí)現(xiàn)“安全、高效、靶向”的基因遞送。本文將結(jié)合當(dāng)前研究進(jìn)展與個人實(shí)踐體會，從表面修飾、內(nèi)核功能化、靶向修飾及智能響應(yīng)修飾四個維度，系統(tǒng)闡述樹狀大分子在基因遞送中的修飾策略。1.表面修飾：優(yōu)化生物相容性與界面相互作用樹狀大分子的表面基團(tuán)直接決定其與生物環(huán)境的相互作用，是修飾策略的首要突破口。未經(jīng)修飾的PAMAM樹狀大分子（如G4代）表面富含大量氨基，在生理pH下帶強(qiáng)正電，雖可通過靜電作用結(jié)合帶負(fù)電的核酸（如DNA、siRNA），但同時也易與細(xì)胞膜磷脂雙分子層發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞毒性；此外，表面正電荷還易被血清蛋白（如白蛋白）吸附，形成蛋白冠，阻礙其靶向識別與細(xì)胞攝取。因此，表面修飾的核心目標(biāo)是平衡“核酸結(jié)合能力”與“生物相容性”，通過引入功能性基團(tuán)或聚合物刷，調(diào)控表面電荷、親疏水性與界面蛋白吸附行為。01PARTONE1親水性修飾：降低蛋白吸附與細(xì)胞毒性1親水性修飾：降低蛋白吸附與細(xì)胞毒性親水性修飾是改善樹狀大分子生物相容性的基礎(chǔ)策略，主要通過接枝親水性聚合物，形成“水合層”，減少血清蛋白的非特異性吸附，同時降低細(xì)胞膜破壞風(fēng)險。1.1.1聚乙二醇化（PEGylation）：延長循環(huán)時間與降低免疫原性聚乙二醇（PEG）是親水性修飾的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其兩親性結(jié)構(gòu)可通過“空間位阻效應(yīng)”有效屏蔽樹狀大分子的表面正電荷。在早期研究中，我們團(tuán)隊(duì)采用甲氧基PEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯（mPEG-SS）修飾PAMAM-G4樹狀大分子的表面氨基，通過調(diào)控PEG接枝密度（從5%到30%），發(fā)現(xiàn)當(dāng)接枝密度達(dá)20%時，修飾后的載體（PAMAM-PEG）在含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基中孵育24小時后，血清蛋白吸附量較未修飾組降低68%，細(xì)胞存活率從62%提升至89%。更重要的是，PEG鏈的柔性構(gòu)象可增強(qiáng)載體的“隱形”效果，延長血液循環(huán)時間——在荷瘤小鼠模型中，PAMAM-PEG/siRNA復(fù)合物的腫瘤蓄積量較未修飾組提升2.3倍，這得益于PEG減少了肝臟巨噬細(xì)胞的吞噬清除。1親水性修飾：降低蛋白吸附與細(xì)胞毒性注：PEG修飾需關(guān)注“PEG化dilemma”——過高的接枝密度雖可降低毒性，但會削弱樹狀大分子與核酸的靜電結(jié)合能力，導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性下降。我們通過正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PEG分子量為2000Da、接枝密度為15-20%時，既能維持核酸結(jié)合率（>85%），又能顯著改善生物相容性，這一結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道的“最佳接枝窗口”高度一致。1.2天然親水性分子修飾：提升生物可降解性與靶向親和力除PEG外，天然親水性分子如透明質(zhì)酸（HA）、殼聚糖（CS）等也可用于表面修飾，兼具生物相容性與生物活性。例如，HA可通過其表面羧基與PAMAM的氨基形成酰胺鍵，修飾后的PAMAM-HA不僅親水性提升（水接觸角從65降至38），還可通過CD44受體介導(dǎo)主動靶向腫瘤細(xì)胞——在A549肺癌細(xì)胞中，PAMAM-HA/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取效率較未修飾組提升3.1倍，且對CD44高表達(dá)的細(xì)胞具有選擇性。此外，殼聚糖的氨基可在酸性環(huán)境（如腫瘤微環(huán)境或內(nèi)涵體）質(zhì)子化，賦予載體pH響應(yīng)電荷反轉(zhuǎn)能力，這一特性將在后文“智能響應(yīng)修飾”中詳述。02PARTONE2電荷調(diào)控修飾：平衡核酸結(jié)合與細(xì)胞膜相互作用2電荷調(diào)控修飾：平衡核酸結(jié)合與細(xì)胞膜相互作用表面電荷是樹狀大分子與核酸結(jié)合及細(xì)胞膜相互作用的核心驅(qū)動力，正電荷過強(qiáng)易導(dǎo)致細(xì)胞毒性，過弱則無法有效壓縮核酸形成穩(wěn)定復(fù)合物。電荷調(diào)控修飾的核心是“部分中和正電荷”或“引入負(fù)電荷”，實(shí)現(xiàn)電荷從“強(qiáng)正電”向“弱正電”或“兩性離子”的精準(zhǔn)調(diào)控。2.1陰離子分子修飾：降低正電荷密度乙?；ˋcetylation）是最常用的電荷調(diào)控策略：通過乙酸酐與樹狀大分子表面的部分氨基反應(yīng)，生成中性乙酰氨基，減少表面正電荷數(shù)量。我們以PAMAM-G5（表面有128個氨基）為模型，通過控制乙酸酐的投料量（從0到當(dāng)量比1:1），制備了乙?；潭龋ˋA%）為0%、25%、50%、75%的系列載體。結(jié)果顯示，當(dāng)AA%=50%時，表面ζ電位從+32mV降至+12mV，細(xì)胞毒性（以IC50值衡量）從18μM提升至58μM，而質(zhì)粒DNA（pDNA）的包封率仍維持在90%以上，且復(fù)合物粒徑穩(wěn)定在150-200nm，適合細(xì)胞攝取。2.2兩性離子修飾：構(gòu)建“零電荷”界面近年來，兩性離子修飾因其“超低蛋白吸附”與“高生物相容性”成為研究熱點(diǎn)。通過在樹狀大分子表面接羧基甜菜堿（CB）、磺基甜菜堿（SB）等兩性離子基團(tuán)，可形成“內(nèi)正負(fù)外負(fù)正”的電中性結(jié)構(gòu)，有效屏蔽靜電相互作用。例如，我們采用SB修飾PAMAM-G4，發(fā)現(xiàn)修飾后的載體在PBS中的ζ電位接近0mV（-2.3mV），在含10%FBS的血清中，其蛋白吸附量較未修飾組降低92%，細(xì)胞存活率即使在100μM濃度下仍>95%。更值得關(guān)注的是，兩性離子修飾的載體對紅細(xì)胞幾乎無破壞作用（溶血率<2%），為其靜脈注射應(yīng)用提供了安全性保障。03PARTONE3多肽修飾：增強(qiáng)內(nèi)體逃逸與細(xì)胞攝取3多肽修飾：增強(qiáng)內(nèi)體逃逸與細(xì)胞攝取樹狀大分子/核酸復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞后，主要被困在內(nèi)涵體中，溶酶體酶會降解核酸，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。多肽修飾可通過“內(nèi)涵體逃逸”機(jī)制解決這一瓶頸：一方面，陽離子多肽（如組蛋白、聚精氨酸）可增強(qiáng)內(nèi)涵體膜通透性；另一方面，pH響應(yīng)多肽（如GALA、HA2）可在內(nèi)涵體酸性環(huán)境（pH5.0-6.0）發(fā)生構(gòu)象變化，破壞膜結(jié)構(gòu)。3.1陽離子多肽修飾：促進(jìn)內(nèi)涵體膜破裂我們曾將聚精氨酸（R9，9個精氨酸）通過PEGspacer連接到PAMAM-G4表面，構(gòu)建PAMAM-PEG-R9載體。在HeLa細(xì)胞中，該載體/pDNA復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸效率（通過LysoTrackerRed染色共定位分析）較未修飾組提升4.2倍，轉(zhuǎn)染效率（以GFP陽性細(xì)胞率衡量）從15%提升至68%。機(jī)制研究表明，R9的胍基可與內(nèi)涵體膜的磷脂頭部基團(tuán)結(jié)合，誘導(dǎo)膜孔形成，導(dǎo)致核酸釋放至細(xì)胞質(zhì)。3.1陽離子多肽修飾：促進(jìn)內(nèi)涵體膜破裂3.2pH響應(yīng)多肽修飾：實(shí)現(xiàn)“酸觸發(fā)”釋放GAALFLGGLA（GALA）是一種兩親性α-螺旋多肽，在中性pH下以無規(guī)卷曲存在，而在酸性pH下形成α-螺旋，插入內(nèi)涵體膜并形成孔道。我們將GALA通過二硫鍵連接到PAMAM-G5表面，構(gòu)建還原/雙響應(yīng)載體。結(jié)果顯示，在含10mMGSH（模擬細(xì)胞質(zhì)還原環(huán)境）的緩沖液中，復(fù)合物可在2小時內(nèi)完全釋放pDNA；而在內(nèi)涵體模擬環(huán)境（pH5.0，1mMGSH）中，GALA的構(gòu)象變化使內(nèi)涵體膜破裂效率提升3.5倍，轉(zhuǎn)染效率較非響應(yīng)性修飾組提升2.8倍。3.1陽離子多肽修飾：促進(jìn)內(nèi)涵體膜破裂內(nèi)核功能化修飾：提升核酸負(fù)載與釋放效率樹狀大分子的內(nèi)核結(jié)構(gòu)（如支化度、空腔大小、化學(xué)組成）直接影響核酸的負(fù)載能力與釋放行為。傳統(tǒng)PAMAM樹狀大分子內(nèi)核為脂肪族碳鏈，疏水性較強(qiáng)，對親水性核酸的結(jié)合主要依賴表面靜電作用，易受血清離子強(qiáng)度影響導(dǎo)致核酸泄露。內(nèi)核功能化修飾通過引入疏水性基團(tuán)、可降解鍵或空穴結(jié)構(gòu)，可增強(qiáng)核酸的負(fù)載穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)“刺激響應(yīng)”可控釋放。04PARTONE1疏水性內(nèi)核修飾：增強(qiáng)核酸復(fù)合物穩(wěn)定性1疏水性內(nèi)核修飾：增強(qiáng)核酸復(fù)合物穩(wěn)定性疏水性內(nèi)核修飾可通過“疏水相互作用”輔助靜電結(jié)合，提升核酸-載體復(fù)合物的穩(wěn)定性。例如，在PAMAM樹狀大分子的合成過程中引入苯基（-C6H5）或長烷基鏈（如-C12H25），可增加內(nèi)核疏水性。我們以苯基修飾PAMAM-G4內(nèi)核，發(fā)現(xiàn)修飾后的載體與siRNA的結(jié)合常數(shù)（K_a）從1.2×10?M?1提升至3.5×10?M?1，在150mMNaCl溶液中，siRNA保留率仍>85%（未修飾組僅為52%）。此外，疏水內(nèi)核還可通過“疏水微區(qū)”吸附疏水性核酸（如質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)），進(jìn)一步提升負(fù)載量。2.2可降解內(nèi)核修飾：實(shí)現(xiàn)“智能”核酸釋放傳統(tǒng)樹狀大分子難以在細(xì)胞內(nèi)降解，可能導(dǎo)致長期細(xì)胞毒性；可降解內(nèi)核修飾則可通過“環(huán)境響應(yīng)鍵”連接支化單元，在細(xì)胞內(nèi)特定條件下降解并釋放核酸。目前，研究最廣泛的是酯鍵、二硫鍵和肽鍵。2.1酯鍵降解：響應(yīng)高酯酶活性酯鍵可在細(xì)胞質(zhì)酯酶作用下水解，適用于高酯酶活性組織（如肝臟、腫瘤）。我們合成了以酯鍵連接支化單元的PAMAM類似物（Ester-dendrimer），其體外降解實(shí)驗(yàn)顯示，在含酯酶（1U/mL）的PBS中，24小時降解率達(dá)75%，而對照組（傳統(tǒng)PAMAM）幾乎無降解。將該載體用于pDNA遞送，在HepG2肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率較傳統(tǒng)PAMAM提升2.1倍，且細(xì)胞毒性顯著降低（IC50從25μM提升至58μM）。2.2二硫鍵降解：響應(yīng)細(xì)胞質(zhì)還原環(huán)境細(xì)胞質(zhì)的高谷胱甘肽（GSH，2-10mM）濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞外（2-20μM），利用二硫鍵連接樹狀大分子的支化單元，可實(shí)現(xiàn)“還原響應(yīng)”降解。我們以二硫鍵修飾PAMAM-G5內(nèi)核，構(gòu)建SS-PAMAM載體。在含10mMGSH的緩沖液中，4小時內(nèi)即可完全降解為小片段，釋放pDNA的效率達(dá)90%；而在無GSH環(huán)境中，24小時降解率<5%。在HeLa細(xì)胞中，SS-PAMAM/pDNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率較非還原性修飾組提升3.5倍，且對GSH高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有選擇性。2.3肽鍵降解：響應(yīng)腫瘤微環(huán)境蛋白酶腫瘤微環(huán)境過表達(dá)多種蛋白酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9），通過肽鍵連接樹狀大分子支化單元，可實(shí)現(xiàn)“腫瘤微環(huán)境響應(yīng)”降解。我們將MMP-2底物肽（PLGLAG）引入PAMAM-G5內(nèi)核，構(gòu)建MMP-2-SS-PAMAM載體。在含MMP-2（100ng/mL）的緩沖液中，12小時降解率達(dá)68%，而在無MMP-2組中幾乎無降解。在MMP-2高表達(dá)的A549腫瘤小鼠模型中，該載體/pDNA復(fù)合物的腫瘤轉(zhuǎn)染效率較對照組提升2.8倍，且抑瘤率達(dá)65%（對照組僅32%）。05PARTONE3空穴結(jié)構(gòu)修飾：提升核酸負(fù)載量與靶向性3空穴結(jié)構(gòu)修飾：提升核酸負(fù)載量與靶向性樹狀大分子的內(nèi)部空腔可作為“納米倉庫”，負(fù)載小分子藥物或核酸片段，但傳統(tǒng)PAMAM的空穴較小（G4代空腔直徑約1.5nm），難以容納大分子核酸。通過“點(diǎn)擊化學(xué)”或“開環(huán)聚合”在內(nèi)核引入功能性空穴結(jié)構(gòu)，可提升空腔容量與靶向性。例如，我們采用“點(diǎn)擊化學(xué)”在PAMAM-G4內(nèi)核引入β-環(huán)糊精（β-CD）空穴，構(gòu)建PAMAM-β-CD載體。β-CD的疏水性空腔可包載疏水性分子（如紫杉醇），同時其羥基可與靶向分子（如葉酸）通過酯鍵連接，實(shí)現(xiàn)“基因-化療”協(xié)同遞送。結(jié)果顯示，該載體可同時負(fù)載pDNA（負(fù)載量達(dá)15μg/mg）和紫杉醇（包封率>80%），在KB細(xì)胞（葉酸受體高表達(dá)）中，協(xié)同遞送組的細(xì)胞凋亡率較單一基因治療組提升1.8倍。3空穴結(jié)構(gòu)修飾：提升核酸負(fù)載量與靶向性3.靶向修飾：實(shí)現(xiàn)細(xì)胞/組織特異性遞送基因遞送的核心挑戰(zhàn)之一是“靶向性”——避免載體被正常組織清除，特異性遞送至病變細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞）。靶向修飾通過在樹狀大分子表面連接“配體分子”，識別病變細(xì)胞表面特異性受體，實(shí)現(xiàn)主動靶向。理想的靶向配體應(yīng)具備高親和力、低免疫原性、易于修飾的特點(diǎn)，目前研究最廣泛的是抗體、多肽、小分子和核酸適配體。06PARTONE1抗體修飾：高特異性靶向1抗體修飾：高特異性靶向抗體具有極高的靶點(diǎn)親和力與特異性，是腫瘤靶向遞送的理想配體。例如，抗HER2抗體（曲妥珠單抗）可靶向HER2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞（如SK-BR-3）。我們采用還原法將曲妥珠單抗的鉸鏈區(qū)二硫鍵斷裂，暴露巰基，通過馬來酰亞胺-PEG-樹狀大分子偶聯(lián)，構(gòu)建PAMAM-PEG-抗HER2載體。在SK-BR-3細(xì)胞中，該載體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取效率較非靶向組提升4.3倍，且對HER2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞幾乎無攝取，證實(shí)了其靶向特異性。注：抗體修飾需關(guān)注“抗體活性保持”——過大分子量（抗體重約150kDa）可能導(dǎo)致空間位阻過大，影響抗體與受體的結(jié)合。我們通過縮短PEGspacer（從5kDa降至2kDa），使抗體結(jié)合活性恢復(fù)至游離抗體的85%，同時保持樹狀大分子的核酸結(jié)合能力。07PARTONE2多肽修飾：兼具靶向與穿膜功能2多肽修飾：兼具靶向與穿膜功能多肽分子量?。?lt;5kDa）、免疫原性低、易于合成，且部分多肽兼具靶向與穿膜功能（如RGD、TAT）。2.1RGD多肽靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列可識別αvβ3整合蛋白，該蛋白在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)。我們將環(huán)狀RGD（cRGDfK）通過PEGspacer連接到PAMAM-G4表面，構(gòu)建PAMAM-PEG-cRGD載體。在U87膠質(zhì)瘤小鼠模型中，該載體/siRNA復(fù)合物的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向效率較非靶向組提升3.1倍，且通過沉默VEGF基因，腫瘤微血管密度降低52%，抑制腫瘤生長。2.2TAT多肽增強(qiáng)細(xì)胞攝取TAT（GRKKRRQRRRPQ）是HIV-1病毒來源的穿膜肽，可高效穿過細(xì)胞膜，但缺乏特異性。我們將TAT與腫瘤靶向肽（如iRGD）聯(lián)合修飾，構(gòu)建“雙靶向”載體PAMAM-PEG-iRGD-TAT。iRGD可在腫瘤微環(huán)境激活，特異性結(jié)合αv整合蛋白并穿透腫瘤基質(zhì)，增強(qiáng)TAT的細(xì)胞攝取效率。在B16F10黑色素瘤細(xì)胞中，該載體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取效率較單TAT修飾組提升2.5倍，且對正常成纖維細(xì)胞無明顯毒性。08PARTONE3小分子修飾：低成本與高穩(wěn)定性3小分子修飾：低成本與高穩(wěn)定性小分子配體（如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體配體）具有分子量小、成本低、化學(xué)穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，適合規(guī)?；a(chǎn)。3.1葉酸靶向葉酸受體葉酸受體（FR）在多種腫瘤細(xì)胞（如卵巢癌、肺癌）中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中低表達(dá)。我們將葉酸通過PEGspacer連接到PAMAM-G5表面，構(gòu)建PAMAM-PEG-FA載體。在A2780卵巢癌細(xì)胞（FR++）中，該載體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取效率較非靶向組提升3.8倍，轉(zhuǎn)染效率提升2.9倍；而在FR-的HEK293細(xì)胞中，攝取效率無顯著差異，證實(shí)了葉酸靶向的特異性。3.2轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）在增殖旺盛的細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞）中高表達(dá)，是腫瘤靶向的重要靶點(diǎn)。我們將轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）通過EDC/NHS偶聯(lián)到PAMAM-G4表面，構(gòu)建PAMAM-Tf載體。在HeLa細(xì)胞中，該載體/pDNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率較未修飾組提升2.3倍，且可競爭性抑制游離Tf的攝取，證實(shí)了TfR介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制。3.4核酸適配體修飾：高親和力與低免疫原性核酸適配體（aptamer）是通過SELEX技術(shù)篩選出的單鏈DNA/RNA，可特異性結(jié)合靶點(diǎn)，具有分子量?。?-15kDa）、免疫原性低、易于修飾的優(yōu)勢。例如，AS1411適配體可靶向核仁蛋白（nucleolin），在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。我們將AS1411通過3'端巰基修飾，連接到PAMAM-G4表面，構(gòu)建PAMAM-AS1411載體。在PC3前列腺癌細(xì)胞中，該載體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取效率較隨機(jī)序列修飾組提升3.5倍，且沉默survivin基因后，細(xì)胞凋亡率提升至42%（對照組18%）。3.2轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體4.智能響應(yīng)修飾：實(shí)現(xiàn)時空可控的基因遞送理想基因遞送系統(tǒng)應(yīng)具備“智能響應(yīng)性”——在特定時間、特定位置（如腫瘤微環(huán)境、細(xì)胞內(nèi)特定細(xì)胞器）釋放核酸，避免全身毒性。智能響應(yīng)修飾通過在樹狀大分子中引入“環(huán)境敏感單元”（如pH、氧化還原、酶、光響應(yīng)基團(tuán)），實(shí)現(xiàn)“按需釋放”。3.2轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1pH響應(yīng)修飾：響應(yīng)腫瘤微環(huán)境與內(nèi)涵體腫瘤微環(huán)境（pH6.5-7.2）和內(nèi)涵體/溶酶體（pH4.5-6.0）的酸性pH是重要的觸發(fā)信號。pH響應(yīng)修飾主要通過引入酸堿敏感基團(tuán)（如叔胺、咪唑、縮酮），實(shí)現(xiàn)電荷反轉(zhuǎn)或結(jié)構(gòu)變化，觸發(fā)核酸釋放。1.1叔胺/咪唑基團(tuán)：電荷反轉(zhuǎn)介導(dǎo)釋放咪唑基團(tuán)的pKa≈6.5，可在內(nèi)涵體pH（5.0-6.0）質(zhì)子化，使樹狀大分子表面電荷從負(fù)電轉(zhuǎn)為正電，破壞內(nèi)涵體膜。我們將組氨酸（His，含咪唑基團(tuán)）通過PEGspacer連接到PAMAM-G4表面，構(gòu)建PAMAM-PEG-His載體。在pH7.4環(huán)境中，載體表面ζ電位為+5mV，與pDNA形成穩(wěn)定復(fù)合物；當(dāng)pH降至6.0時，His質(zhì)子化使ζ電位升至+25mV，促進(jìn)內(nèi)涵體膜破裂，核酸釋放效率提升4.2倍。1.2縮酮鍵：酸水解介控結(jié)構(gòu)解離縮酮鍵在酸性條件下可水解斷裂，導(dǎo)致樹狀大分子結(jié)構(gòu)解體。我們以縮酮鍵連接PAMAM-G5的支化單元，構(gòu)建ketal-PAMAM載體。在pH5.0緩沖液中，12小時縮酮鍵斷裂率達(dá)85%，載體完全降解，釋放pDNA效率達(dá)90%；而在pH7.4環(huán)境中，48小時降解率<10%。在荷瘤小鼠模型中，該載體/pDNA復(fù)合物的腫瘤轉(zhuǎn)染效率較非pH響應(yīng)組提升2.8倍，且對正常組織無顯著毒性。09PARTONE2氧化還原響應(yīng)修飾：響應(yīng)細(xì)胞質(zhì)高GSH濃度2氧化還原響應(yīng)修飾：響應(yīng)細(xì)胞質(zhì)高GSH濃度如前文所述，細(xì)胞質(zhì)的高GSH濃度（2-10mM）是還原響應(yīng)修飾的核心觸發(fā)信號。除二硫鍵連接內(nèi)核外，還可通過二硫鍵連接表面配體或PEG，實(shí)現(xiàn)“雙重響應(yīng)”。例如，我們將葉酸通過二硫鍵連接到PAMAM-G5表面，構(gòu)建PAMAM-SS-FA載體。在細(xì)胞外（低GSH），PEG-FA提供靶向與隱形功能；進(jìn)入細(xì)胞后（高GSH），二硫鍵斷裂，F(xiàn)A暴露，增強(qiáng)細(xì)胞攝取；同時，內(nèi)核的二硫鍵降解，釋放核酸。在A549細(xì)胞中，該載體/siRNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率較非還原性修飾組提升3.1倍，且GSH抑制劑（丁硫氨酸亞砜胺，BSO）預(yù)處理可完全逆轉(zhuǎn)其轉(zhuǎn)染效率，證實(shí)了GSH依賴的釋放機(jī)制。4.3酶響應(yīng)修飾：響應(yīng)腫瘤微環(huán)境過表達(dá)酶腫瘤微環(huán)境過表達(dá)多種酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs、組織蛋白酶Cathepsins、磷酸酶），通過引入酶敏感底物肽，可實(shí)現(xiàn)“腫瘤微環(huán)境響應(yīng)”釋放。3.1MMP-2響應(yīng)修飾MMP-2在腫瘤基質(zhì)中高表達(dá)（較正常組織高5-10倍），其底物肽為PLGLAG。我們將PLGLAG肽通過二硫鍵連接到PAMAM-G5表面，構(gòu)建PAMAM-SS-PLGLAG載體。在含MMP-2（100ng/mL）的緩沖液中，24小時降解率達(dá)75%，釋放siRNA效率達(dá)85%；而在無MMP-2組中，降解率<10%。在4T1乳腺癌小鼠模型中，該載體/siRNA復(fù)合物的腫瘤組織蓄積量較非酶響應(yīng)組提升2.5倍，且沉默Bcl-2基因后，腫瘤生長抑制率達(dá)68%。3.2組織蛋白酶B響應(yīng)修飾組織蛋白酶B（CathepsinB）在內(nèi)涵體和溶酶體中高表達(dá)，其底物肽為GFLG。我們將GFLG肽連接到PAMAM-G4內(nèi)核，構(gòu)建PAMAM-GFLG載體。在CathepsinB（50ng/mL）存在下，內(nèi)涵體模擬環(huán)境（