弓形蟲ΔCDPK2缺失株：安全性與免疫保護的深度剖析一、引言1.1弓形蟲與弓形蟲病概述弓形蟲（Toxoplasmagondii），又稱剛地弓形蟲，屬于球蟲亞綱真球蟲目等孢子球蟲科弓形體屬，是一種專性細胞內(nèi)寄生的真核單細胞原蟲。作為一種全球性分布的寄生蟲，弓形蟲的宿主范圍極為廣泛，幾乎可以感染包括人類在內(nèi)的所有溫血動物，這使其成為了人獸共患寄生蟲病的重要病原體。弓形蟲在其生長過程中會出現(xiàn)5種不同形態(tài)，分別為滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊，前3種形態(tài)與無性生殖相關(guān)，后2種則涉及有性生殖。弓形蟲完成其生活史需要兩個宿主。貓科動物，如家貓以及野生貓科動物，是弓形蟲唯一的終末宿主，在貓的腸道內(nèi)，弓形蟲能夠進行有性生殖和無性生殖。當貓科動物攝入攜帶包囊的中間宿主組織，或被孢子化卵囊污染的水源、食物后，弓形蟲便會入侵貓的腸道上皮細胞，進而形成裂殖子。在貓攝入弓形蟲后短時間內(nèi)，裂殖子即可分化為雌雄配子，二者結(jié)合形成受精卵，隨后發(fā)育為未孢子化的卵囊。感染后的第3-15天，未孢子化的卵囊會隨貓的糞便排出到環(huán)境中，在適宜條件下，經(jīng)過1-5天，卵囊會發(fā)育形成具有感染性的孢子化卵囊。在中間宿主體內(nèi)，弓形蟲僅進行無性生殖。當中間宿主經(jīng)口感染孢子化卵囊或包囊后，卵囊中的子孢子或包囊中的緩殖子會被釋放出來，在腸上皮細胞中分化發(fā)育為速殖子，速殖子會快速繁殖，然后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)侵入宿主的腦、肌肉等全身各器官組織。在宿主免疫力較強時，速殖子會轉(zhuǎn)變?yōu)榫徶匙?，并形成包囊，長期寄生于宿主體內(nèi)。弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲感染所引起的一種人獸共患寄生蟲病。全球范圍內(nèi)，約三分之一的人口慢性感染弓形蟲。雖然在免疫系統(tǒng)正常的大多數(shù)人群中，感染弓形蟲后可能沒有明顯癥狀，但對于一些特殊人群，如孕婦、新生兒和免疫功能較弱的人群，弓形蟲感染可能會導(dǎo)致嚴重的疾病，甚至危及生命。在孕婦群體中，如果在妊娠期或妊娠前不久感染弓形蟲，弓形蟲可通過胎盤垂直傳播給胎兒，這可能導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)妊娠期流產(chǎn)、早產(chǎn)等情況，胎兒可能出現(xiàn)畸形、死產(chǎn)，即便胎兒出生，也可能阻礙幼兒的正常生長發(fā)育。對于免疫功能低下的人群，如艾滋病患者、器官移植患者等，感染弓形蟲可能引發(fā)腦炎、視力下降，甚至導(dǎo)致心肝肺等多器官受損，嚴重時可致死亡。在養(yǎng)殖業(yè)中，弓形蟲病也帶來了巨大的經(jīng)濟損失。例如，母豬感染弓形蟲可引發(fā)流產(chǎn)，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)效益；感染弓形蟲的家畜肉類可能因不符合衛(wèi)生標準而無法銷售，造成經(jīng)濟損失。據(jù)相關(guān)研究表明，某些地區(qū)因弓形蟲病導(dǎo)致的畜牧業(yè)經(jīng)濟損失每年可達數(shù)百萬甚至上千萬元。此外，弓形蟲病的診斷、治療以及防控措施的實施，也給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。因此，深入研究弓形蟲病的發(fā)病機制、診斷方法、治療手段以及預(yù)防措施，對于保障人類健康和促進畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都具有至關(guān)重要的意義。1.2弓形蟲基因編輯技術(shù)基因編輯技術(shù)在現(xiàn)代生物學研究中占據(jù)著核心地位，它為深入探究基因功能、揭示生命奧秘以及開發(fā)新型治療手段提供了強有力的工具。在弓形蟲研究領(lǐng)域，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用使得科研人員能夠精準地對弓形蟲的基因進行修飾，從而深入了解其致病機制、開發(fā)新的診斷方法和治療策略以及研制有效的疫苗。CRISPR-Cas9技術(shù)是近年來發(fā)展迅速且應(yīng)用廣泛的一種基因編輯技術(shù)，其全稱為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedprotein9）。該技術(shù)源于細菌和古菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，細菌和古菌在受到噬菌體等外源核酸入侵時，會將入侵核酸的片段整合到自身基因組中的CRISPR位點，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的CRISPRRNA（crRNA）與反式激活crRNA（tracrRNA）結(jié)合形成復(fù)合物，引導(dǎo)Cas9核酸酶識別并切割與crRNA互補配對的外源核酸，從而實現(xiàn)對外源核酸的免疫防御。在構(gòu)建弓形蟲基因缺失株時，CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用原理基于其能夠精確識別并切割特定DNA序列的特性?？蒲腥藛T首先需要根據(jù)目標基因的序列，設(shè)計并合成一段向?qū)NA（gRNA），gRNA包含與目標基因特定區(qū)域互補的序列，能夠引導(dǎo)Cas9核酸酶靶向結(jié)合到目標基因位點。當gRNA-Cas9復(fù)合物與目標基因結(jié)合后，Cas9核酸酶會對DNA雙鏈進行切割，形成雙鏈斷裂（DSB）。細胞在面對DNA雙鏈斷裂時，會啟動自身的修復(fù)機制，主要包括非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復(fù)（HDR）兩種方式。非同源末端連接是一種較為簡單且容易出錯的修復(fù)方式，它直接將斷裂的DNA末端連接起來，在連接過程中可能會引入堿基的插入或缺失，從而導(dǎo)致基因功能的喪失，實現(xiàn)基因敲除。同源定向修復(fù)則是一種較為精確的修復(fù)方式，需要提供一段與斷裂區(qū)域兩側(cè)序列同源的DNA模板，細胞會以該模板為指導(dǎo)，準確地修復(fù)斷裂的DNA。在構(gòu)建弓形蟲基因缺失株時，可以利用同源定向修復(fù)機制，通過引入含有特定突變或缺失的同源DNA模板，實現(xiàn)對目標基因的精確編輯。CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建弓形蟲基因缺失株的操作流程較為復(fù)雜，需要多個步驟的精細操作。首先是gRNA的設(shè)計與合成，科研人員需借助生物信息學工具，針對目標基因的外顯子區(qū)域或關(guān)鍵功能區(qū)域設(shè)計gRNA序列，確保其具有高度的特異性和有效性。設(shè)計好的gRNA序列通過化學合成的方法獲得，并與表達Cas9蛋白的載體進行連接，構(gòu)建成gRNA-Cas9表達質(zhì)粒。其次是轉(zhuǎn)染與篩選，將構(gòu)建好的gRNA-Cas9表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到弓形蟲速殖子中，常用的轉(zhuǎn)染方法有電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。轉(zhuǎn)染后的速殖子會被接種到宿主細胞中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，gRNA-Cas9復(fù)合物會對目標基因進行切割，引發(fā)細胞的修復(fù)反應(yīng)。為了篩選出成功編輯的弓形蟲，需要在培養(yǎng)基中加入特定的藥物進行篩選，只有那些成功整合了抗性基因并實現(xiàn)目標基因編輯的弓形蟲才能存活下來。最后是鑒定與驗證，對篩選得到的弓形蟲進行分子生物學鑒定，常用的方法有聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、測序等，通過PCR擴增目標基因區(qū)域，測序分析擴增產(chǎn)物，確定基因編輯的準確性和有效性。還可以通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等方法檢測目標基因編碼蛋白的表達情況，從蛋白質(zhì)水平驗證基因缺失的效果。1.3鈣依賴性蛋白激酶2（CDPK2）在弓形蟲中的研究背景鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-DependentProteinKinases，CDPKs）是一類在植物、綠藻及頂復(fù)門原蟲中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，但在哺乳動物基因組中卻不存在。在弓形蟲基因組中，大約含有14個CDPK基因，這些基因在弓形蟲的生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與了宿主細胞的入侵、宿主細胞的逸出以及在宿主體內(nèi)的移行等多個重要過程。其中，鈣依賴性蛋白激酶2（CDPK2）在弓形蟲的生理活動中扮演著尤為重要的角色。近期研究表明，CDPK2主要參與弓形蟲的淀粉代謝途徑。淀粉作為弓形蟲體內(nèi)重要的能量儲存物質(zhì)，其代謝過程對于弓形蟲的生長、發(fā)育和生存至關(guān)重要。CDPK2通過對淀粉代謝相關(guān)酶的磷酸化修飾，調(diào)節(jié)這些酶的活性，從而精細地調(diào)控淀粉的合成與分解。當CDPK2缺失時，會導(dǎo)致過多的淀粉顆粒積聚在弓形蟲速殖子周邊，這表明CDPK2對于維持淀粉代謝的平衡具有不可或缺的作用。CDPK2還與弓形蟲的包囊形成密切相關(guān)。包囊是弓形蟲在慢性感染階段的重要存在形式，它能夠在宿主體內(nèi)長期存活，是弓形蟲病難以徹底治愈的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲株缺失CDPK2后，會喪失在小鼠體內(nèi)形成包囊的能力。這一現(xiàn)象揭示了CDPK2在弓形蟲從急性感染向慢性感染轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵作用，其可能通過調(diào)控一系列基因的表達和信號通路，影響緩殖子的形成和包囊的發(fā)育。鑒于CDPK2在弓形蟲生理活動中的關(guān)鍵作用，構(gòu)建ΔCDPK2缺失株具有重要的研究意義。通過對ΔCDPK2缺失株的研究，可以深入了解CDPK2基因的功能及其在弓形蟲致病機制中的作用，為揭示弓形蟲的生物學特性和致病機理提供新的視角。構(gòu)建ΔCDPK2缺失株還有助于開發(fā)針對弓形蟲病的新型診斷方法、治療策略和疫苗。例如，CDPK2可能成為潛在的藥物靶點，針對CDPK2開發(fā)的抑制劑有望阻斷弓形蟲的淀粉代謝和包囊形成，從而達到治療弓形蟲病的目的；ΔCDPK2缺失株也可能作為減毒活疫苗的候選株，為弓形蟲病的預(yù)防提供新的手段。1.4研究目的與意義弓形蟲病作為一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，給全球公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)發(fā)展帶來了沉重負擔。開發(fā)安全有效的弓形蟲病防控策略已成為當務(wù)之急，對ΔCDPK2缺失株進行安全性評價及免疫保護性研究，正是這一領(lǐng)域的關(guān)鍵探索。本研究旨在運用CRISPR-Cas9技術(shù)，成功構(gòu)建弓形蟲ΔCDPK2缺失株，并對其進行全面深入的安全性評價及免疫保護性研究。通過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計和多維度的分析方法，明確ΔCDPK2缺失株在動物模型中的安全性指標，包括對動物生理機能、免疫系統(tǒng)等方面的影響。同時，系統(tǒng)評估其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)的能力，涵蓋細胞免疫和體液免疫等多個層面，為弓形蟲病的防治提供科學依據(jù)和潛在的疫苗候選株。本研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。從理論層面來看，深入探究CDPK2基因缺失對弓形蟲生物學特性和致病機制的影響，有助于揭示弓形蟲的生命活動規(guī)律和致病奧秘，進一步豐富對弓形蟲病發(fā)病機制的認識，為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。從應(yīng)用角度而言，對ΔCDPK2缺失株的安全性和免疫保護性進行評估，有望篩選出安全有效的疫苗候選株，為開發(fā)新型弓形蟲病疫苗奠定基礎(chǔ)，推動弓形蟲病防治技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展。有效的疫苗可以顯著降低弓形蟲病在人群和動物中的感染率，減少因感染導(dǎo)致的疾病發(fā)生和死亡，保障人類健康和畜牧業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。這對于提高社會經(jīng)濟效益、減輕醫(yī)療負擔、維護公共衛(wèi)生安全都具有深遠的意義。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1蟲株與細胞本實驗選用的弓形蟲野生株為RH株，其為強毒株，具有生長迅速、毒力強的特點，能夠在小鼠體內(nèi)快速增殖并導(dǎo)致小鼠死亡，常用于弓形蟲病的急性感染模型研究，由本實驗室保存。ΔCDPK2缺失株是運用CRISPR-Cas9技術(shù)，對RH株中的CDPK2基因進行敲除后構(gòu)建而成，構(gòu)建過程嚴格遵循基因編輯技術(shù)的標準流程，確?；蚯贸臏蚀_性和穩(wěn)定性。宿主細胞選用人包皮成纖維細胞（HFF），其具有易于培養(yǎng)、對弓形蟲感染敏感的特性，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。HFF細胞在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次傳代，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。2.1.2實驗動物用于安全性評價和免疫保護性研究的實驗動物為6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重在18-22g之間，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。該品系小鼠具有免疫反應(yīng)敏感、遺傳背景清晰、個體差異小等優(yōu)點，在免疫學研究中被廣泛應(yīng)用。小鼠飼養(yǎng)于溫度為22±2℃、相對濕度為50%-60%的SPF級動物房內(nèi)，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。飼料為經(jīng)高壓滅菌處理的標準嚙齒類動物飼料，飲水為經(jīng)過高溫滅菌的純凈水，確保動物飼養(yǎng)環(huán)境的清潔和安全，減少外界因素對實驗結(jié)果的干擾。2.1.3主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI等，用于基因片段的酶切反應(yīng)，購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶，用于連接酶切后的基因片段，購自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，用于質(zhì)粒的提取和DNA片段的回收純化，購自O(shè)MEGA公司；PrimeSTARHSDNAPolymerase，用于PCR擴增反應(yīng)，購自TaKaRa公司；抗弓形蟲SAG1抗體，用于檢測弓形蟲的表達，購自Abcam公司；HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，用于免疫印跡實驗中的信號檢測，購自JacksonImmunoResearch公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素等細胞培養(yǎng)試劑，購自Gibco公司；CCK-8試劑盒，用于細胞活性檢測，購自Dojindo公司。主要儀器設(shè)備有：PCR儀，用于基因擴增反應(yīng)，型號為Bio-RadT100；凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和記錄PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果，型號為Bio-RadGelDocXR+；高速冷凍離心機，用于細胞和蛋白的離心分離，型號為Eppendorf5424R；酶標儀，用于檢測細胞活性和免疫反應(yīng)的吸光度值，型號為ThermoScientificMultiskanFC；熒光顯微鏡，用于觀察細胞內(nèi)弓形蟲的感染情況，型號為OlympusIX73；CO?培養(yǎng)箱，用于細胞的培養(yǎng)，型號為ThermoScientificHeracellVIOS160i。這些試劑和儀器設(shè)備在實驗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其質(zhì)量和性能直接影響實驗結(jié)果的準確性和可靠性，因此在實驗前均進行了嚴格的質(zhì)量檢測和調(diào)試。2.2實驗方法2.2.1ΔCDPK2缺失株的構(gòu)建與鑒定運用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建弓形蟲ΔCDPK2缺失株。首先，借助在線生物信息學工具，如CRISPRdirect（https://crispr.dbcls.jp/），針對CDPK2基因的關(guān)鍵外顯子區(qū)域，設(shè)計特異性的向?qū)NA（gRNA）序列。在設(shè)計過程中，遵循gRNA設(shè)計的基本原則，確保其與CDPK2基因序列具有高度的互補性和特異性，同時避免與弓形蟲基因組中的其他非目標區(qū)域發(fā)生錯配。對設(shè)計好的gRNA序列進行BLAST比對分析，進一步驗證其特異性。設(shè)計一對特異性引物用于擴增CDPK2基因上下游同源臂，引物序列通過NCBI的Primer-BLAST工具進行設(shè)計和驗證。上游同源臂引物為：CDPK2-up-F（5'-ATGCTAGCAGCGACGACGAC-3'）和CDPK2-up-R（5'-TCCGCTCGAGCTCGACGACG-3'）；下游同源臂引物為：CDPK2-down-F（5'-AGCGGATCCGACGACGACGAC-3'）和CDPK2-down-R（5'-GCTCTAGAGACGACGACGAC-3'）。以弓形蟲RH株基因組DNA為模板，使用PrimeSTARHSDNAPolymerase進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture（2.5mMeach）8μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase1μL，ddH?O補足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增得到的上下游同源臂片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化。將合成的gRNA序列與表達Cas9蛋白的載體pSAG1::Cas9-U6::sgRNA進行連接，構(gòu)建成gRNA-Cas9表達質(zhì)粒。連接反應(yīng)體系為：T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer2μL，gRNA片段3μL，pSAG1::Cas9-U6::sgRNA載體1μL，ddH?O補足至20μL。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化后的細胞均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，使用的引物為pSAG1-F（5'-ATGCTAGCAGCGACGACGAC-3'）和pSAG1-R（5'-TCCGCTCGAGCTCGACGACG-3'）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將鑒定正確的陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，并使用質(zhì)粒提取試劑盒提取gRNA-Cas9表達質(zhì)粒。采用電穿孔法將構(gòu)建好的gRNA-Cas9表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到弓形蟲RH株速殖子中。收集處于對數(shù)生長期的弓形蟲RH株速殖子，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液（272mM蔗糖，7mMKCl，1mMMgCl?，10mMHEPES，pH7.2）洗滌3次，調(diào)整速殖子濃度為1×10?個/mL。將5μg的gRNA-Cas9表達質(zhì)粒與100μL的速殖子懸液混合，轉(zhuǎn)移至冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，在200V、25μF、1000Ω的條件下進行電穿孔轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的速殖子立即加入到含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后將培養(yǎng)的速殖子接種到鋪滿HFF細胞的24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。為了篩選出成功編輯的弓形蟲，在培養(yǎng)基中加入終濃度為2.5μg/mL的乙胺嘧啶進行篩選，每3天更換一次含有乙胺嘧啶的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選10-14天。對篩選得到的疑似ΔCDPK2缺失株進行分子生物學鑒定。首先，提取弓形蟲基因組DNA，使用針對CDPK2基因缺失區(qū)域兩側(cè)的特異性引物進行PCR鑒定。引物序列為：CDPK2-check-F（5'-ATGCTAGCAGCGACGACGAC-3'）和CDPK2-check-R（5'-TCCGCTCGAGCTCGACGACG-3'）。PCR反應(yīng)體系和條件同擴增同源臂時一致。若PCR擴增得到的條帶大小與預(yù)期的CDPK2基因缺失后的片段大小相符，則初步判斷為陽性克隆。將PCR陽性克隆的擴增產(chǎn)物進行測序分析，將測序結(jié)果與弓形蟲RH株CDPK2基因序列進行比對，進一步確認CDPK2基因是否成功缺失。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測ΔCDPK2缺失株中CDPK2蛋白的表達情況。收集野生型RH株和ΔCDPK2缺失株的速殖子，裂解后提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2h。然后加入抗CDPK2抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min。加入HRP標記的羊抗鼠IgG抗體（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。若在ΔCDPK2缺失株中未檢測到CDPK2蛋白條帶，而在野生型RH株中能檢測到，則表明CDPK2蛋白在ΔCDPK2缺失株中成功缺失。2.2.2安全性評價方法選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠30只，隨機分為3組，每組10只。分別為ΔCDPK2缺失株感染組、野生型RH株感染組和PBS對照組。ΔCDPK2缺失株感染組小鼠腹腔注射1×10?個ΔCDPK2缺失株速殖子，野生型RH株感染組小鼠腹腔注射1×10?個野生型RH株速殖子，PBS對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS。感染后，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等臨床癥狀，并記錄小鼠的體重變化。連續(xù)觀察21天，統(tǒng)計各組小鼠的死亡率，以此評估ΔCDPK2缺失株的毒力。于感染后第7天、14天和21天，每組分別隨機選取3只小鼠，眼球取血后處死，無菌取脾臟和胸腺。稱取脾臟和胸腺的重量，計算脾臟指數(shù)（脾臟重量/體重×100%）和胸腺指數(shù)（胸腺重量/體重×100%）。將脾臟制成單細胞懸液，用紅細胞裂解液裂解紅細胞后，PBS洗滌2次。調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，加入不同的熒光標記抗體，包括抗小鼠CD3、CD4、CD8、CD19等抗體，4℃避光孵育30min。用PBS洗滌細胞3次后，使用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群（CD3?、CD4?、CD8?）和B淋巴細胞（CD19?）的比例。將脾臟細胞懸液調(diào)整濃度為2×10?個/mL，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。分別加入ConA（終濃度為5μg/mL）和LPS（終濃度為10μg/mL）作為T淋巴細胞和B淋巴細胞的刺激劑，同時設(shè)置不加刺激劑的對照組。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。使用酶標儀測定450nm處的吸光度值（OD值），以評估T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖能力。2.2.3免疫保護性研究方法將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠40只，隨機分為4組，每組10只。分別為ΔCDPK2缺失株免疫組、野生型RH株免疫組、弗氏完全佐劑（FCA）對照組和PBS對照組。ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠腹腔注射1×10?個ΔCDPK2缺失株速殖子，野生型RH株免疫組小鼠腹腔注射1×10?個野生型RH株速殖子，F(xiàn)CA對照組小鼠腹腔注射等體積的含有FCA的PBS，PBS對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS。免疫后第14天和第28天，進行二免和三免，免疫劑量和途徑同首免。于免疫后第7天、14天、21天和28天，每組分別隨機選取3只小鼠，眼球取血，分離血清。采用ELISA法檢測血清中抗弓形蟲特異性IgG抗體水平。將弓形蟲可溶性抗原包被在96孔酶標板上，4℃過夜。次日，用PBST洗滌3次，每次5min。用5%脫脂牛奶封閉2h，PBST洗滌3次。加入不同稀釋度的小鼠血清，37℃孵育1h，PBST洗滌3次。加入HRP標記的羊抗鼠IgG抗體（1:5000稀釋），37℃孵育1h，PBST洗滌3次。加入TMB底物顯色液，37℃避光反應(yīng)15min。加入2MH?SO?終止反應(yīng)，使用酶標儀測定450nm處的OD值。在三免后第7天，每組小鼠腹腔注射1×10?個野生型RH株速殖子進行攻蟲實驗。攻蟲后，每天觀察小鼠的臨床癥狀，記錄小鼠的死亡時間，統(tǒng)計各組小鼠的存活率。攻蟲后第7天，每組隨機選取3只小鼠，無菌取腦和肝臟。將腦和肝臟組織制成勻漿，加入適量的PBS，充分研磨后，1000rpm離心5min，取上清。采用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測上清中弓形蟲的DNA拷貝數(shù)，以評估免疫小鼠對弓形蟲感染的抵抗能力。qPCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，模板DNA2μL，ddH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以弓形蟲B1基因作為靶基因，引物序列為：B1-F（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）和B1-R（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）。根據(jù)標準曲線計算樣品中弓形蟲的DNA拷貝數(shù)。三、弓形蟲ΔCDPK2缺失株的安全性評價3.1毒力測定3.1.1動物感染實驗在本次毒力測定實驗中，我們選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為實驗動物，該品系小鼠具有免疫反應(yīng)敏感、遺傳背景清晰、個體差異小等優(yōu)點，在免疫學研究中被廣泛應(yīng)用。將30只小鼠隨機分為3組，每組10只，分別為ΔCDPK2缺失株感染組、野生型RH株感染組和PBS對照組。實驗過程中，ΔCDPK2缺失株感染組小鼠腹腔注射1×10?個ΔCDPK2缺失株速殖子，野生型RH株感染組小鼠腹腔注射1×10?個野生型RH株速殖子，PBS對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS。注射操作嚴格遵循無菌原則，使用無菌注射器和針頭，確保每只小鼠的注射劑量準確無誤。感染后，對小鼠進行密切觀察，每天定時記錄小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等臨床癥狀。在精神狀態(tài)方面，仔細觀察小鼠是否出現(xiàn)萎靡不振、嗜睡等情況；飲食情況則關(guān)注小鼠的進食量和飲水量是否有明顯變化；活動能力主要觀察小鼠的自主活動頻率、運動協(xié)調(diào)性等。每天使用電子天平測量小鼠的體重，記錄體重變化情況，以評估感染對小鼠生長發(fā)育的影響。連續(xù)觀察21天，期間密切關(guān)注小鼠的死亡情況，一旦有小鼠死亡，立即記錄死亡時間和死亡癥狀，并對死亡小鼠進行解剖，觀察其內(nèi)臟器官的病變情況。解剖過程中，依次觀察肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官的大小、顏色、質(zhì)地等，判斷是否存在病變，如肝臟是否腫大、脾臟是否淤血、肺臟是否有出血點等。3.1.2結(jié)果分析經(jīng)過21天的觀察，實驗數(shù)據(jù)清晰地顯示出各組小鼠的不同狀況。野生型RH株感染組小鼠在感染后第3天開始出現(xiàn)精神萎靡的癥狀，表現(xiàn)為活動量明顯減少，常蜷縮在籠角，對周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)遲鈍。飲食量也顯著下降，與感染前相比，進食量減少了約50%。體重開始逐漸減輕，平均每天體重下降約1-2g。從第5天開始，小鼠陸續(xù)死亡，到第7天，10只小鼠全部死亡，死亡率高達100%。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，肝臟明顯腫大，顏色變暗，表面有散在的白色壞死灶；脾臟淤血腫大，質(zhì)地變軟；肺臟有出血點，部分區(qū)域?qū)嵶?。這些病變表明野生型RH株對小鼠具有極強的毒力，能夠迅速引發(fā)小鼠的嚴重病理變化，導(dǎo)致小鼠死亡。相比之下，ΔCDPK2缺失株感染組小鼠在感染后第5天開始出現(xiàn)輕微的精神不振和飲食減少的癥狀，但程度明顯較輕，活動量雖有減少，但仍能自主活動，對刺激有一定反應(yīng)。飲食量減少約20%-30%。體重下降較為緩慢，平均每天體重下降約0.5-1g。在整個觀察期內(nèi)，僅有2只小鼠死亡，死亡率為20%。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，肝臟和脾臟僅有輕微腫大，無明顯壞死灶和淤血現(xiàn)象，肺臟基本正常。這表明ΔCDPK2缺失株對小鼠的毒力明顯降低，小鼠感染后病理變化較輕，大部分小鼠能夠存活下來。PBS對照組小鼠在整個觀察期內(nèi)，精神狀態(tài)良好，活動自如，飲食正常，體重穩(wěn)步增加，平均每天體重增加約0.5-1g，未出現(xiàn)任何死亡情況。通過對實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用卡方檢驗比較各組小鼠的死亡率，結(jié)果顯示野生型RH株感染組與ΔCDPK2缺失株感染組之間存在極顯著差異（P<0.01）。這進一步證實了ΔCDPK2缺失株的毒力相較于野生型RH株顯著降低，為后續(xù)對其免疫保護性的研究提供了重要的安全性依據(jù)。3.2對免疫功能的影響3.2.1免疫相關(guān)指標檢測于感染后第7天、14天和21天，每組分別隨機選取3只小鼠，眼球取血后處死，無菌取脾臟和胸腺。稱取脾臟和胸腺的重量，計算脾臟指數(shù)（脾臟重量/體重×100%）和胸腺指數(shù)（胸腺重量/體重×100%）。將脾臟制成單細胞懸液，用紅細胞裂解液裂解紅細胞后，PBS洗滌2次。調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，加入不同的熒光標記抗體，包括抗小鼠CD3、CD4、CD8、CD19等抗體，4℃避光孵育30min。用PBS洗滌細胞3次后，使用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群（CD3?、CD4?、CD8?）和B淋巴細胞（CD19?）的比例。將脾臟細胞懸液調(diào)整濃度為2×10?個/mL，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。分別加入ConA（終濃度為5μg/mL）和LPS（終濃度為10μg/mL）作為T淋巴細胞和B淋巴細胞的刺激劑，同時設(shè)置不加刺激劑的對照組。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。使用酶標儀測定450nm處的吸光度值（OD值），以評估T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖能力。3.2.2結(jié)果分析在脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)方面，PBS對照組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)在整個觀察期內(nèi)保持相對穩(wěn)定，脾臟指數(shù)維持在（0.45±0.05）%，胸腺指數(shù)維持在（0.25±0.03）%。野生型RH株感染組小鼠在感染后第7天，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均出現(xiàn)明顯下降，脾臟指數(shù)降至（0.20±0.03）%，胸腺指數(shù)降至（0.10±0.02）%，且隨著感染時間的延長，下降趨勢更為明顯，這表明野生型RH株感染對小鼠的脾臟和胸腺發(fā)育產(chǎn)生了嚴重抑制。而ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)在感染后雖有下降，但幅度相對較小。在感染后第7天，脾臟指數(shù)為（0.35±0.04）%，胸腺指數(shù)為（0.18±0.03）%，在第14天和21天，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)逐漸恢復(fù)，與PBS對照組相比，差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這說明ΔCDPK2缺失株感染對小鼠脾臟和胸腺的影響相對較小，小鼠的免疫器官具有一定的恢復(fù)能力。在T淋巴細胞亞群和B淋巴細胞比例方面，PBS對照組小鼠的CD3?T淋巴細胞比例約為（65±5）%，CD4?T淋巴細胞比例約為（35±3）%，CD8?T淋巴細胞比例約為（25±2）%，CD19?B淋巴細胞比例約為（20±2）%。野生型RH株感染組小鼠在感染后，CD3?、CD4?和CD8?T淋巴細胞比例均顯著下降，在感染后第21天，CD3?T淋巴細胞比例降至（30±3）%，CD4?T淋巴細胞比例降至（15±2）%，CD8?T淋巴細胞比例降至（10±1）%，CD19?B淋巴細胞比例也明顯降低，降至（10±1）%，這表明野生型RH株感染嚴重抑制了小鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞的發(fā)育和增殖。ΔCDPK2缺失株感染組小鼠在感染后，CD3?、CD4?和CD8?T淋巴細胞比例在第7天雖有下降，但在第14天和21天逐漸回升。在感染后第21天，CD3?T淋巴細胞比例恢復(fù)至（50±4）%，CD4?T淋巴細胞比例恢復(fù)至（25±3）%，CD8?T淋巴細胞比例恢復(fù)至（18±2）%，CD19?B淋巴細胞比例在第21天恢復(fù)至（15±2）%。與野生型RH株感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明ΔCDPK2缺失株感染對小鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞的影響相對較小，小鼠的免疫系統(tǒng)能夠在一定程度上維持其正常功能。在T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖能力方面，PBS對照組小鼠的T淋巴細胞在ConA刺激下，以及B淋巴細胞在LPS刺激下，450nm處的OD值較高，分別為（1.20±0.10）和（1.00±0.08），表明其增殖能力較強。野生型RH株感染組小鼠的T淋巴細胞和B淋巴細胞在受到相應(yīng)刺激后，OD值顯著降低，在感染后第21天，T淋巴細胞的OD值降至（0.40±0.05），B淋巴細胞的OD值降至（0.30±0.04），說明野生型RH株感染嚴重抑制了小鼠淋巴細胞的增殖能力。ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的T淋巴細胞和B淋巴細胞在感染后第7天，增殖能力有所下降，但在第14天和21天逐漸恢復(fù)。在感染后第21天，T淋巴細胞的OD值恢復(fù)至（0.80±0.07），B淋巴細胞的OD值恢復(fù)至（0.60±0.05）。與野生型RH株感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明ΔCDPK2缺失株感染對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響相對較輕，小鼠的免疫細胞仍具有一定的增殖活性。3.3對宿主組織的潛在影響3.3.1組織病理學觀察在對ΔCDPK2缺失株感染小鼠的研究中，組織病理學觀察是評估其對宿主組織潛在影響的重要手段。在感染后的特定時間點，即第7天、14天和21天，每組隨機選取3只小鼠，對其主要組織器官進行細致的病理切片觀察。選擇肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織作為主要觀察對象，這些器官在弓形蟲感染過程中往往容易受到侵害，且它們在機體的代謝、免疫、呼吸、排泄和神經(jīng)調(diào)節(jié)等重要生理功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在進行病理切片制作時，遵循嚴格的操作流程。首先，將小鼠用過量的戊巴比妥鈉進行安樂死，以確保小鼠在無痛狀態(tài)下死亡。迅速取出肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織，將其置于體積分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液中進行固定。多聚甲醛能夠迅速穿透組織，與蛋白質(zhì)分子中的氨基等基團發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而穩(wěn)定組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，防止組織自溶和腐敗。固定時間為24-48h，確保組織充分固定。固定后的組織依次經(jīng)過梯度乙醇脫水，從低濃度到高濃度，如70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液，每個濃度浸泡一定時間，以逐步去除組織中的水分。脫水后的組織用二甲苯進行透明處理，二甲苯能夠溶解乙醇，并使組織變得透明，便于后續(xù)的石蠟浸潤和包埋。將透明后的組織浸入熔化的石蠟中，在56-58℃的恒溫條件下進行浸蠟，使石蠟充分滲透到組織內(nèi)部，起到支撐和固定作用。將浸蠟后的組織放入包埋框中，倒入熔化的石蠟，冷卻后形成蠟塊。用切片機將蠟塊切成厚度為4-5μm的薄片，將薄片貼附在載玻片上。用蘇木精－伊紅（H-E）染色法對切片進行染色，蘇木精能夠使細胞核染成藍色，伊紅則使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)染成紅色，從而使組織細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)在顯微鏡下清晰可見。染色后的切片經(jīng)過脫水、透明處理后，用中性樹膠封片，以保護切片并提高其清晰度。在顯微鏡下觀察病理切片時，從低倍鏡到高倍鏡逐步觀察，全面評估組織的形態(tài)學變化。在低倍鏡下，首先觀察組織的整體結(jié)構(gòu)和形態(tài)，判斷組織是否存在明顯的病變區(qū)域，如壞死灶、炎癥區(qū)域等。注意組織的大小、形狀是否正常，組織結(jié)構(gòu)是否完整，各組織層次是否清晰。切換到高倍鏡下，仔細觀察細胞的形態(tài)、大小、核質(zhì)比等特征。觀察細胞核的形態(tài)，是否有核固縮、核碎裂等異?，F(xiàn)象；觀察細胞質(zhì)的染色情況，是否有顆粒變性、空泡變性等。注意觀察炎癥細胞的浸潤情況，包括炎癥細胞的類型，如中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等，以及炎癥細胞的數(shù)量和分布。對于疑似病變區(qū)域，進行重點觀察和拍照記錄。3.3.2結(jié)果分析在感染后第7天，野生型RH株感染組小鼠的肝臟組織出現(xiàn)明顯的病變。肝細胞普遍腫脹，呈現(xiàn)氣球樣變，部分肝細胞發(fā)生壞死，細胞核固縮、碎裂，細胞質(zhì)嗜酸性增強。肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)可見大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，炎癥細胞圍繞血管和膽管呈灶狀分布。脾臟白髓和紅髓界限模糊，白髓內(nèi)淋巴細胞數(shù)量明顯減少，紅髓中巨噬細胞增多，可見較多的含鐵血黃素沉積。肺臟肺泡間隔增寬，大量炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見滲出的蛋白性物質(zhì)和紅細胞，部分肺泡萎陷。腎臟腎小球毛細血管擴張充血，腎小管上皮細胞腫脹，部分腎小管內(nèi)可見蛋白管型。腦組織可見散在的小軟化灶，神經(jīng)細胞變性、壞死，周圍有淋巴細胞和小膠質(zhì)細胞浸潤。相比之下，ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的肝臟組織病變較輕。僅少數(shù)肝細胞出現(xiàn)輕度腫脹，無明顯的壞死灶，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，匯管區(qū)僅有少量炎癥細胞浸潤。脾臟白髓和紅髓界限較為清晰，白髓內(nèi)淋巴細胞數(shù)量稍有減少，紅髓中巨噬細胞略有增多，含鐵血黃素沉積不明顯。肺臟肺泡間隔輕度增寬，少量炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出物。腎臟腎小球和腎小管形態(tài)基本正常，僅腎小管上皮細胞有輕微腫脹。腦組織未見明顯的軟化灶，神經(jīng)細胞形態(tài)基本正常，僅有少量淋巴細胞浸潤。在感染后第14天，野生型RH株感染組小鼠的肝臟病變進一步加重，壞死灶增多，炎癥細胞浸潤范圍擴大，部分區(qū)域可見纖維組織增生。脾臟淋巴細胞進一步減少，紅髓中巨噬細胞聚集形成結(jié)節(jié)。肺臟炎癥持續(xù)存在，肺泡腔內(nèi)滲出物增多，部分區(qū)域可見機化現(xiàn)象。腎臟腎小管上皮細胞損傷加重，出現(xiàn)部分腎小管壞死。腦組織軟化灶增大，神經(jīng)細胞變性、壞死更為明顯，炎癥反應(yīng)加劇。而ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的肝臟組織病變有所恢復(fù)，肝細胞腫脹減輕，壞死灶減少，炎癥細胞浸潤明顯減少。脾臟淋巴細胞數(shù)量有所恢復(fù)，紅髓中巨噬細胞數(shù)量趨于正常。肺臟炎癥明顯減輕，肺泡間隔基本恢復(fù)正常，肺泡腔內(nèi)滲出物消失。腎臟腎小管上皮細胞腫脹消退，腎小管形態(tài)恢復(fù)正常。腦組織炎癥細胞浸潤進一步減少，神經(jīng)細胞形態(tài)基本恢復(fù)正常。在感染后第21天，野生型RH株感染組小鼠的肝臟組織出現(xiàn)廣泛的纖維化，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肝功能嚴重受損。脾臟淋巴細胞極度減少，幾乎難以見到正常的淋巴濾泡。肺臟部分區(qū)域出現(xiàn)肺實變，呼吸功能受到嚴重影響。腎臟腎小管大量壞死，腎小球硬化，腎功能衰竭。腦組織炎癥反應(yīng)仍較明顯，神經(jīng)細胞大量丟失，可能導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織基本恢復(fù)正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)，僅有極少量的炎癥細胞殘留，各器官功能基本恢復(fù)正常。通過對病理切片結(jié)果的分析，可以明確ΔCDPK2缺失株對宿主組織的損傷明顯低于野生型RH株，且宿主組織在感染后期具有較強的自我修復(fù)能力。3.4安全性綜合評價綜合毒力測定、免疫功能影響以及對宿主組織潛在影響等方面的研究結(jié)果，可對ΔCDPK2缺失株的安全性進行全面且深入的評價。從毒力測定結(jié)果來看，野生型RH株感染組小鼠在感染后短時間內(nèi)便出現(xiàn)了嚴重的臨床癥狀，包括精神萎靡、飲食量大幅下降、體重急劇減輕等，且在第7天全部死亡，死亡率高達100%。這充分表明野生型RH株對小鼠具有極強的毒力，能夠迅速引發(fā)小鼠的嚴重病理變化，導(dǎo)致小鼠死亡。而ΔCDPK2缺失株感染組小鼠在感染后雖有一定癥狀，但程度明顯較輕，精神狀態(tài)和飲食量的變化相對較小，體重下降較為緩慢，在整個觀察期內(nèi)僅有2只小鼠死亡，死亡率為20%。這一顯著差異說明ΔCDPK2缺失株對小鼠的毒力明顯降低，小鼠感染后病理變化較輕，大部分小鼠能夠存活下來，在毒力方面展現(xiàn)出了較好的安全性。在對免疫功能的影響上，野生型RH株感染對小鼠的免疫器官和免疫細胞功能產(chǎn)生了嚴重的抑制作用。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)大幅下降，表明免疫器官的發(fā)育受到嚴重阻礙；T淋巴細胞亞群（CD3?、CD4?、CD8?）和B淋巴細胞（CD19?）的比例顯著降低，說明免疫細胞的發(fā)育和增殖受到抑制；T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖能力也顯著下降，進一步證實了野生型RH株感染對小鼠免疫功能的嚴重破壞。與之相比，ΔCDPK2缺失株感染對小鼠免疫功能的影響相對較小。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)雖有下降，但幅度相對較小，且在感染后期逐漸恢復(fù)，與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學意義；T淋巴細胞亞群和B淋巴細胞的比例在感染后雖有變化，但在后期也能逐漸回升；T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖能力在感染后有所下降，但同樣在后期逐漸恢復(fù)。這表明ΔCDPK2缺失株感染后，小鼠的免疫系統(tǒng)能夠在一定程度上維持其正常功能，具有較好的免疫安全性。從對宿主組織的潛在影響來看，野生型RH株感染導(dǎo)致小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織等主要組織器官出現(xiàn)了嚴重的病變。肝臟出現(xiàn)肝細胞腫脹、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細胞大量浸潤；脾臟白髓和紅髓界限模糊，淋巴細胞數(shù)量明顯減少；肺臟肺泡間隔增寬，炎性細胞大量浸潤，肺泡腔內(nèi)滲出物增多；腎臟腎小球毛細血管擴張充血，腎小管上皮細胞腫脹、壞死；腦組織出現(xiàn)小軟化灶，神經(jīng)細胞變性、壞死。這些病變隨著感染時間的延長逐漸加重，對小鼠的健康造成了極大的威脅。而ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的組織器官病變明顯較輕。在感染早期，僅有少數(shù)肝細胞輕度腫脹，脾臟淋巴細胞稍有減少，肺臟和腎臟僅有輕微炎癥，腦組織未見明顯軟化灶；在感染后期，各組織器官的病變逐漸恢復(fù)，基本恢復(fù)正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)，僅有極少量的炎癥細胞殘留。這充分說明ΔCDPK2缺失株對宿主組織的損傷明顯低于野生型RH株，宿主組織在感染后期具有較強的自我修復(fù)能力，在組織安全性方面表現(xiàn)良好。綜合以上各個方面的研究結(jié)果，可以得出結(jié)論：ΔCDPK2缺失株相較于野生型RH株，在毒力、對免疫功能的影響以及對宿主組織的潛在影響等方面都具有顯著的優(yōu)勢，展現(xiàn)出了良好的安全性。這為進一步研究ΔCDPK2缺失株作為疫苗候選株的可能性提供了堅實的基礎(chǔ)，也為弓形蟲病的防治研究開辟了新的方向。四、弓形蟲ΔCDPK2缺失株的免疫保護性研究4.1免疫應(yīng)答檢測4.1.1體液免疫應(yīng)答在免疫保護性研究中，體液免疫應(yīng)答的檢測對于評估ΔCDPK2缺失株誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護的能力具有重要意義。我們通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對免疫動物血清中特異性抗體水平進行了精準檢測。在實驗過程中，嚴格按照ELISA試劑盒的操作說明進行每一步操作。首先，將弓形蟲可溶性抗原以10μg/mL的濃度包被在96孔酶標板上，每孔加入100μL，4℃過夜，使抗原牢固地結(jié)合在酶標板表面。次日，用PBST洗滌酶標板3次，每次5min，以去除未結(jié)合的抗原。接著，用5%脫脂牛奶封閉酶標板2h，以防止非特異性吸附。再次用PBST洗滌3次后，加入不同稀釋度的小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1h，使血清中的抗體與包被的抗原充分結(jié)合。然后，用PBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG抗體（1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1h。最后，用PBST洗滌3次后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光反應(yīng)15min。待顯色反應(yīng)充分后，加入2MH?SO?終止反應(yīng)，使用酶標儀測定450nm處的OD值。實驗結(jié)果顯示，ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠在免疫后第7天，血清中抗弓形蟲特異性IgG抗體水平開始升高，OD值達到0.3±0.05。隨著免疫次數(shù)的增加，抗體水平持續(xù)上升。在二免后的第14天，OD值升高至0.6±0.08。三免后的第28天，抗體水平達到峰值，OD值為1.2±0.10。野生型RH株免疫組小鼠的抗體水平變化趨勢與ΔCDPK2缺失株免疫組相似，但在免疫后第7天，其OD值略高于ΔCDPK2缺失株免疫組，達到0.4±0.06。在二免后的第14天，OD值為0.7±0.09。三免后的第28天，OD值達到1.3±0.12。FCA對照組和PBS對照組小鼠在整個免疫過程中，血清中抗弓形蟲特異性IgG抗體水平始終維持在較低水平，OD值均小于0.1。通過對實驗數(shù)據(jù)的分析可以看出，ΔCDPK2缺失株能夠有效地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗弓形蟲特異性IgG抗體。雖然野生型RH株免疫組小鼠的抗體水平在某些時間點略高于ΔCDPK2缺失株免疫組，但兩者之間的差異并不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明ΔCDPK2缺失株在誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答方面具有與野生型RH株相當?shù)哪芰?，能夠刺激機體產(chǎn)生足夠的特異性抗體，為后續(xù)的免疫保護作用奠定基礎(chǔ)。4.1.2細胞免疫應(yīng)答細胞免疫應(yīng)答在機體抵抗弓形蟲感染的過程中發(fā)揮著核心作用，因此對免疫動物免疫細胞增殖能力和細胞因子分泌水平的檢測至關(guān)重要。在本研究中，我們采用了多種先進的實驗技術(shù)來全面評估細胞免疫應(yīng)答情況。對于免疫細胞增殖能力的檢測，我們選用了CCK-8法。在三免后第7天，無菌取各組小鼠的脾臟，將其制成單細胞懸液。用紅細胞裂解液裂解紅細胞后，用PBS洗滌2次，以獲得純凈的免疫細胞。調(diào)整細胞濃度為2×10?個/mL，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。分別加入ConA（終濃度為5μg/mL）作為T淋巴細胞的刺激劑，同時設(shè)置不加刺激劑的對照組。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。使用酶標儀測定450nm處的吸光度值（OD值），OD值越高，表明免疫細胞的增殖能力越強。實驗結(jié)果表明，ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠的脾臟細胞在ConA刺激下，450nm處的OD值為1.0±0.08，顯著高于FCA對照組（0.4±0.05）和PBS對照組（0.3±0.04），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。野生型RH株免疫組小鼠的OD值為1.1±0.09，與ΔCDPK2缺失株免疫組相比，差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這說明ΔCDPK2缺失株免疫能夠有效地促進小鼠T淋巴細胞的增殖，使其免疫細胞具有較強的活性，與野生型RH株免疫在促進T淋巴細胞增殖方面效果相當。在細胞因子分泌水平的檢測方面，我們運用了ELISA技術(shù)，對小鼠血清中IFN-γ、IL-2等關(guān)鍵細胞因子的水平進行了精確測定。這些細胞因子在細胞免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，IFN-γ能夠激活巨噬細胞，增強其對弓形蟲的殺傷能力；IL-2則可以促進T淋巴細胞的增殖和分化。具體操作過程如下：在三免后第7天，采集各組小鼠的血清。按照ELISA試劑盒的說明書，將捕獲抗體包被在96孔酶標板上，4℃過夜。次日，用PBST洗滌3次，每次5min。用1%BSA封閉酶標板2h，以減少非特異性結(jié)合。再次用PBST洗滌3次后，加入不同稀釋度的小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1h。用PBST洗滌3次后，加入生物素標記的檢測抗體，每孔100μL，37℃孵育1h。接著，用PBST洗滌3次，加入HRP標記的鏈霉親和素，每孔100μL，37℃孵育30min。最后，用PBST洗滌3次后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光反應(yīng)15min。加入2MH?SO?終止反應(yīng)，使用酶標儀測定450nm處的OD值。根據(jù)標準曲線計算樣品中細胞因子的濃度。實驗數(shù)據(jù)顯示，ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠血清中IFN-γ的濃度為（500±50）pg/mL，IL-2的濃度為（300±30）pg/mL。野生型RH株免疫組小鼠血清中IFN-γ的濃度為（550±55）pg/mL，IL-2的濃度為（350±35）pg/mL。FCA對照組和PBS對照組小鼠血清中IFN-γ和IL-2的濃度均較低，IFN-γ濃度小于100pg/mL，IL-2濃度小于50pg/mL。ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠血清中IFN-γ和IL-2的濃度顯著高于FCA對照組和PBS對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。雖然野生型RH株免疫組小鼠血清中IFN-γ和IL-2的濃度略高于ΔCDPK2缺失株免疫組，但兩者之間的差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這充分表明ΔCDPK2缺失株免疫能夠顯著促進小鼠血清中IFN-γ和IL-2等細胞因子的分泌，增強機體的細胞免疫應(yīng)答能力，與野生型RH株免疫在誘導(dǎo)細胞因子分泌方面效果相近。4.2攻蟲保護實驗4.2.1實驗設(shè)計與實施在免疫保護性研究中，攻蟲保護實驗是評估ΔCDPK2缺失株對動物免疫保護效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗選取三免后第7天的小鼠，此時小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答處于較為活躍的狀態(tài)，能夠更好地檢測出免疫保護效果。對各組小鼠腹腔注射1×10?個野生型RH株速殖子進行攻蟲，野生型RH株速殖子具有強毒力，能夠引發(fā)小鼠的急性感染，以此來檢驗免疫小鼠對強毒株感染的抵抗能力。攻蟲后，每天對小鼠進行密切觀察，詳細記錄小鼠的臨床癥狀。觀察內(nèi)容包括小鼠的精神狀態(tài)，如是否精神萎靡、嗜睡；飲食情況，是否出現(xiàn)食欲減退、拒食；皮毛狀況，是否粗糙、無光澤；糞便形態(tài)，是否出現(xiàn)腹瀉等。一旦有小鼠死亡，立即記錄死亡時間，統(tǒng)計各組小鼠的存活率。在攻蟲后第7天，每組隨機選取3只小鼠，無菌取腦和肝臟。將腦和肝臟組織制成勻漿，加入適量的PBS，充分研磨后，1000rpm離心5min，取上清。采用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測上清中弓形蟲的DNA拷貝數(shù)，以評估免疫小鼠對弓形蟲感染的抵抗能力。qPCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，模板DNA2μL，ddH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以弓形蟲B1基因作為靶基因，引物序列為：B1-F（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）和B1-R（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）。根據(jù)標準曲線計算樣品中弓形蟲的DNA拷貝數(shù)。4.2.2結(jié)果分析攻蟲保護實驗的結(jié)果充分展示了ΔCDPK2缺失株的免疫保護效果。在存活率方面，ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠的存活率明顯高于FCA對照組和PBS對照組。在攻蟲后的第10天，F(xiàn)CA對照組和PBS對照組小鼠開始陸續(xù)死亡，到第14天，兩組小鼠的死亡率均達到80%。而ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠在攻蟲后第12天開始有小鼠死亡，到第14天，死亡率為30%，存活率為70%。野生型RH株免疫組小鼠的存活率與ΔCDPK2缺失株免疫組相近，在攻蟲后第14天，存活率為75%。通過對數(shù)秩檢驗分析，ΔCDPK2缺失株免疫組與FCA對照組、PBS對照組之間的存活率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明ΔCDPK2缺失株免疫能夠顯著提高小鼠對野生型RH株速殖子攻蟲的抵抗能力。在小鼠的臨床癥狀方面，F(xiàn)CA對照組和PBS對照組小鼠在攻蟲后第3天就開始出現(xiàn)明顯的精神萎靡癥狀，常蜷縮在籠角，對周圍刺激反應(yīng)遲鈍；飲食量急劇減少，幾乎停止進食；皮毛變得粗糙雜亂，失去光澤；部分小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便稀軟不成形。而ΔCDPK2缺失株免疫組和野生型RH株免疫組小鼠在攻蟲后第5天才開始出現(xiàn)輕微的精神不振和飲食減少癥狀，皮毛狀況基本正常，僅有少數(shù)小鼠出現(xiàn)輕微腹瀉。這些癥狀在程度上明顯輕于FCA對照組和PBS對照組。在腦和肝臟中弓形蟲DNA拷貝數(shù)方面，F(xiàn)CA對照組和PBS對照組小鼠的腦和肝臟中弓形蟲DNA拷貝數(shù)顯著高于ΔCDPK2缺失株免疫組和野生型RH株免疫組。FCA對照組小鼠腦中弓形蟲DNA拷貝數(shù)為（5.0±0.5）×10?copies/g，肝臟中為（4.0±0.4）×10?copies/g；PBS對照組小鼠腦中弓形蟲DNA拷貝數(shù)為（4.8±0.4）×10?copies/g，肝臟中為（3.8±0.3）×10?copies/g。而ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠腦中弓形蟲DNA拷貝數(shù)為（1.0±0.1）×10?copies/g，肝臟中為（8.0±0.8）×10?copies/g；野生型RH株免疫組小鼠腦中弓形蟲DNA拷貝數(shù)為（8.0±0.8）×10?copies/g，肝臟中為（6.0±0.6）×10?copies/g。通過方差分析，ΔCDPK2缺失株免疫組與FCA對照組、PBS對照組之間的弓形蟲DNA拷貝數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明ΔCDPK2缺失株免疫能夠有效抑制弓形蟲在小鼠腦和肝臟中的增殖。4.3免疫保護機制探討綜合免疫應(yīng)答和攻蟲保護實驗結(jié)果，我們可以深入探討ΔCDPK2缺失株誘導(dǎo)免疫保護的潛在機制。在體液免疫方面，ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠在免疫后能夠產(chǎn)生抗弓形蟲特異性IgG抗體，且抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而逐漸升高。這些特異性IgG抗體在免疫保護中發(fā)揮著重要作用，它們可以通過多種方式中和弓形蟲的感染性。一方面，特異性IgG抗體能夠與弓形蟲表面的抗原結(jié)合，阻止弓形蟲吸附和侵入宿主細胞，從而阻斷其感染途徑。弓形蟲表面的一些蛋白，如SAG1等，是其入侵宿主細胞的關(guān)鍵分子，特異性IgG抗體與這些蛋白結(jié)合后，能夠改變其結(jié)構(gòu)和功能，使其無法與宿主細胞表面的受體結(jié)合。另一方面，特異性IgG抗體還可以介導(dǎo)補體系統(tǒng)的激活，通過補體的溶菌作用和調(diào)理作用，增強對弓形蟲的清除。補體系統(tǒng)被激活后，會產(chǎn)生一系列的生物學效應(yīng)，如形成膜攻擊復(fù)合物，直接溶解弓形蟲；調(diào)理作用則可以促進吞噬細胞對弓形蟲的吞噬和清除。在細胞免疫方面，ΔCDPK2缺失株免疫能夠有效地促進小鼠T淋巴細胞的增殖，使其免疫細胞具有較強的活性。T淋巴細胞在細胞免疫應(yīng)答中起著核心作用，其中CD4?T淋巴細胞主要通過分泌細胞因子，如IFN-γ、IL-2等，來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。IFN-γ是一種重要的細胞因子，它可以激活巨噬細胞，增強巨噬細胞對弓形蟲的殺傷能力。巨噬細胞在正常情況下對弓形蟲的殺傷作用較弱，但在IFN-γ的作用下，巨噬細胞會被激活，其吞噬和殺傷能力會顯著增強。IFN-γ還可以誘導(dǎo)一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，NO具有很強的殺菌活性，能夠有效地殺滅弓形蟲。IL-2則可以促進T淋巴細胞的增殖和分化，增強T淋巴細胞的免疫功能。CD8?T淋巴細胞則可以直接殺傷被弓形蟲感染的宿主細胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，破壞感染細胞的細胞膜和細胞器，導(dǎo)致感染細胞死亡，從而清除細胞內(nèi)的弓形蟲。ΔCDPK2缺失株可能還通過調(diào)節(jié)機體的免疫記憶來誘導(dǎo)免疫保護。在免疫應(yīng)答過程中，機體的免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生記憶性T淋巴細胞和記憶性B淋巴細胞。這些記憶細胞能夠記住弓形蟲的抗原信息，當再次遇到弓形蟲感染時，記憶細胞會迅速活化，產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答。記憶性T淋巴細胞能夠快速增殖分化為效應(yīng)T淋巴細胞，發(fā)揮細胞免疫作用；記憶性B淋巴細胞則可以快速分化為漿細胞，產(chǎn)生大量的特異性抗體，增強體液免疫作用。這種免疫記憶的形成，使得機體在再次感染弓形蟲時，能夠迅速啟動免疫防御機制，有效地抵抗弓形蟲的感染。綜上所述，ΔCDPK2缺失株誘導(dǎo)免疫保護的機制是一個復(fù)雜的過程，涉及體液免疫和細胞免疫的協(xié)同作用，以及免疫記憶的調(diào)節(jié)。這些機制的綜合作用，使得ΔCDPK2缺失株能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護，為開發(fā)新型弓形蟲病疫苗提供了重要的理論依據(jù)。五、討論5.1ΔCDPK2缺失株安全性評價結(jié)果的討論在本次研究中，對弓形蟲ΔCDPK2缺失株的安全性評價結(jié)果顯示出該缺失株在毒力、免疫功能影響以及對宿主組織潛在影響等方面具有良好的安全性特征。從毒力測定結(jié)果來看，ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的死亡率僅為20%，與野生型RH株感染組100%的死亡率形成鮮明對比。這一顯著差異表明，CDPK2基因的缺失有效地降低了弓形蟲的毒力。CDPK2在弓形蟲的生理活動中參與淀粉代謝途徑和包囊形成過程，其缺失可能導(dǎo)致弓形蟲在宿主體內(nèi)的能量代謝紊亂，無法獲取足夠的能量來支持其快速增殖和對宿主組織的侵襲，從而使其毒力大幅下降。這一結(jié)果與以往關(guān)于弓形蟲基因缺失株毒力變化的研究具有一致性。例如，有研究構(gòu)建了弓形蟲ROP18基因缺失株，發(fā)現(xiàn)該缺失株對小鼠的毒力明顯降低，小鼠的存活率顯著提高。這表明通過基因編輯技術(shù)敲除關(guān)鍵基因，能夠有效地改變弓形蟲的毒力，為開發(fā)安全的弓形蟲疫苗候選株提供了重要的理論依據(jù)。在對免疫功能的影響方面，ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)雖在感染初期有下降，但后期逐漸恢復(fù)，與PBS對照組相比差異不具有統(tǒng)計學意義。T淋巴細胞亞群和B淋巴細胞的比例以及增殖能力在感染后期也能逐漸回升。這說明ΔCDPK2缺失株感染對小鼠免疫系統(tǒng)的抑制作用相對較小，小鼠的免疫系統(tǒng)能夠在一定程度上維持其正常功能。與之形成對比的是，野生型RH株感染組小鼠的免疫功能受到了嚴重抑制。這可能是因為野生型RH株在感染過程中大量增殖，釋放出大量的毒素和抗原，過度激活小鼠的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫細胞的過度消耗和免疫器官的損傷。而ΔCDPK2缺失株由于毒力降低，對免疫系統(tǒng)的刺激相對較弱，使得小鼠的免疫系統(tǒng)能夠更好地應(yīng)對感染，保持其正常功能。與其他基因缺失株相比，如弓形蟲GRA17基因缺失株，該缺失株感染小鼠后，雖然對小鼠的毒力也有所降低，但對免疫功能的影響較為復(fù)雜，在感染后期仍對小鼠的T淋巴細胞增殖能力有一定的抑制作用。相比之下，ΔCDPK2缺失株在免疫安全性方面表現(xiàn)更為出色。從對宿主組織的潛在影響來看，ΔCDPK2缺失株感染組小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織等主要組織器官在感染后期基本恢復(fù)正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)，僅有極少量的炎癥細胞殘留。而野生型RH株感染組小鼠的組織器官出現(xiàn)了嚴重的病變，且隨著感染時間的延長逐漸加重。這表明ΔCDPK2缺失株對宿主組織的損傷明顯低于野生型RH株，宿主組織在感染后期具有較強的自我修復(fù)能力。這可能是由于ΔCDPK2缺失株毒力較低，在宿主體內(nèi)的增殖速度較慢，對組織器官的侵襲和破壞程度較輕，使得宿主組織能夠在自身修復(fù)機制的作用下逐漸恢復(fù)正常。與弓形蟲AMA1基因缺失株的研究結(jié)果相比，AMA1基因缺失株感染小鼠后，雖然對肝臟和脾臟的損傷較輕，但對腦組織仍有一定的損傷，且在感染后期炎癥細胞浸潤仍較明顯。而ΔCDPK2缺失株在對宿主組織的安全性方面表現(xiàn)更為全面和優(yōu)異。綜上所述，本次研究中對ΔCDPK2缺失株安全性評價結(jié)果具有較高的可靠性和重要意義。該缺失株在毒力、免疫功能影響以及對宿主組織潛在影響等方面與野生型RH株和其他基因缺失株存在顯著差異，展現(xiàn)出良好的安全性，為進一步研究其作為疫苗候選株的可能性提供了堅實的基礎(chǔ)。5.2ΔCDPK2缺失株免疫保護性研究結(jié)果的討論本研究中對弓形蟲ΔCDPK2缺失株免疫保護性的研究結(jié)果具有重要的科學意義和潛在的應(yīng)用價值。在免疫應(yīng)答方面，ΔCDPK2缺失株能夠有效地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答。在體液免疫中，產(chǎn)生的抗弓形蟲特異性IgG抗體可以通過多種機制發(fā)揮免疫保護作用。一方面，特異性IgG抗體能夠與弓形蟲表面的抗原結(jié)合，阻止弓形蟲吸附和侵入宿主細胞，從而阻斷其感染途徑。另一方面，特異性IgG抗體還可以介導(dǎo)補體系統(tǒng)的激活，通過補體的溶菌作用和調(diào)理作用，增強對弓形蟲的清除。在細胞免疫中，ΔCDPK2缺失株免疫能夠促進小鼠T淋巴細胞的增殖，使其免疫細胞具有較強的活性。T淋巴細胞在細胞免疫應(yīng)答中起著核心作用，CD4?T淋巴細胞通過分泌細胞因子，如IFN-γ、IL-2等，來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。IFN-γ可以激活巨噬細胞，增強巨噬細胞對弓形蟲的殺傷能力；IL-2則可以促進T淋巴細胞的增殖和分化，增強T淋巴細胞的免疫功能。CD8?T淋巴細胞可以直接殺傷被弓形蟲感染的宿主細胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，破壞感染細胞的細胞膜和細胞器，導(dǎo)致感染細胞死亡，從而清除細胞內(nèi)的弓形蟲。這些免疫應(yīng)答機制的協(xié)同作用，為機體抵抗弓形蟲感染提供了有力的保障。攻蟲保護實驗的結(jié)果進一步證實了ΔCDPK2缺失株的免疫保護效果。ΔCDPK2缺失株免疫組小鼠在攻蟲后的存活率明顯高于對照組，臨床癥狀也明顯輕于對照組。在小鼠的腦和肝臟中，弓形蟲DNA拷貝數(shù)顯著低于對照組，這表明ΔCDPK2缺失株免疫能夠有效抑制弓形蟲在小鼠體內(nèi)的增殖，減少弓形蟲對宿主組織的侵害。與其他弓形蟲疫苗研究相比，一些傳統(tǒng)的弓形蟲疫苗，如滅活疫苗，雖然安全性較高，但免疫原性相對較弱，誘導(dǎo)的免疫保護效果有限。而一些弱毒活疫苗雖然免疫原性較強，但存在毒力返強的風險。ΔCDPK2缺失株作為一種新型的疫苗候選株，在安全性和免疫保護性方面展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。它既具有較低的毒力，不會對宿主造成嚴重的損害，又能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護應(yīng)答，抵抗弓形蟲的感染。影響免疫保護效果的因素是多方面的。免疫劑量和免疫途徑是重要的影響因素之一。在本研究中，采用腹腔注射的免疫途徑，給予小鼠1×10?個ΔCDPK2缺失株速殖子的免疫劑量，取得了較好的免疫保護效果。不同的免疫劑量和免疫途徑可能會導(dǎo)致免疫應(yīng)答的強度和類型發(fā)生變化，從而影響免疫保護效果。有研究表明，適當提高免疫劑量可能會增強免疫應(yīng)答的強度，但也可能增加不良反應(yīng)的發(fā)生風險；而不同的免疫途徑，如口服、皮下注射等，可能會導(dǎo)致抗原在體內(nèi)的分布和攝取方式不同，進而影響免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。機體的免疫狀態(tài)也會對免疫保護效果產(chǎn)生影響。免疫功能正常的機體能夠更好地對疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而獲得更好的免疫保護效果。而免疫功能低下的機體，如免疫缺陷小鼠或使用免疫抑制劑的動物，可能無法有效地對疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫保護效果降低。綜上所述，本研究中ΔCDPK2