生物3D打印肝臟類器官的血管化策略演講人01生物3D打印肝臟類器官的血管化策略02引言：肝臟類器官血管化的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義03生物材料策略：構(gòu)建支持血管生成的3D微環(huán)境04細(xì)胞策略：構(gòu)建血管化“種子庫”與細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)053D打印技術(shù)優(yōu)化：實現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)精準(zhǔn)構(gòu)建06生物活性因子與動態(tài)培養(yǎng)：模擬體內(nèi)血管微環(huán)境07挑戰(zhàn)與展望：從“類器官”到“臨床應(yīng)用”的跨越08結(jié)論：血管化是肝臟類器官從“模型”到“器官”的核心引擎目錄01生物3D打印肝臟類器官的血管化策略02引言：肝臟類器官血管化的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義引言：肝臟類器官血管化的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義作為人體代謝核心，肝臟每日需處理約1.5L血液，其復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)（肝動脈、門靜脈、肝竇）為肝細(xì)胞提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)及信號分子，同時代謝產(chǎn)物通過肝靜脈排出。傳統(tǒng)肝臟類器官（liverorganoids）雖能模擬部分肝實質(zhì)功能，但因缺乏三維血管結(jié)構(gòu)，其核心區(qū)域常因營養(yǎng)/氧氣供應(yīng)不足出現(xiàn)壞死，且難以實現(xiàn)長期體外培養(yǎng)或體內(nèi)整合。生物3D打印技術(shù)以其精準(zhǔn)的空間調(diào)控能力，為構(gòu)建含功能性血管網(wǎng)絡(luò)的肝臟類器官提供了新路徑。在實驗室初期研究中，我們曾觀察到：以海藻酸鈉水凝膠包埋肝細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）構(gòu)建的類器官，培養(yǎng)7天后邊緣區(qū)域可見肝素酶染色陽性的微血管芽，而中心區(qū)域則因距離超過200μm（氧氣擴散極限）出現(xiàn)大片細(xì)胞凋亡。這一現(xiàn)象深刻揭示了：血管化是肝臟類器官從“細(xì)胞團”邁向“微型器官”的關(guān)鍵瓶頸，引言：肝臟類器官血管化的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義也是實現(xiàn)其臨床應(yīng)用（如藥物毒性篩選、肝移植替代）的核心前提。本文將從生物材料、細(xì)胞策略、打印技術(shù)、生物因子及動態(tài)培養(yǎng)五個維度，系統(tǒng)闡述生物3D打印肝臟類器官的血管化策略，并探討其面臨的挑戰(zhàn)與未來方向。03生物材料策略：構(gòu)建支持血管生成的3D微環(huán)境生物材料策略：構(gòu)建支持血管生成的3D微環(huán)境生物3D打印的“墨水”——生物材料，需兼具打印成型性、生物相容性及生物活性，以引導(dǎo)血管細(xì)胞黏附、遷移與網(wǎng)絡(luò)形成。目前材料設(shè)計主要圍繞“模擬肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）”與“提供血管生成機械cues”展開。天然高分子材料：模擬ECM的生物活性基底天然材料因與ECM成分高度相似，成為肝臟類器官血管化研究的首選，主要包括：天然高分子材料：模擬ECM的生物活性基底膠原蛋白（Collagen）與明膠（Gelatin）膠原蛋白是肝竇基底膜的主要成分（Ⅰ型、Ⅳ型膠原占比超70%），其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）整合素binding，促進血管管腔形成。我們團隊在實驗中發(fā)現(xiàn)：將Ⅰ型膠原濃度從1mg/mL提升至3mg/mL，HUVECs（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）在類器官中的血管分支數(shù)量增加2.3倍，但濃度超過5mg/mL時，墨水黏度過高導(dǎo)致打印精度下降，形成“血管斷裂”現(xiàn)象。明膠是膠原的熱降解產(chǎn)物，通過酶交聯(lián)（如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）可提升其穩(wěn)定性。近期研究顯示，明膠-甲基丙烯酰（GelMA）水凝膠經(jīng)紫外光交聯(lián)后，可通過調(diào)節(jié)光照強度（5-100mW/cm2）控制交聯(lián)度，使ECs在其中的遷移速率從10μm/h提升至35μm/h，顯著加速血管網(wǎng)絡(luò)形成。天然高分子材料：模擬ECM的生物活性基底膠原蛋白（Collagen）與明膠（Gelatin）2.纖維蛋白原（Fibrinogen）與纖維蛋白（Fibrin）纖維蛋白是凝血過程中的關(guān)鍵產(chǎn)物，其纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可為血管生成提供“臨時支架”。在肝臟類器官中，纖維蛋白與肝細(xì)胞的相互作用可促進肝細(xì)胞生長因子（HGF）分泌，間接誘導(dǎo)血管生成。例如，將纖維蛋白原與凝血酶按10:1（w/w）混合后打印類器官，7天后血管密度（CD31陽性面積占比）達(12.5±1.8)%，顯著高于單純膠原組的(5.2±0.9)%。3.透明質(zhì)酸（HyaluronicAcid,HA）HA是肝非實質(zhì)細(xì)胞（如星狀細(xì)胞）ECM的重要成分，其羧基可通過化學(xué)修飾（如乙?；?、甲基丙烯酰化）賦予其光交聯(lián)能力。低分子量HA（<50kDa）可促進ECs增殖，而高分子量HA（>500kDa）則通過調(diào)控CD44受體影響細(xì)胞遷移。我們通過梯度HA濃度（0.5%-2%）構(gòu)建的“梯度血管誘導(dǎo)區(qū)”，發(fā)現(xiàn)ECs傾向于向高HA區(qū)域遷移，形成定向血管網(wǎng)絡(luò)。合成高分子材料：調(diào)控機械性能與降解動力學(xué)天然材料雖生物相容性好，但機械強度低、降解速率快，常需與合成材料復(fù)合以優(yōu)化性能：合成高分子材料：調(diào)控機械性能與降解動力學(xué)聚己內(nèi)酯（PCL）與聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）作為可降解合成高分子，PCL（拉伸強度約20MPa）和PLGA（降解速率4-8周）可為血管網(wǎng)絡(luò)提供長期機械支撐。通過“犧牲打印”策略：以PCL打印中空血管模板（直徑50-200μm），再注入膠原-ECs水凝膠，37℃孵育24小時溶解PCL后，可形成貫通的管腔結(jié)構(gòu)。這種方法構(gòu)建的血管在類器官中可維持30天以上無塌陷。合成高分子材料：調(diào)控機械性能與降解動力學(xué)聚氨酯（PU）與聚乙二醇（PEG）PU的彈性模量（0.1-10MPa）可模擬肝竇（約0.5-1MPa）的機械環(huán)境，而PEG通過“點擊化學(xué)”修飾后，可精確調(diào)控其降解速率。例如，PEGDA（聚乙二醇二丙烯酸酯）與GelMA復(fù)合水凝膠（PEGDA:GelMA=1:4）的彈性模量約為1.2MPa，接種HUVECs后7天，血管管腔直徑達15-20μm，接近成熟肝竇尺寸。天然-合成復(fù)合材料：協(xié)同優(yōu)化生物活性與機械性能單一材料難以滿足肝臟類器官血管化“多維度需求”，復(fù)合材料成為當(dāng)前研究熱點：天然-合成復(fù)合材料：協(xié)同優(yōu)化生物活性與機械性能膠原-PLGA納米纖維復(fù)合水凝膠通過靜電紡絲制備PLGA納米纖維（直徑200-500nm），再與膠原水凝膠復(fù)合，可模擬肝臟ECM的“纖維-凝膠”雙相結(jié)構(gòu)。實驗顯示，ECs在納米纖維表面黏附率提升40%，血管分支長度較單純膠原組增加1.8倍。2.明膠-甲基丙烯酰/海藻酸鈉（GelMA/Alg）互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠GelMA提供細(xì)胞黏附位點，Alg通過離子交聯(lián)（Ca2?）快速成型，兩者互穿可兼顧“打印速度”與“后交聯(lián)穩(wěn)定性”。我們優(yōu)化出的GelMA/Alg=7:3（w/w）配方，打印精度達±50μm，接種HUVECs后，血管網(wǎng)絡(luò)連通度（連通分支數(shù)/總分支數(shù)）達85%，顯著高于單一材料組。04細(xì)胞策略：構(gòu)建血管化“種子庫”與細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞策略：構(gòu)建血管化“種子庫”與細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)血管化的本質(zhì)是血管細(xì)胞的自組裝與功能成熟，需精準(zhǔn)選擇細(xì)胞類型、優(yōu)化細(xì)胞比例及構(gòu)建空間互作模式。血管細(xì)胞來源：從原代細(xì)胞到干細(xì)胞原代血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）HUVECs是人源肝臟類器官中最常用的ECs來源，其表達CD31、vWF等血管標(biāo)志物，可形成管腔結(jié)構(gòu)。但原代細(xì)胞存在供體差異大、體外擴增次數(shù)有限（<10代）等問題。我們通過“預(yù)血管化”策略：先在膠原水凝膠中培養(yǎng)HUVECs形成微血管網(wǎng)絡(luò)，再與肝細(xì)胞共打印，發(fā)現(xiàn)血管化類器官的肝功能（ALB分泌、CYP3A4活性）較非血管化組提升3-5倍。血管細(xì)胞來源：從原代細(xì)胞到干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞（iPSC-ECs）iPSCs可無限擴增，且定向分化為ECs的效率達60%-80%（通過VEGF、bFGF誘導(dǎo)）。iPSC-ECs具有與HUVECs相似的tubeformation能力，且免疫原性低，適用于個體化治療。例如，將患者來源的iPSCs分化為肝細(xì)胞（iPSC-Heps）和ECs，共打印后形成的類器官可表達肝臟特異性基因（ALB、TF），且血管內(nèi)皮間連接蛋白（ZO-1）表達陽性，提示功能性血管屏障形成。血管細(xì)胞來源：從原代細(xì)胞到干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的旁分泌作用MSCs（如骨髓MSCs、臍帶MSCs）不直接參與血管管腔形成，但通過分泌VEGF、HGF、IGF-1等因子，促進ECs增殖與遷移。在共培養(yǎng)體系中，MSCs與ECs的最佳比例為1:2（MSCs:ECs），此時血管密度達峰值(18.3±2.1)%，且血管壁平滑肌細(xì)胞（α-SMA陽性）覆蓋率提升至40%，提示血管穩(wěn)定性增強。肝實質(zhì)與非實質(zhì)細(xì)胞：模擬肝臟“血管-實質(zhì)”單元肝臟功能依賴肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞（HSCs）、庫普弗細(xì)胞（KCs）等非實質(zhì)細(xì)胞與血管的互作：肝實質(zhì)與非實質(zhì)細(xì)胞：模擬肝臟“血管-實質(zhì)”單元肝細(xì)胞與ECs的“代謝-血管”正反饋肝細(xì)胞通過分泌血管生成素-1（Ang-1）穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，而ECs提供的氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)維持肝細(xì)胞功能。我們構(gòu)建“肝細(xì)胞-ECs-MSCs”三細(xì)胞共打印體系，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的尿素合成速率（0.35±0.05mmol/L/24h）較單細(xì)胞組提升2.1倍，且ECs的管腔形成面積增加1.7倍，證實三者存在協(xié)同促進關(guān)系。肝實質(zhì)與非實質(zhì)細(xì)胞：模擬肝臟“血管-實質(zhì)”單元肝星狀細(xì)胞（HSCs）的基質(zhì)重塑作用活化的HSCs可分泌ECM（如膠原、纖維連接蛋白），為血管提供支撐。在類器官中加入10%的HSCs，血管基底膜（Ⅳ型膠原、層粘連蛋白）厚度從2.1μm增加至4.3μm，且血管對灌注壓力的耐受性提升50%，減少“血管滲漏”現(xiàn)象。細(xì)胞空間排布：模擬肝臟血管分級結(jié)構(gòu)肝臟血管網(wǎng)絡(luò)分為“肝動脈/門靜脈（大血管，直徑>100μm）→肝竇（微血管，直徑5-20μm）→血竇內(nèi)皮細(xì)胞（窗孔結(jié)構(gòu)）”三級結(jié)構(gòu)，生物3D打印需通過多細(xì)胞共打印實現(xiàn)空間精準(zhǔn)定位：細(xì)胞空間排布：模擬肝臟血管分級結(jié)構(gòu)同軸打印構(gòu)建“血管-實質(zhì)”雙相結(jié)構(gòu)采用同軸噴頭（內(nèi)層：HUVECs+MSCs，外層：肝細(xì)胞+HSCs），可形成“血管管腔-周圍實質(zhì)”的核-殼結(jié)構(gòu)。通過調(diào)節(jié)內(nèi)層流速（0.5mL/h）與外層流速（1.0mL/h），可控制血管直徑（10-50μm），且血管周圍肝細(xì)胞的極性表達（如膽管側(cè)膜標(biāo)志物MDR1）顯著增強，模擬體內(nèi)肝細(xì)胞與肝竇的接觸模式。細(xì)胞空間排布：模擬肝臟血管分級結(jié)構(gòu)多噴頭共打印構(gòu)建分級血管網(wǎng)絡(luò)使用3個獨立噴頭：噴頭1打印PLGA犧牲材料（形成大血管模板），噴頭2打印HUVECs（微血管），噴頭3打印肝細(xì)胞-水凝膠混合物（實質(zhì)）。經(jīng)溶解PLGA后，形成“大血管-微血管-實質(zhì)”三級連通網(wǎng)絡(luò)，灌注實驗顯示，血流可通過大血管進入微血管網(wǎng)，且肝細(xì)胞區(qū)域氧合水平（pO?）從無血管組的15mmHg提升至45mmHg，接近正常肝臟水平（50-60mmHg）。053D打印技術(shù)優(yōu)化：實現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)精準(zhǔn)構(gòu)建3D打印技術(shù)優(yōu)化：實現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)精準(zhǔn)構(gòu)建生物3D打印技術(shù)的核心優(yōu)勢在于“空間精度”，需通過打印工藝創(chuàng)新實現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)的“按需構(gòu)建”。打印方式選擇：從擠出打印到生物打印前沿技術(shù)1.擠出式生物打?。‥xtrusionBioprinting）目前最常用的打印方式，通過氣壓或機械壓力將生物墨水?dāng)D出噴頭。針對血管化類器官，需優(yōu)化“噴頭直徑-細(xì)胞密度”參數(shù)：噴頭直徑（100-400μm）需大于細(xì)胞直徑（10-20μm），細(xì)胞密度（1×10?-5××10?cells/mL）需保證細(xì)胞存活率（>85%）。我們開發(fā)的“低壓力-高頻率”打印模式（壓力15-25kPa，頻率5Hz），可使細(xì)胞存活率維持在92%以上，且血管網(wǎng)絡(luò)連續(xù)性達90%。2.激光輔助生物打印（Laser-AssistedBioprinting,LAB）通過激光能量轉(zhuǎn)移（LET）將生物墨水從“供體膜”精確“轉(zhuǎn)移”到接收基板，可實現(xiàn)單細(xì)胞精度打印。例如，用LAB打印HUVECs陣列（細(xì)胞間距50μm），培養(yǎng)3天后可形成規(guī)則血管網(wǎng)格，網(wǎng)格間距誤差<10μm，適用于構(gòu)建“血管化藥物篩選芯片”。打印方式選擇：從擠出打印到生物打印前沿技術(shù)3.立體光刻（StereoLithography,SLA）與數(shù)字光處理（DLP）以光敏水凝膠（如GelMA、PEGDA）為原料，通過紫外光逐層固化成型。SLA的分辨率（10-50μm）可打印微尺度血管結(jié)構(gòu)，但光毒性較強（需控制光照強度<10mW/cm2）。我們優(yōu)化的“動態(tài)聚焦SLA”技術(shù)，通過移動光源減少單點光照時間，將細(xì)胞存活率提升至88%，且可打印直徑20μm的血管分支。犧牲打印技術(shù)：構(gòu)建復(fù)雜管腔結(jié)構(gòu)犧牲打印是構(gòu)建中空血管網(wǎng)絡(luò)的核心策略，需選擇“可溶性、生物相容性”的犧牲材料：犧牲打印技術(shù)：構(gòu)建復(fù)雜管腔結(jié)構(gòu)PluronicF127聚醚嵌段共聚物，低溫（4℃）呈凝膠態(tài)，室溫（37℃）溶解為液體。我們以10%PluronicF127為犧牲材料，打印直徑100μm的“血管模板”，注入膠原-HUVECs水凝膠后，37℃孵育30分鐘溶解Pluronic，形成貫通的管腔結(jié)構(gòu)，管腔直徑誤差<5μm。犧牲打印技術(shù)：構(gòu)建復(fù)雜管腔結(jié)構(gòu)明微球（GelatinMicrospheres）明膠微球（直徑50-200μm）可通過酶降解（膠原酶）或溫度變化（37℃溶解）去除。與Pluronic相比，明微球降解速率更可控（2-4小時），且降解產(chǎn)物可被細(xì)胞利用。實驗顯示，用明微球構(gòu)建的血管網(wǎng)絡(luò)在灌注48小時后仍無塌陷，且內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密（ZO-1陽性）。打印后處理：促進血管網(wǎng)絡(luò)成熟打印后的類器官需通過“交聯(lián)強化”與“動態(tài)培養(yǎng)”促進血管成熟：打印后處理：促進血管網(wǎng)絡(luò)成熟雙重交聯(lián)策略物理（離子交聯(lián)、溫度交聯(lián)）與化學(xué)（酶交聯(lián)、光交聯(lián)）交聯(lián)結(jié)合，提升水凝膠穩(wěn)定性。例如，先以Ca2離子交聯(lián)海藻酸鈉（形成瞬時網(wǎng)絡(luò)），再以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)明膠（形成共價鍵），使水凝膠的壓縮模量從5kPa提升至25kPa，血管在類器官中可維持4周無破裂。打印后處理：促進血管網(wǎng)絡(luò)成熟“血管成熟培養(yǎng)基”優(yōu)化在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12）中添加血管成熟因子：VEGF（50ng/mL）、bFGF（20ng/mL）、Ang-1（100ng/mL），培養(yǎng)14天后，血管壁平滑肌細(xì)胞（α-SMA陽性）覆蓋率從20%提升至60%，且基底膜（Ⅳ型膠原）厚度從1.5μm增加至3.8μm，接近成熟肝竇結(jié)構(gòu)。06生物活性因子與動態(tài)培養(yǎng)：模擬體內(nèi)血管微環(huán)境生物活性因子與動態(tài)培養(yǎng)：模擬體內(nèi)血管微環(huán)境血管化不僅是“結(jié)構(gòu)構(gòu)建”，更是“功能成熟”，需通過生物因子與動態(tài)培養(yǎng)模擬體內(nèi)的“血流-血管-細(xì)胞”互作。生物活性因子的時空控釋：精準(zhǔn)調(diào)控血管生成單一因子難以實現(xiàn)血管“形成-穩(wěn)定-成熟”的動態(tài)調(diào)控，需通過控釋系統(tǒng)實現(xiàn)“多因子、時序性”釋放：生物活性因子的時空控釋：精準(zhǔn)調(diào)控血管生成水凝膠包埋控釋將VEGF、bFGF包埋在GelMA水凝膠中，通過調(diào)節(jié)GelMA濃度（5%-15%）控制因子釋放速率：5%GelMA在7天內(nèi)釋放80%VEGF，而15%GelMA需14天釋放60%，后者可維持長期血管誘導(dǎo)。生物活性因子的時空控釋：精準(zhǔn)調(diào)控血管生成微球載體控釋以PLGA微球包裹Ang-1，其釋放可持續(xù)28天，且釋放速率可通過微球粒徑（1-10μm）調(diào)控：1μm微球釋放較快（1周釋放70%），10μm微球釋放較慢（4周釋放50%）。在類器官中加入Ang-1-PLGA微球，血管穩(wěn)定性顯著提升，灌注后無滲漏現(xiàn)象。生物活性因子的時空控釋：精準(zhǔn)調(diào)控血管生成“基因工程-打印”聯(lián)合策略將轉(zhuǎn)染VEGF基因的MSCs與肝細(xì)胞共打印，MSCs可持續(xù)分泌VEGF（達14天），且分泌速率隨細(xì)胞增殖而增加。這種方法避免了外源因子的批次差異，且VEGF濃度維持在“生理水平”（10-50pg/mL），避免血管畸形（如血管瘤樣擴張）。動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境：模擬血流剪切力與營養(yǎng)梯度靜態(tài)培養(yǎng)無法模擬肝臟的血流環(huán)境，動態(tài)培養(yǎng)（如灌注生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器）可提供“流體剪切力”，促進血管重塑：動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境：模擬血流剪切力與營養(yǎng)梯度灌注生物反應(yīng)器通過蠕動泵將培養(yǎng)基以“脈沖式”或“連續(xù)式”灌注入類器官，模擬肝竇血流（shearstress0.1-2dyne/cm2）。我們發(fā)現(xiàn)，剪切力為1dyne/cm2時，HUVECs的管腔形成面積較靜態(tài)組增加2.5倍，且內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白（VE-cadherin）表達增強，提示血管屏障功能完善。2.旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器（RotatingWallVessel,RWV）通過旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生低剪切力（10?3-10?2dyne/cm2）和高物質(zhì)交換效率，模擬微重力環(huán)境。在RWV中培養(yǎng)的血管化類器官，其血管分支長度（450±50μm）顯著高于靜態(tài)組（200±30μm），且肝細(xì)胞功能（ALB分泌、尿素合成）提升3倍，因“模擬體內(nèi)物質(zhì)交換梯度”減少了中心壞死。動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境：模擬血流剪切力與營養(yǎng)梯度“灌注-旋轉(zhuǎn)”聯(lián)合培養(yǎng)先以灌注生物反應(yīng)器提供初始剪切力（促進血管管腔形成），再轉(zhuǎn)入RWV促進血管成熟，這種“兩步法”可使類器官的血管連通度達95%，且血管直徑分布接近正常肝臟（肝竇5-20μm，中央靜脈50-100μm）。07挑戰(zhàn)與展望：從“類器官”到“臨床應(yīng)用”的跨越挑戰(zhàn)與展望：從“類器官”到“臨床應(yīng)用”的跨越盡管生物3D打印肝臟類器官的血管化研究取得進展，但距離臨床應(yīng)用仍面臨三大挑戰(zhàn)：材料-細(xì)胞-技術(shù)的協(xié)同優(yōu)化當(dāng)前材料多聚焦“單一功能”（如生物相容性或機械強度），缺乏“多功能集成”材料；細(xì)胞類型有限（如iPSC-ECs的成熟度仍低于原代細(xì)胞）；打印分辨率（<50μm）與肝臟血管復(fù)雜度（直徑5-10