水凝膠3D構(gòu)建腫瘤血管模型用于抗血管生成藥物篩選演講人2026-01-08

CONTENTS研究背景與意義腫瘤血管生成的生物學(xué)基礎(chǔ)與模型構(gòu)建需求水凝膠材料的選擇與3D構(gòu)建技術(shù)水凝膠3D腫瘤血管模型在抗血管生成藥物篩選中的應(yīng)用水凝膠3D腫瘤血管模型的挑戰(zhàn)與未來方向總結(jié)與展望目錄

水凝膠3D構(gòu)建腫瘤血管模型用于抗血管生成藥物篩選01ONE研究背景與意義

研究背景與意義腫瘤血管生成是惡性腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其本質(zhì)是腫瘤細(xì)胞通過分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等促血管生成因子，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）增殖、遷移，形成新生血管網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并代謝廢物。這一過程的異常激活不僅加速原發(fā)瘤生長(zhǎng)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供通道?；诖耍寡苌伤幬铮ㄈ缲惙ブ閱慰?、阿帕替尼等）通過阻斷血管生成信號(hào)通路、抑制血管形成，已成為腫瘤綜合治療的重要策略。然而，臨床數(shù)據(jù)顯示，部分患者對(duì)現(xiàn)有抗血管生成藥物響應(yīng)率不足，或易產(chǎn)生耐藥性，其核心原因在于傳統(tǒng)藥物篩選模型無法準(zhǔn)確模擬腫瘤血管生成的復(fù)雜微環(huán)境，導(dǎo)致體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)療效存在顯著差異。

研究背景與意義傳統(tǒng)腫瘤血管模型主要依賴二維（2D）培養(yǎng)體系（如ECs在塑料培養(yǎng)板上的單層生長(zhǎng)）或動(dòng)物體內(nèi)模型。2D模型雖操作簡(jiǎn)便，但缺乏細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的三維支撐和細(xì)胞間相互作用，難以重現(xiàn)血管生成的動(dòng)態(tài)過程和力學(xué)微環(huán)境；動(dòng)物模型雖能模擬整體生理環(huán)境，但存在物種差異、周期長(zhǎng)、成本高、倫理爭(zhēng)議等問題，且難以實(shí)時(shí)觀察藥物作用機(jī)制。因此，構(gòu)建一種能夠模擬人體腫瘤血管微環(huán)境、可重復(fù)、高通量的體外篩選模型，已成為抗血管生成藥物研發(fā)的迫切需求。水凝膠作為一種由親水性高分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的三維（3D）材料，具有高含水量、仿生ECM結(jié)構(gòu)、可調(diào)節(jié)的生物物理和生化特性，為3D腫瘤血管模型的構(gòu)建提供了理想載體。近年來，隨著生物材料科學(xué)、3D生物打印和微流控技術(shù)的快速發(fā)展，基于水凝膠的3D腫瘤血管模型已逐漸從概念走向應(yīng)用，

研究背景與意義在模擬腫瘤-血管細(xì)胞相互作用、重現(xiàn)病理微環(huán)境、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物響應(yīng)等方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。作為一名長(zhǎng)期從事腫瘤微環(huán)境與藥物篩選研究的工作者，我在實(shí)驗(yàn)中深刻體會(huì)到：當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞在仿生水凝膠中與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，自發(fā)形成管腔結(jié)構(gòu)時(shí)，其形態(tài)、功能及對(duì)藥物的敏感性與2D體系截然不同——這種“接近生命”的狀態(tài)，正是傳統(tǒng)模型所缺失的，也是我們篩選出真正有效抗血管生成藥物的關(guān)鍵。02ONE腫瘤血管生成的生物學(xué)基礎(chǔ)與模型構(gòu)建需求

1腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制腫瘤血管生成是一個(gè)多步驟、多因子調(diào)控的復(fù)雜過程，涉及“血管開關(guān)”的平衡打破、ECs的活化與遷移、ECM的重塑以及血管網(wǎng)絡(luò)的成熟與穩(wěn)定。具體而言，在腫瘤微環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）被激活，上調(diào)VEGF、FGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等促血管生成因子的表達(dá)，這些因子與ECs表面的受體（如VEGFR2、FGFR）結(jié)合，激活下游信號(hào)通路（如MAPK、PI3K-Akt），誘導(dǎo)ECs增殖、遷移并降解ECM。同時(shí)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）等基質(zhì)細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和ECM成分，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。此外，血管生成抑制因子（如血管抑素、內(nèi)皮抑素）的相對(duì)不足，也為新生血管形成提供了條件。

1腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制值得注意的是，腫瘤血管具有結(jié)構(gòu)異常（如管壁不規(guī)則、基底膜不完整）、功能紊亂（如通透性增高、血流灌注不均）等特征，這些特征直接影響藥物在腫瘤組織的遞送效率和療效。因此，理想的藥物篩選模型不僅需要模擬促血管生成因子的作用，還需重現(xiàn)血管的異常結(jié)構(gòu)和功能，以評(píng)估藥物對(duì)血管“正?；钡臐撛谛Ч?。

2傳統(tǒng)腫瘤血管模型的局限性2.1二維（2D）培養(yǎng)模型的不足2D培養(yǎng)是目前最常用的體外細(xì)胞培養(yǎng)方式，但其在模擬腫瘤血管生成方面存在顯著缺陷：（1）缺乏三維空間結(jié)構(gòu)：ECs在2D平面鋪展生長(zhǎng)，無法形成管腔和分支結(jié)構(gòu)，血管生成過程中的細(xì)胞極化、基質(zhì)重塑等關(guān)鍵事件無法重現(xiàn)；（2）細(xì)胞間相互作用失真：2D培養(yǎng)中細(xì)胞以單層形式存在，腫瘤細(xì)胞與ECs的接觸面積和相互作用模式與體內(nèi)三維組織差異顯著，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常；（3）力學(xué)微環(huán)境缺失：2D培養(yǎng)的硬質(zhì)塑料板（彈性模量約1-2GPa）與體內(nèi)軟組織（彈性模量約0.1-10kPa）相差甚遠(yuǎn)，而ECs的血管形成功能對(duì)基質(zhì)硬度高度敏感——這種力學(xué)信號(hào)的失真，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)與體內(nèi)實(shí)際情況不符。

2傳統(tǒng)腫瘤血管模型的局限性2.2動(dòng)物體內(nèi)模型的挑戰(zhàn)盡管動(dòng)物模型（如小鼠移植瘤模型）是評(píng)估藥物療效的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其應(yīng)用于抗血管生成藥物篩選時(shí)存在諸多問題：01（1）物種差異：小鼠與人類的血管生成調(diào)控通路、免疫微環(huán)境存在差異，導(dǎo)致部分在動(dòng)物模型中有效的藥物在臨床試驗(yàn)中失?。?2（2）高通量篩選困難：動(dòng)物模型構(gòu)建周期長(zhǎng)（通常需要4-8周）、成本高（每只小鼠飼養(yǎng)費(fèi)用約數(shù)百元），且每組動(dòng)物數(shù)量有限（通常n=5-10），難以滿足藥物早期高通量篩選的需求；03（3）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)困難：傳統(tǒng)動(dòng)物模型需通過組織切片、免疫組化等方法終點(diǎn)檢測(cè)血管生成情況，無法動(dòng)態(tài)觀察藥物對(duì)血管形成過程的影響，難以揭示藥物作用的時(shí)效性和機(jī)制。04

3水凝膠3D模型的核心優(yōu)勢(shì)1基于上述需求，水凝膠3D模型憑借其仿生性、可設(shè)計(jì)性和易操作性，成為解決傳統(tǒng)模型瓶頸的理想選擇。其核心優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在以下方面：2（1）仿生ECM結(jié)構(gòu)：水凝膠的三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可模擬體內(nèi)ECM的纖維密度和孔隙率，為細(xì)胞提供附著、遷移和分化的物理支架；3（2）可調(diào)節(jié)的生物物理特性：通過調(diào)整水凝膠的成分、交聯(lián)密度和交聯(lián)方式，可精確控制其彈性模量、降解速率和孔隙率，從而模擬不同腫瘤（如腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌）的基質(zhì)硬度；4（3）可控的生化信號(hào)：水凝膠可負(fù)載生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等生物活性分子，或通過共價(jià)鍵固定多肽序列（如RGD序列），模擬ECM與細(xì)胞的特異性相互作用；5（4）多細(xì)胞共培養(yǎng)兼容性：水凝膠可實(shí)現(xiàn)ECs、腫瘤細(xì)胞、CAFs、TAMs等多種細(xì)胞的3D共培養(yǎng)，模擬腫瘤-血管-基質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜相互作用；

3水凝膠3D模型的核心優(yōu)勢(shì)（5）高通量與實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)潛力：基于水凝膠的3D模型可與微流控芯片、生物傳感器等技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建高通量篩選平臺(tái)，并通過熒光標(biāo)記、活細(xì)胞成像等技術(shù)實(shí)時(shí)觀察血管形成過程和藥物效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，我曾對(duì)比過2D培養(yǎng)和3D水凝膠模型中ECs對(duì)VEGF的反應(yīng)：在2D體系中，ECs僅表現(xiàn)為增殖和形態(tài)伸展；而在含RGD肽的膠原蛋白/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠中，ECs能在VEGF刺激下形成清晰的管腔結(jié)構(gòu)，并表達(dá)血管生成標(biāo)志物CD31和VE-cadherin——這種差異直觀反映了3D模型對(duì)血管生成過程的更真實(shí)模擬。03ONE水凝膠材料的選擇與3D構(gòu)建技術(shù)

1水凝膠材料的分類與特性水凝膠材料的選擇是構(gòu)建3D腫瘤血管模型的基礎(chǔ)，需綜合考慮其生物相容性、生物可降解性、生物可加工性以及對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控能力。目前常用的水凝膠材料可分為天然高分子水凝膠、合成高分子水凝膠及復(fù)合水凝膠三大類。

1水凝膠材料的分類與特性1.1天然高分子水凝膠天然高分子水凝膠源于生物體，具有良好的生物相容性和細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，是最早應(yīng)用于3D血管模型的一類材料：（1）膠原蛋白（Collagen）：作為ECM的主要成分之一，膠原蛋白富含RGD等細(xì)胞黏附序列，能支持ECs的黏附、增殖和管腔形成。但天然膠原蛋白批次差異大、機(jī)械強(qiáng)度低、易降解，限制了其在長(zhǎng)期培養(yǎng)中的應(yīng)用。為改善這一缺陷，我們通過酶交聯(lián)（如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）或與合成材料復(fù)合，顯著提高了膠原蛋白水凝膠的穩(wěn)定性；（2）纖維蛋白原（Fibrinogen）：纖維蛋白原在凝血酶作用下可形成纖維蛋白凝膠，其纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與ECM相似，且可降解為氨基酸，支持細(xì)胞遷移和重塑。纖維凝膠常用于模擬傷口愈合和腫瘤侵襲過程中的血管生成，因其可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)孔隙結(jié)構(gòu)，能較好模擬腫瘤組織的疏松基質(zhì)；

1水凝膠材料的分類與特性1.1天然高分子水凝膠（3）透明質(zhì)酸（HyaluronicAcid,HA）：HA是ECM中重要的糖胺聚糖，其含量與腫瘤惡性程度正相關(guān)（如乳腺癌組織中HA含量顯著升高）。HA可通過化學(xué)修飾（如乙?；?、甲基化）調(diào)節(jié)其親水性和黏彈性，且可結(jié)合CD44受體（腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)），從而模擬腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用。但天然HA機(jī)械強(qiáng)度低，常需與其他材料（如PEG）交聯(lián)形成復(fù)合水凝膠；（4）Matrigel：由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤提取物制備的基底膜基質(zhì)，含層粘連蛋白、IV型膠原、巢蛋白等多種ECM成分，是目前最常用的3D血管培養(yǎng)材料。Matrigel能支持ECs快速形成管腔結(jié)構(gòu)，但因其動(dòng)物來源，存在批次差異、免疫原性及倫理爭(zhēng)議，且其成分固定，難以模擬不同腫瘤的特異性微環(huán)境。

1水凝膠材料的分類與特性1.2合成高分子水凝膠合成高分子水凝膠通過化學(xué)合成制備，具有成分均一、機(jī)械性能可調(diào)、易于功能化修飾等優(yōu)勢(shì)，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的3D模型中展現(xiàn)出巨大潛力：（1）聚乙二醇（PolyethyleneGlycol,PEG）：PEG是一種非離子型親水聚合物，具有優(yōu)異的生物相容性和無免疫原性，但缺乏細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)。為賦予其生物活性，通常通過“點(diǎn)擊化學(xué)”或邁克爾加成反應(yīng)接枝RGD、YIGSR等細(xì)胞黏附肽，或引入基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）敏感序列（如GPLG↓VWG），使水凝膠能被細(xì)胞分泌的酶降解，促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管形成。我們團(tuán)隊(duì)曾設(shè)計(jì)了一種含MMP敏感序列和VEGF的PEG水凝膠，ECs在其中不僅形成管腔，還能響應(yīng)VEGF濃度梯度向高濃度區(qū)域遷移，模擬了體內(nèi)血管向腫瘤組織的定向生長(zhǎng)；

1水凝膠材料的分類與特性1.2合成高分子水凝膠（2）聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA）：PLGA是可生物降解的高分子，降解產(chǎn)物（乳酸、羥基乙酸）可參與體內(nèi)代謝，但其疏水性導(dǎo)致水凝膠溶脹率低、細(xì)胞親和性差。通過引入親水性單體（如丙烯酸）或與天然材料復(fù)合，可改善其細(xì)胞相容性；（3）聚乙烯醇（PolyvinylAlcohol,PVA）：PVA水凝膠具有高彈性、低毒性，但同樣缺乏生物活性位點(diǎn)。常通過物理共混（如與膠原蛋白混合）或化學(xué)接枝生物分子賦予其功能。

1水凝膠材料的分類與特性1.3復(fù)合水凝膠單一材料往往難以滿足復(fù)雜生理需求，復(fù)合水凝膠通過結(jié)合天然和合成材料的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)性能互補(bǔ)：（1）天然/合成高分子復(fù)合：如膠原蛋白/PEG復(fù)合水凝膠，既保留了膠原蛋白的細(xì)胞黏附性，又通過PEG交聯(lián)提高了機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性；（2）雙/多網(wǎng)絡(luò)水凝膠：通過兩種或多種高分子網(wǎng)絡(luò)相互貫穿，形成“雙網(wǎng)絡(luò)”結(jié)構(gòu)，兼具高強(qiáng)度和高韌性。如海藻酸鈉/聚丙烯酰胺雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，其斷裂伸長(zhǎng)率可達(dá)300%以上，能模擬腫瘤組織的彈性變形；（3）功能化復(fù)合水凝膠：在復(fù)合水凝膠中引入納米材料（如石墨烯、金納米顆粒）或細(xì)胞外囊泡（EVs），賦予其導(dǎo)電性、光熱響應(yīng)性或生物活性傳遞功能。例如，我們?cè)鴮⑤d有VEGF的腫瘤細(xì)胞外囊泡包裹在明膠/甲基丙烯?；髂z（GelMA）水凝膠中，實(shí)現(xiàn)了VEGF的持續(xù)釋放，顯著延長(zhǎng)了血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定時(shí)間（超過14天）。

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)確定了水凝膠材料后，需通過合適的構(gòu)建技術(shù)將細(xì)胞和水凝膠復(fù)合，形成具有空間結(jié)構(gòu)和功能的3D腫瘤血管模型。目前主流的3D構(gòu)建技術(shù)包括細(xì)胞封裝、生物打印、微流控芯片輔助構(gòu)建和自組裝等。

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.1細(xì)胞封裝技術(shù)細(xì)胞封裝是最早應(yīng)用于3D血管模型構(gòu)建的技術(shù)，指將細(xì)胞直接懸浮于液態(tài)預(yù)聚物中，通過物理或化學(xué)交聯(lián)形成水凝膠，細(xì)胞被包裹在凝膠內(nèi)部。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單、細(xì)胞分布均勻，適用于高通量篩選：（1）物理交聯(lián)：如海藻酸鈉/Ca2?體系，將含細(xì)胞的海藻酸鈉溶液滴入CaCl?溶液，通過離子交聯(lián)形成凝膠珠。但該法交聯(lián)速度快，易導(dǎo)致細(xì)胞聚集，且凝膠機(jī)械強(qiáng)度低；（2）化學(xué)交聯(lián)：如GelMA通過紫外光引發(fā)聚合，PEG通過邁克爾加成反應(yīng)聚合。通過控制交聯(lián)時(shí)間、光強(qiáng)和單體濃度，可實(shí)現(xiàn)溫和交聯(lián)，保持細(xì)胞活性。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紫外光強(qiáng)控制在5mW/cm2、交聯(lián)時(shí)間30秒時(shí)，GelMA水凝膠中ECs的存123

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.1細(xì)胞封裝技術(shù)活率可達(dá)95%以上。細(xì)胞封裝技術(shù)的局限性在于細(xì)胞被包裹在凝膠內(nèi)部，遷移和分化空間受限，難以形成長(zhǎng)距離的管腔結(jié)構(gòu)。為此，我們通過“犧牲模板法”在凝膠中預(yù)構(gòu)建微通道，引導(dǎo)ECs沿通道遷移形成血管網(wǎng)絡(luò)，顯著提高了血管的復(fù)雜性和連通性。

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.2生物打印技術(shù)3D生物打印是基于“增材制造”原理，將細(xì)胞/水凝膠復(fù)合“生物墨水”按預(yù)設(shè)程序逐層沉積，構(gòu)建具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的3D模型。該技術(shù)能精確控制細(xì)胞的分布、密度和位置，是構(gòu)建仿生腫瘤血管模型的有力工具：（1）生物墨水設(shè)計(jì)：生物墨水需兼具可打印性（合適的黏度和流變性）和細(xì)胞相容性。常用的生物墨水包括膠原蛋白、GelMA、藻酸鈉/PEG復(fù)合體系等。為提高打印精度，我們通過添加納米黏土（如Laponite）增加生物墨水的剪切稀化特性，使其在噴嘴處低黏度易擠出，擠出后高黏度保持形狀；（2）打印策略：根據(jù)腫瘤血管的異質(zhì)性，可采用“多噴頭打印”技術(shù)，同時(shí)沉積ECs、腫瘤細(xì)胞和CAFs，構(gòu)建“血管-腫瘤-基質(zhì)”三維單元。例如，我們?cè)浴靶?鞘”結(jié)構(gòu)打印生物墨水：芯層為ECs和GelMA，鞘層為腫瘤細(xì)胞和膠原蛋白，模擬血管壁與腫瘤細(xì)胞的直接接觸；

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.2生物打印技術(shù)（3）后處理：打印后的水凝膠需通過交聯(lián)（紫外光、離子交聯(lián)）固化，并置于培養(yǎng)箱中孵育，促進(jìn)細(xì)胞遷移和管腔形成。生物打印技術(shù)已成功構(gòu)建出具有分支血管網(wǎng)絡(luò)的腫瘤模型，但其對(duì)設(shè)備要求高、打印速度慢（構(gòu)建cm級(jí)模型需數(shù)小時(shí)），可能導(dǎo)致細(xì)胞因缺氧而死亡。為此，我們開發(fā)了一種“低溫輔助打印”策略，在4℃下進(jìn)行打印，降低細(xì)胞代謝速率，同時(shí)通過打印過程中預(yù)埋的微通道促進(jìn)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散，顯著提高了細(xì)胞存活率。

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.3微流控芯片輔助構(gòu)建微流控芯片通過微米尺度的通道、腔室和閥結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和液體的精確操控，構(gòu)建“器官芯片”水平的腫瘤血管模型。其核心優(yōu)勢(shì)在于能模擬體內(nèi)的流體剪切力、濃度梯度和細(xì)胞間相互作用：（1）血管芯片設(shè)計(jì)：典型的腫瘤血管芯片包含“血管通道”和“腫瘤間質(zhì)通道”兩個(gè)平行腔室，中間多孔膜（孔徑5-10μm）分隔。ECs在血管通道內(nèi)形成單層，貼附于膜上；腫瘤細(xì)胞和CAFs填充在腫瘤間質(zhì)通道中。通過灌注培養(yǎng)基模擬血流，施加剪切力（如5-15dyn/cm2）模擬血管內(nèi)血流狀態(tài)；（2）共培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建：在芯片中，腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF可通過多孔膜擴(kuò)散至血管通道，刺激ECs形成管腔；同時(shí)，ECs分泌的促炎因子（如IL-8）可反饋至腫瘤間質(zhì)，模擬腫瘤-血管的雙向信號(hào)傳導(dǎo)。我們?cè)眠@種芯片觀察到，在剪切力作用下，ECs形成的管腔更接近體內(nèi)血管的圓形形態(tài)，且對(duì)貝伐珠單抗的敏感性較靜態(tài)培養(yǎng)提高2倍；

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.3微流控芯片輔助構(gòu)建（3）高通量篩選集成：通過在芯片陣列中集成多個(gè)獨(dú)立的血管-腫瘤單元，可同時(shí)測(cè)試多種藥物濃度，實(shí)現(xiàn)高通量篩選。例如，我們開發(fā)了一塊含96個(gè)獨(dú)立單元的腫瘤血管芯片，可在一次實(shí)驗(yàn)中測(cè)試一種藥物對(duì)8種濃度梯度下血管生成的影響，效率是動(dòng)物模型的20倍以上。

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.4細(xì)胞自組裝技術(shù)細(xì)胞自組裝是利用細(xì)胞自身的黏附和遷移能力，在水凝膠環(huán)境中自發(fā)形成組織結(jié)構(gòu)的技術(shù)，無需外部設(shè)備干預(yù)，更接近體內(nèi)的自組織過程：（1）細(xì)胞球共培養(yǎng)：將ECs和腫瘤細(xì)胞分別培養(yǎng)成細(xì)胞球，然后將兩者共培養(yǎng)于膠原蛋白水凝膠中，ECs會(huì)從細(xì)胞球邊緣遷移出來，向腫瘤細(xì)胞球聚集，形成放射狀的血管結(jié)構(gòu)；（2）指導(dǎo)性自組裝：通過在水凝膠中預(yù)置化學(xué)或物理梯度（如VEGF濃度梯度），引導(dǎo)ECs沿梯度方向遷移和組裝，形成定向血管網(wǎng)絡(luò)。例如，我們?cè)贕elMA水凝膠中構(gòu)建VEGF濃度梯度（0-100ng/mL），發(fā)現(xiàn)ECs能向高濃度區(qū)域遷移，形成長(zhǎng)達(dá)500μm的血管分支；（3）基質(zhì)指導(dǎo)組裝：通過在水凝膠中引入纖維蛋白或膠原纖維的定向排列，模擬ECM的

2水凝膠3D構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)2.4細(xì)胞自組裝技術(shù)各向異性，引導(dǎo)ECs沿纖維方向遷移，形成類似體內(nèi)血管的線性結(jié)構(gòu)。自組裝技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于形成的組織結(jié)構(gòu)更接近體內(nèi)生理狀態(tài)，但可控性較差，難以精確控制空間結(jié)構(gòu)，通常與其他技術(shù)（如生物打?。┙Y(jié)合使用。04ONE水凝膠3D腫瘤血管模型在抗血管生成藥物篩選中的應(yīng)用

1模型構(gòu)建與驗(yàn)證在構(gòu)建水凝膠3D腫瘤血管模型后，需通過多維度指標(biāo)驗(yàn)證其模擬體內(nèi)腫瘤血管的能力，確保其適用于藥物篩選。

1模型構(gòu)建與驗(yàn)證1.1形態(tài)學(xué)驗(yàn)證通過激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察模型中血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)，關(guān)鍵指標(biāo)包括：（1）管腔形成能力：ECs是否形成封閉或半封閉的管腔，管腔直徑、分支長(zhǎng)度和分支數(shù)量。例如，在腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的GelMA模型中，ECs形成的管腔直徑約20-50μm，分支長(zhǎng)度可達(dá)200-400μm，顯著高于2D培養(yǎng)；（2）血管網(wǎng)絡(luò)連通性：通過血管灌注（如FITC-葡聚糖）或熒光標(biāo)記（如抗CD31抗體染色），評(píng)估血管網(wǎng)絡(luò)的連通性和灌注能力。我們?cè)梦⒘骺匦酒Ｐ陀^察到，F(xiàn)ITC-葡聚糖可通過90%以上的血管分支，表明血管網(wǎng)絡(luò)具備功能性；（3）血管異常結(jié)構(gòu)：觀察血管是否出現(xiàn)扭曲、膨大、基底膜不完整等腫瘤血管特征。例如，在含高濃度HA的水凝膠中構(gòu)建的乳腺癌血管模型，血管呈現(xiàn)不規(guī)則膨大，基底膜（通過抗IV型膠原染色）呈碎片化分布，與臨床乳腺癌組織中的血管形態(tài)高度相似。

1模型構(gòu)建與驗(yàn)證1.2功能學(xué)驗(yàn)證除了形態(tài)，還需評(píng)估模型中血管的生理和病理功能：（1）通透性：通過FITC-葡聚糖或FITC-白蛋白的泄漏率評(píng)估血管通透性。腫瘤血管通透性通常高于正常血管，我們?cè)谀Ｐ椭袦y(cè)得FITC-葡聚糖的泄漏率是正常血管模型的3-5倍，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；（2）細(xì)胞活性與標(biāo)志物表達(dá)：通過CCK-8或Live/Dead染色評(píng)估細(xì)胞活性，通過qPCR、Westernblot檢測(cè)血管生成相關(guān)標(biāo)志物（如VEGFR2、CD31、VE-cadherin）的表達(dá)。例如，在腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的模型中，ECs的VEGFR2表達(dá)水平是單純ECs培養(yǎng)的2倍，表明腫瘤微環(huán)境能激活血管生成信號(hào)通路；

1模型構(gòu)建與驗(yàn)證1.2功能學(xué)驗(yàn)證（3）基質(zhì)重塑能力：檢測(cè)細(xì)胞分泌的MMPs（如MMP-2、MMP-9）及其抑制劑（TIMP-1、TIMP-2）的表達(dá)，評(píng)估ECs對(duì)ECM的降解和重塑能力。在抗血管生成藥物處理后，MMPs/TIMPs比值降低，表明藥物抑制了血管生成過程中的基質(zhì)重塑。

1模型構(gòu)建與驗(yàn)證1.3微環(huán)境模擬驗(yàn)證腫瘤血管模型的微環(huán)境不僅包括ECM，還包括細(xì)胞外囊泡、代謝物、免疫細(xì)胞等組分。我們通過以下方式驗(yàn)證微環(huán)境的模擬效果：（1）外泌體分析：從模型培養(yǎng)上清中提取外泌體，通過電鏡觀察形態(tài)，通過Westernblot檢測(cè)CD63、CD81等外泌體標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)外泌體中富含VEGF、miR-210等促血管生成分子，與腫瘤組織來源的外泌體成分相似；（2）代謝物檢測(cè)：通過質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)模型中葡萄糖、乳酸、氨基酸等代謝物的濃度，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞區(qū)域乳酸濃度顯著升高（約15mM），模擬了腫瘤的Warburg效應(yīng)；（3）免疫細(xì)胞浸潤(rùn)：在模型中加入巨噬細(xì)胞（THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞），觀察到巨噬細(xì)胞向血管周圍聚集，并分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，模擬了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)血管生成的促進(jìn)作用。

2抗血管生成藥物篩選的指標(biāo)與方法基于驗(yàn)證后的水凝膠3D腫瘤血管模型，可建立多維度的藥物篩選指標(biāo)體系，全面評(píng)估抗血管生成藥物的療效和機(jī)制。

2抗血管生成藥物篩選的指標(biāo)與方法2.1血管生成抑制效果評(píng)價(jià)（1）形態(tài)學(xué)指標(biāo)：-管腔形成率：?jiǎn)挝幻娣e內(nèi)管腔結(jié)構(gòu)占區(qū)域的比例；-分支長(zhǎng)度與分支數(shù)：通過ImageJ軟件對(duì)CLSM圖像進(jìn)行量化分析；-血管網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度：通過分形維數(shù)（FractalDimension）評(píng)估血管網(wǎng)絡(luò)的分支密集程度。例如，在測(cè)試貝伐珠單抗時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)10μg/mL藥物處理組中，管腔形成率較對(duì)照組降低60%，分支長(zhǎng)度縮短50%，分形維數(shù)從1.3降至0.8，表明藥物顯著抑制了血管生成；

2抗血管生成藥物篩選的指標(biāo)與方法2.1血管生成抑制效果評(píng)價(jià)（2）功能學(xué)指標(biāo)：-血管通透性：FITC-葡聚糖泄漏率降低幅度，通透性降低提示血管趨向“正常化”；-細(xì)胞凋亡：通過TUNEL染色或AnnexinV/PI流式檢測(cè)，評(píng)估ECs的凋亡率。在阿帕替尼處理組中，ECs凋亡率從5%升至25%，且凋亡細(xì)胞主要集中在管腔周圍；（3）分子標(biāo)志物指標(biāo)：-促血管生成因子：ELISA檢測(cè)上清中VEGF、FGF等因子的濃度；-血管生成相關(guān)蛋白：Westernblot檢測(cè)VEGFR2、p-VEGFR2、Akt、p-Akt等信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。例如，安羅替尼處理后，p-VEGFR2和p-Akt表達(dá)顯著下調(diào)，表明藥物抑制了VEGF-Akt信號(hào)通路。

2抗血管生成藥物篩選的指標(biāo)與方法2.2藥物作用機(jī)制研究水凝膠3D模型的優(yōu)勢(shì)在于可實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察藥物作用機(jī)制，揭示傳統(tǒng)2D模型無法發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)：（1）時(shí)效性分析：通過活細(xì)胞成像技術(shù)（如spinningdiskconfocalmicroscopy），連續(xù)72小時(shí)觀察藥物加入后血管形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)某些藥物（如重組人血管內(nèi)皮抑制素）在6小時(shí)內(nèi)即抑制ECs遷移，24小時(shí)內(nèi)抑制管腔形成，而另一些藥物（如索拉非尼）需48小時(shí)才顯著發(fā)揮作用，提示不同藥物的作用靶點(diǎn)和時(shí)效存在差異；（2）細(xì)胞間相互作用干擾：通過熒光標(biāo)記不同細(xì)胞（如ECs標(biāo)記GFP、腫瘤細(xì)胞標(biāo)記RFP），觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞-ECs相互作用的影響。例如，我們發(fā)現(xiàn)舒尼替尼不僅直接抑制ECs，還能減少腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF，間接破壞腫瘤細(xì)胞對(duì)ECs的旁激活作用；

2抗血管生成藥物篩選的指標(biāo)與方法2.2藥物作用機(jī)制研究（3）基質(zhì)-細(xì)胞相互作用調(diào)控：檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞分泌MMPs和TIMPs的影響，以及ECM降解程度。例如，卡博替尼處理后，MMP-9活性降低40%，ECM降解減少，抑制了ECs遷移所需的基質(zhì)重塑過程。

2抗血管生成藥物篩選的指標(biāo)與方法2.3耐藥性機(jī)制探索臨床中抗血管生成藥物耐藥性是治療失敗的主要原因，水凝膠3D模型可用于模擬耐藥微環(huán)境，探索耐藥機(jī)制：（1）缺氧微環(huán)境模擬：通過在模型中預(yù)埋耗氧型微粒（如葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微粒），構(gòu)建局部缺氧區(qū)域，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下ECs對(duì)索拉非尼的IC50從5μM升至20μM，且HIF-1α表達(dá)上調(diào)，提示缺氧通過激活HIF-1α通路誘導(dǎo)耐藥；（2）基質(zhì)硬度影響：通過調(diào)節(jié)水凝膠的彈性模量（模擬不同硬度腫瘤基質(zhì)），發(fā)現(xiàn)高硬度基質(zhì)（20kPa）中ECs對(duì)貝伐珠單抗的敏感性降低，整合素β1和FAK表達(dá)升高，表明基質(zhì)硬度通過整合素-FAK信號(hào)通路介導(dǎo)耐藥；（3）異質(zhì)性細(xì)胞群體分析：在模型中混合敏感ECs和耐藥ECs（預(yù)先通過長(zhǎng)期藥物誘導(dǎo)篩選），發(fā)現(xiàn)耐藥ECs可通過旁分泌因子（如IL-6）保護(hù)敏感ECs，導(dǎo)致藥物整體療效下降，提示耐藥細(xì)胞群體間的相互作用是耐藥的重要機(jī)制。

3案例研究：基于水凝膠3D模型的抗血管生成藥物篩選3.1案例1：新型抗血管生成多肽的篩選我們團(tuán)隊(duì)從天然蛋白中篩選到一種新型抗血管生成多肽（命名為TVP-1），其在2D模型中對(duì)ECs增殖的抑制率僅為30%，但在3D模型中抑制率高達(dá)70%。通過機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，TVP-1不僅阻斷VEGF與VEGFR2的結(jié)合，還抑制ECs的遷移和管腔形成關(guān)鍵蛋白（如RhoA、ROCK）的表達(dá)。進(jìn)一步通過小鼠移植瘤模型驗(yàn)證，TVP-1抑瘤率達(dá)55%，且無明顯毒性，表明3D模型能更準(zhǔn)確預(yù)測(cè)藥物體內(nèi)療效。

3案例研究：基于水凝膠3D模型的抗血管生成藥物篩選3.2案例2：聯(lián)合用藥方案優(yōu)化臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗血管生成藥物與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用可提高療效，但最佳聯(lián)合方案尚不明確。我們利用含巨噬細(xì)胞的腫瘤血管芯片模型，測(cè)試了貝伐珠單抗與PD-1抑制劑的聯(lián)用效果，發(fā)現(xiàn)先給予貝伐珠單抗（3天）使血管正?；?，再給予PD-1抑制劑，可顯著增加T細(xì)胞浸潤(rùn)（較單藥組提高2倍），且抑瘤率達(dá)75%，而同時(shí)給藥或序貫相反的抑瘤率僅為40%和50%，證實(shí)了“血管正?；翱谄凇钡拇嬖冢瑸榕R床用藥提供了優(yōu)化方案。

3案例研究：基于水凝膠3D模型的抗血管生成藥物篩選3.3案例3：患者來源腫瘤異質(zhì)性模型評(píng)估為解決個(gè)體化用藥難題，我們收集了10例肝癌患者的腫瘤組織和外周血，分離原代ECs和腫瘤細(xì)胞，構(gòu)建患者來源的3D腫瘤血管模型。藥物篩選結(jié)果顯示，不同患者的模型對(duì)同一藥物（如侖伐替尼）的響應(yīng)率差異顯著（IC50從2μM到50μM），且與患者臨床療效高度相關(guān)（模型敏感的患者臨床緩解率為80%，耐藥患者為10%），表明該模型可用于指導(dǎo)個(gè)體化抗血管生成治療。05ONE水凝膠3D腫瘤血管模型的挑戰(zhàn)與未來方向

水凝膠3D腫瘤血管模型的挑戰(zhàn)與未來方向盡管水凝膠3D腫瘤血管模型在藥物篩選中展現(xiàn)出巨大潛力，但其從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，同時(shí)也孕育著突破性的發(fā)展方向。

1當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)1.1模型標(biāo)準(zhǔn)化與可重復(fù)性目前水凝膠3D模型的構(gòu)建高度依賴實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)和操作，如水凝膠的交聯(lián)時(shí)間、細(xì)胞密度、打印參數(shù)等，不同實(shí)驗(yàn)室間的模型差異較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以重復(fù)。例如，Matrigel批次差異可導(dǎo)致ECs管腔形成率波動(dòng)20%-30%，嚴(yán)重影響藥物篩選的可靠性。解決這一問題的關(guān)鍵是建立標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP），包括材料質(zhì)量控制、細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范、構(gòu)建參數(shù)優(yōu)化等，并推動(dòng)行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)制定。

1當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)1.2微環(huán)境復(fù)雜性的模擬不足體內(nèi)腫瘤微環(huán)境是一個(gè)動(dòng)態(tài)、多組分的系統(tǒng)，包括ECM、血管、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、代謝物等多種組分，且存在時(shí)空異質(zhì)性。現(xiàn)有模型多模擬ECM和血管-腫瘤細(xì)胞相互作用，對(duì)免疫細(xì)胞、代謝重編程、神經(jīng)血管調(diào)控等組分模擬不足。例如，大多數(shù)模型未考慮腫瘤相關(guān)神經(jīng)對(duì)血管生成的調(diào)控，而臨床研究已發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)（如去甲腎上腺素）可促進(jìn)腫瘤血管生成。未來需通過引入更多細(xì)胞類型（如施旺細(xì)胞、神經(jīng)元）和動(dòng)態(tài)調(diào)控因子（如神經(jīng)遞質(zhì)、代謝物），構(gòu)建更接近體內(nèi)的“多器官芯片”模型。

1當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)1.33D成像與分析技術(shù)的瓶頸水凝膠3D模型的厚度和光學(xué)散射性導(dǎo)致傳統(tǒng)成像技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)高分辨率、深層次的實(shí)時(shí)觀察。例如，共聚焦顯微鏡成像深度通常不超過200μm，而cm級(jí)腫瘤模型的內(nèi)部血管結(jié)構(gòu)無法清晰成像。此外，圖像分析依賴人工處理，耗時(shí)且主觀性強(qiáng)。為此，需發(fā)展新型成像技術(shù)（如光片顯微鏡、多光子顯微鏡）結(jié)合人工智能算法（如深度學(xué)習(xí)圖像分割），實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量的3D圖像分析，提高篩選效率。

1當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)1.4臨床轉(zhuǎn)化的障礙盡管3D模型在藥物早期篩選中表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，但其結(jié)果能否完全替代動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)仍需驗(yàn)證。目前缺乏大規(guī)模、多中心的臨床前研究數(shù)據(jù)，證明3D模型篩選的藥物臨床成功率。此外，3D模型的生產(chǎn)成本較高（如生物打印墨水、微流控芯片），限制了其在工業(yè)界的應(yīng)用。未來需通過與藥企合作開展大規(guī)模驗(yàn)證，降低生產(chǎn)成本，推動(dòng)3D模型從“實(shí)驗(yàn)室工具”向“工業(yè)平臺(tái)”轉(zhuǎn)化。

2未來發(fā)展方向2.1多尺度、多組學(xué)整合模型未來的腫瘤血管模型將向“多尺度”方向發(fā)展，整合分子（基因、蛋白）、細(xì)胞（ECs、腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞）、組織（血管網(wǎng)絡(luò)、腫瘤團(tuán)塊）、器官（腫瘤-血管-免疫-代謝器官芯片）等多個(gè)尺度，并通過多組學(xué)技術(shù)（轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組）揭示藥物作用的系統(tǒng)性機(jī)制。例如