關(guān)于某對蝦養(yǎng)殖場的對蝦疾病的調(diào)查分析報(bào)告目錄TOC\o"1-3"\h\u31993關(guān)于某對蝦養(yǎng)殖場的對蝦疾病的調(diào)查分析報(bào)告 1242601.1引言 1314061.2材料和方法 2269421.2.1樣品采集地及樣品采集信息 210481.2.2水質(zhì)調(diào)查 4142341.2.3弧菌數(shù)定量 4107041.2.4細(xì)菌分離鑒定 487491.2.5病原檢測 5114061.2.6可疑病原菌的PirAB檢測 6209141.2.7數(shù)據(jù)處理 6310711.3結(jié)果 6208011.3.1養(yǎng)殖場1水質(zhì)調(diào)查 6246511.3.2弧菌數(shù)定量 794181.3.3潛在細(xì)菌性病原的檢出情況 885561.3.4對蝦主要病原檢出情況 9123771.3.5主要可疑細(xì)菌性病原的PirAB檢測 1029531.4討論 10242572.5結(jié)論 121.1引言凡納濱對蝦（LitopenaeusVannamei）自1989年引入我國后，隨著育苗及養(yǎng)殖技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)成為我國養(yǎng)殖對蝦中的重要品種。該蝦具有廣鹽、適宜高密度養(yǎng)殖等特性，因而在我國沿海及內(nèi)陸地區(qū)具有廣泛的養(yǎng)殖，也是室內(nèi)工廠化及半工廠化養(yǎng)殖的重要品種，養(yǎng)殖單產(chǎn)可達(dá)13.3kg/m3ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>杜以帥</Author><Year>2021</Year><RecNum>69</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[62]</style></DisplayText><record><rec-number>69</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645362463">69</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="中文期刊">40</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">杜以帥</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">邱天龍</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">周利</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">陳福迪</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">徐建平</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">李葉</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">孫建明</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">三段式凡納濱對蝦循環(huán)水養(yǎng)殖模式研究</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">漁業(yè)現(xiàn)代化</style></secondary-title></titles><pages>51-66</pages><volume>48</volume><number>3</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[62]。隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，對蝦疾病已成為近年來阻礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要原因之一。目前在我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖中報(bào)道的重要病原有WSSV、IHHNV、DIV1、CMNV、VpAHPND和EHP等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[63-69]，其中任何一種單病原感染或多病原混合感染，均會給對蝦養(yǎng)殖帶來嚴(yán)重影響，特別是在高密度的養(yǎng)殖條件下，因水環(huán)境條件脅迫，對蝦會出現(xiàn)高的發(fā)病率及死亡率ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Thitamadee</Author><Year>2016</Year><RecNum>76</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[70]</style></DisplayText><record><rec-number>76</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645363398">76</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Thitamadee,S.</author><author>Prachumwat,A.</author><author>Srisala,J.</author><author>Jaroenlak,P.</author><author>Salachan,P.V.</author><author>Sritunyalucksana,K.</author><author>Flegel,T.W.</author><author>Itsathitphaisarn,O.%JAquaculture</author></authors></contributors><titles><title>ReviewofcurrentdiseasethreatsforcultivatedpenaeidshrimpinAsia</title></titles><pages>69-87</pages><dates><year>2016</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[70]。優(yōu)質(zhì)苗種的持續(xù)供應(yīng)是促使我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素，我國蝦苗生產(chǎn)的規(guī)范化程度較低，苗種育成的質(zhì)量不斷下降，大部分苗種在不同養(yǎng)殖地區(qū)相互轉(zhuǎn)運(yùn)，使病原的傳播風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步加大，嚴(yán)重影響對蝦養(yǎng)殖ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>G</Author><Year>1999</Year><RecNum>77</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[71,72]</style></DisplayText><record><rec-number>77</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645407534">77</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Vandenberghe

J;Verdonck

L;Robles-Arozarena

R;RiveraG</author></authors></contributors><titles><title>Vibrios

associated

with

Litopenaeusvannamei

larvae,postlarvae,

broodstock,

and

hatchery

probionts</title><secondary-title>Applied

and

Environmental

Microbiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Applied

and

Environmental

Microbiology</full-title></periodical><pages>2592-2597</pages><volume>6</volume><number>65</number><dates><year>1999</year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>FAO</Author><Year>2003</Year><RecNum>78</RecNum><record><rec-number>78</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645407734">78</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>FAO</author></authors></contributors><titles><title>Healthmanagementandbiosecuritymaintenanceinwhiteshrimp(Penaeusvannamei)hatcheriesinLatinAmerica</title></titles><dates><year>2003</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[71,72]。鹵蟲等鮮活餌料在蝦類育苗環(huán)節(jié)起到關(guān)鍵作用，已有研究報(bào)道，鹵蟲可能攜帶WSSV、IMNV、HPV等蝦類病毒，還存在被多種致病性弧菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，也可能攜帶EHP并進(jìn)行傳播ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王一婷</Author><Year>2020</Year><RecNum>66</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[60]</style></DisplayText><record><rec-number>66</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645351418">66</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="中文期刊">40</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王一婷</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">史成銀</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">隋麗英</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">葉仕根</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">董宣</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">黃倢</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">鹵蟲作為生物餌料傳播蝦類病原風(fēng)險(xiǎn)的研究進(jìn)展</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">中國動(dòng)物檢疫</style></secondary-title></titles><pages>61-67</pages><volume>37</volume><number>11</number><dates><year>2020</year></dates><urls></urls><electronic-resource-num>10.3969/j.issn.1005-944X.2020.11.013</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[60]。濰坊市北部沿海地區(qū)，有大面積的鹽堿地，因地下蘊(yùn)藏豐富的鹵淡水資源，近年來被開采用于魚類及對蝦養(yǎng)殖，其中冬季溫棚高密度養(yǎng)殖是當(dāng)?shù)貎?nèi)陸地區(qū)對蝦養(yǎng)殖的重要模式之一，該模式采用地下鹵淡水勾兌作為養(yǎng)殖用水，利用塑料溫棚結(jié)合地源熱泵或電廠余熱為熱源調(diào)控水溫，廣泛利用當(dāng)?shù)氐柠u蟲、毛蝦（Acetechinensis）或貝類等為鮮活飼料，蝦苗經(jīng)過分級暫養(yǎng)后進(jìn)入養(yǎng)成池，最高養(yǎng)成密度可達(dá)1000尾/m3水體，產(chǎn)量達(dá)20kg/m3水體。濰坊北部室內(nèi)凡納濱養(yǎng)殖歷史較早，具有代表性，但養(yǎng)殖成功率不穩(wěn)定，大批量死亡、生長緩慢等問題時(shí)常發(fā)生。2020年11月中下旬，濰坊濱海開發(fā)區(qū)及壽光市室內(nèi)養(yǎng)殖凡納濱對蝦出現(xiàn)突發(fā)性死亡現(xiàn)象。為查明凡納濱對蝦的發(fā)病原因，本研究調(diào)查了轄區(qū)5家養(yǎng)殖場的對蝦、飼料、蝦苗等樣品，采用分子生物學(xué)檢測方法分析了上述樣品中6種主要對蝦病原的感染情況ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>韓琳</Author><Year>2018</Year><RecNum>148</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[69]</style></DisplayText><record><rec-number>148</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1648606906">148</key></foreign-keys><ref-typename="中文期刊">40</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">韓琳</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王秀華</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">楊冰</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">萬曉媛</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">武和英</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">張慶利</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">黃倢</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">一例日本對蝦暴發(fā)性死亡的病原分析</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">水產(chǎn)學(xué)報(bào)</style></secondary-title></titles><pages>11</pages><volume>42</volume><number>3</number><dates><year>2018</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[69]，并進(jìn)行可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定，對可疑病原菌進(jìn)行菌株的毒性分析，以闡明本次凡納濱對蝦暴發(fā)性死亡的病因，為凡納濱對蝦的健康養(yǎng)殖及疾病防控研究提供參考。1.2材料和方法1.2.1樣品采集地及樣品采集信息濰坊市北部對蝦養(yǎng)殖場，主要集中在萊州灣南岸的昌邑市、濱海新區(qū)及壽光市的沿海及灘涂地區(qū)，冬季養(yǎng)殖大棚多為陸基養(yǎng)殖，全部采用地下水養(yǎng)殖，大棚面積在500m2～1000m2，棚內(nèi)養(yǎng)殖池大小在20m2～30m2，池深平均在1.5m左右，養(yǎng)殖池通過氣石或納米管曝氣，養(yǎng)殖用水為地下鹵水與淡水混合，鹽度在10～30不等。蝦苗經(jīng)過中間暫養(yǎng)后，最終放苗密度在500尾/m2～1000尾/m2，養(yǎng)成期投喂配合餌料與冰鮮餌料，其中配合餌料日投喂次2～4次，冰鮮料投喂2次。根據(jù)餌料的剩余量，調(diào)整投喂數(shù)量，餌料系數(shù)在1.2左右。2020年12月共采集樣品19個(gè)，其中成蝦、幼蝦、蝦苗及飼料各占52.63%、15.79%、5.26%、26.32%，共來源于5個(gè)養(yǎng)殖場。樣品采集地點(diǎn)分布見圖2-1，樣品采集信息見表2-1。于采樣點(diǎn)1采集養(yǎng)殖水樣3L，用于水質(zhì)檢測，海水對照樣品取自青島近海，用雙蒸水調(diào)劑成與養(yǎng)殖用水相同的鹽度。于采樣點(diǎn)1及采樣點(diǎn)2采取正常對蝦、發(fā)病對蝦及冰鮮餌料樣品，于采樣點(diǎn)3、4、5，采集發(fā)病樣品，用于病原檢測，對蝦樣品每個(gè)池隨機(jī)采集3尾，將每尾對蝦的蝦鰓、肝胰腺組織并樣，每個(gè)冰鮮餌料樣品隨機(jī)采集3個(gè)小樣進(jìn)行并樣成一個(gè)待測樣品。對蝦及餌料樣品分別用95%乙醇及RNAlater(TIANGEN,中國北京)進(jìn)行固定保存。使用TIANampMarineAnimalsDNAKit(TIANGEN,中國北京)提取對蝦及飼料樣品基因組DNA，-20℃保存。同樣取保存于RNAlater中的樣品，使用RNApreppureTissueKit(TIANGEN，中國北京)提取基因組RNA，-80℃保存ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>武和英</Author><Year>2019</Year><RecNum>147</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>147</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1648603597">147</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">武和英</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王秀華</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">楊冰</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">于黨輝</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">黃倢</style><styleface="normal"font="default"size="100%"></style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">一對蝦養(yǎng)殖場的多病原跟蹤</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展</full-title></periodical><pages>11</pages><volume>40</volume><number>4</number><dates><year>2019</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[4]。圖2-1樣品采集地Fig.2-1Locationsofsamplingsite表2-1樣品采集信息Tab.2-1Informationofsampling采樣點(diǎn)編號Codeofsamplingsite對蝦體長(cm)Bodylengthofshrimp餌料種類Typeofshrimpfeed水源Watersource對蝦癥狀Symptomsofshrimp18.2±0.36AP+FAB+FWHM24.03±0.45AP+FA+FACB+FWHM33.93±0.45AP+FA+FACB+FWHM411.63±0.40AP+FA+FACB+FWHM53.57±0.47AP+FAB+FWPG注：AP：人工飼料；FA：冰凍鹵蟲；FAC：冰凍毛蝦；B：鹽水；FW：淡水；HM：高死亡率；PG：生長緩慢Notes:AP:Artificialpellet;FA:Frozenartemia;FAC:FrozenAceteschinensis;B:Brine;FW:Freshwater;HM:Highmortality;PG:Poorgrowth1.2.2水質(zhì)調(diào)查水樣常量元素（Na+、Mg2+、Ca2+、K+、Sr2+、CI-、SO42-、Br-、F-、HCO3-、CO32-）、重金屬（Cu2+、PbM+、Ni2+、Zn2+、HgM+、CrM+、CdM+）、揮發(fā)性酚、氰化物含量、總堿度及總硬度分析委托山東省物化探勘查院巖礦測試中心進(jìn)行，鹽度、pH、采用YSI556（美國賽萊默）多參數(shù)水質(zhì)測定儀檢測。1.2.3弧菌數(shù)定量隨機(jī)抽取采樣點(diǎn)1的發(fā)病蝦3只，在無菌環(huán)境下，解剖稱取樣品蝦的部分肝胰腺、中腸道，分別放入不同離心管中，加入10倍質(zhì)量的PBS研磨成勻漿，10倍梯度稀釋后涂布于TCBS平板。同樣取該采樣點(diǎn)養(yǎng)殖池中層水樣用PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100ul涂布于TCBS平板，所有涂布的TCBS平板于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)弧菌的數(shù)量，推算樣品蝦肝、腸道及水體中的弧菌密度。以同樣方法取附近養(yǎng)殖場的3只正常蝦及水樣進(jìn)弧菌數(shù)定量作為對照。1.2.4細(xì)菌分離鑒定針對4個(gè)養(yǎng)殖場采集對蝦及餌料樣品，在無菌條件下解剖病蝦和研磨餌料樣品，在2216E平板和TCBS平板上進(jìn)行細(xì)菌劃線分離。將分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行編號，-80℃保存。采用16SrRNA進(jìn)行細(xì)菌比對鑒定ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Bikrol</Author><Year>2010</Year><RecNum>8</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[73]</style></DisplayText><record><rec-number>8</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">8</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Bikrol,A.</author><author>Singh,S.K.</author></authors></contributors><titles><title>CharacterizationofBradyrhizobiumStrainsIsolatedfromDifferentVarietiesofSoybeanwith16SrDNARFLPfromAgriculturalLandofMadhyaPradesh,India</title><secondary-title>IndianJournalofMicrobiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>IndianJournalofMicrobiology</full-title></periodical><dates><year>2010</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[73]。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程有限公司測序，所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，待鑒定菌種對比的菌株相似率大于99.0%判定為同一個(gè)種，記為鑒定成功，用于統(tǒng)計(jì)分析。1.2.5病原檢測對WSSV、IHHNV和AHPND的檢測使用OIE推薦的套式PCR方法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>OIE</Author><Year>2019</Year><RecNum>4</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[74]</style></DisplayText><record><rec-number>4</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">4</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>OIE</author></authors></contributors><titles><title>ManualofDiagnosticTestsforAquaticAnimals.WorldOrganisationfor AnimalHealth</title></titles><dates><year>2019</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[74]，使用文獻(xiàn)報(bào)道的方法對EHP、CMNV及DIV1進(jìn)行檢測ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[75-77]。各種病原的引物序列見表2-2。表2-26種病原檢測的引物序列Tab.2-2Primersetsusedindetectingpathogens病原pathogen檢測方法detectionmethod引物primerset引物序列(5’-3’)primersequence產(chǎn)物片段大小(bp)sizeofPCRproductWSSV套式PCRnestPCR146F1ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG1447146R1TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA146F2GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA941146R2TACGGCAGCTGCTGCACCTTGIHHNV常規(guī)PCRtranditionalPCR389FCGGAACACAACCCGACTTTA389389RGGCCAAGACCAAAATACGAA309FTCCAACACTTAGTCAAAACCAA309309RTGTCTGCTACGATGATTATCCAVpAHPND套式PCRnestPCRAP4-F1ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC1269AP4-R1ACGATTTCGACGTTCCCCAAAP4-F2TTGAGAATACGGGACGTGGG230AP4-R2GTTAGTCATGTGAGCACCTTCEHP套式PCRnestPCRSWP-1FTTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT514SWP-1RCACGATGTGTCTTTGCAATTTTCSWP-2FTTGGCGGCACAATTCTCAAACA148SWP-2RGCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGACMNV套式PCRnestPCRCMNV-7F1AAATACGGCGATGACG619CMNV-7R1ACGAAGTGCCCACAGACCMNV-7F2CACAACCGAGTCAAACC165CMNV-7R2GCGTAAACAGCGAAGGDIV1套式PCRnestPCRDIV1-F1GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT457DIV1-R1TCGTTTCGGTACGAAGATGTADIV1-F2CGGGAAACGATTCGTATTGGG129DIV1-R2TTGCTTGATCGGCATCCTTGA1.2.6可疑病原菌的PirAB檢測對所分離的弧菌進(jìn)行細(xì)菌毒力基因PirA、PirB檢測，應(yīng)用引物見表2-3。對照組為攜帶PirA、PirB基因的副溶血弧菌。PCR反應(yīng)體系及程序參照HanADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Han</Author><Year>2015</Year><RecNum>24</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[78]</style></DisplayText><record><rec-number>24</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">24</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Han,J.E.</author><author>Tang,K.F.J.</author><author>Tran,L.H.</author><author>Lightner,D.V.</author></authors></contributors><titles><title>Photorhabdusinsect-related(Pir)toxin-likegenesinaplasmidofVibrioparahaemolyticus,thecausativeagentofacutehepatopancreaticnecrosisdisease(AHPND)ofshrimp</title><secondary-title>DiseasesofAquaticOrganisms</secondary-title></titles><periodical><full-title>DiseasesofAquaticOrganisms</full-title></periodical><pages>33-40</pages><volume>113</volume><number>1</number><dates><year>2015</year></dates><isbn>0177-5103 1616-1580</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.3354/dao02830</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[78]、DangtipADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Dangtip</Author><Year>2015</Year><RecNum>25</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[79]</style></DisplayText><record><rec-number>25</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">25</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Dangtip,Sirintip</author><author>Sirikharin,Ratchanok</author><author>Sanguanrut,Piyachat</author><author>Thitamadee,Siripong</author><author>Sritunyalucksana,Kallaya</author><author>Taengchaiyaphum,Suparat</author><author>Mavichak,Rapeepat</author><author>Proespraiwong,Porranee</author><author>Flegel,TimothyW.</author></authors></contributors><titles><title>AP4methodfortwo-tubenestedPCRdetectionofAHPNDisolatesofVibrioparahaemolyticus</title><secondary-title>AquacultureReports</secondary-title></titles><periodical><full-title>AquacultureReports</full-title></periodical><pages>158-162</pages><volume>2</volume><dates><year>2015</year></dates><isbn>23525134</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.aqrep.2015.10.002</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[79]。表2-3PirA、PirB基因檢測引物序列Tab.2PrimersetsusedindetectingPirA、PirBgene引物primerset引物序列(5’-3’)primersequence產(chǎn)物片段大小(bp)sizeofPCRproductVpPirA-284FTGACTATTCTCACGATTGGACTG284VpPirA-284RCACGACTAGCGCCATTGTTAVpPirB-392FTGATGAAGTGATGGGTGCTC392VpPirB-392RTGTAAGCGCCGTTTAACTCAAP4-F1ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC1269AP4-R1ACGATTTCGACGTTCCCCAAAP4-F2TTGAGAATACGGGACGTGGG230AP4-R2GTTAGTCATGTGAGCACCTTC1.2.7數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差（x±s，n=3）的方法來表示，運(yùn)用Excel2010和軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。1.3結(jié)果1.3.1養(yǎng)殖場1水質(zhì)調(diào)查養(yǎng)殖場1水中主要元素含量見表2-4，水中有害物質(zhì)含量見表2-5。表2-4鹽堿水主要元素含量檢測結(jié)果 Tab.2-4Thecontentofmainchemicalelementinsaline-alkalinewater水源watersource主要元素mainchemicalelementNa+Mg2+Ca2+K+Sr2+CI-SO42-Br-F-HCO3-salinitypH海水seawater7848.9943.5295.8290.75.114093.31975.749.01.02104.025.57.5養(yǎng)殖用水a(chǎn)quaculturewater6531.91209.76529.35196.064.8913306.31628.5651.760.22304.7025.57.4表2-5鹽堿水重金屬、揮發(fā)性酚和氰化物含量Tab.2-5Thecontentofheavymeatalion,volatilephenolandvolatilephenolinsaline-alkalinewater檢測指標(biāo)detectingparametersCu2+PbM+Ni2+Zn2+HgM+CrM+CdM+揮發(fā)性酚volatilephenol氰化物cyanide漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限量(mg/L)limitedbyWaterqualitystandardforfisheries0.010.050.050.10.00050.10.0050.0050.005養(yǎng)殖水(mg/L)aquaculturewater<0.006<0.07<0.007<0.004<0.00004<0.004<0.005//注：/表示沒有檢出；M+表示對應(yīng)元素的所有價(jià)態(tài)Notes:/meansnoresult;M+meansallvalence1.3.2弧菌數(shù)定量發(fā)病對蝦腸道、肝胰腺及水中的弧菌數(shù)均高于附近養(yǎng)殖場的正常蝦，腸道、肝胰腺及水中弧菌數(shù)的對數(shù)值分別高達(dá)7.31、5.76、4.89，均比正常蝦的弧菌數(shù)有明顯升高。對比結(jié)果如圖2-2所示。1.腸道;2.肝胰腺;3.水1.Intestine;2.Hepatopancreas;3.Water圖2-2對蝦腸道、肝胰腺及養(yǎng)殖池水弧菌數(shù)Fig.2-2Vibriocountsinshrimpintestines,hepatopancreasandwater1.3.3潛在細(xì)菌性病原的檢出情況從采集的對蝦、鮮活餌料及養(yǎng)殖池水中，共分離到細(xì)菌單菌落81個(gè)，對所分離的細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，共成功鑒定出菌株79株，分屬于18屬33種。其中，鑒定出的7種弧菌量占總菌量的40.86%，可疑病原菌中Vibrioalginolyticus和Vibrioowensii含量最高，分別占弧菌總量的39.66%、29.96%。購自海南的蝦苗中溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌為優(yōu)勢菌株，存在致病風(fēng)險(xiǎn)。采集樣品的細(xì)菌分離鑒定結(jié)果詳情見表2-6。表2-6采集樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Tab.2-6Identificationresultsofculturablebacteriaincollectedsamples屬名genus養(yǎng)殖場1bacteriaisolatedfrom1farm養(yǎng)殖場2bacteriaisolatedfrom2farm養(yǎng)殖場3bacteriaisolatedfrom3farm養(yǎng)殖場4bacteriaisolatedfromDfarm交替單胞菌屬AlteromonasA.macleodii科貝特氏菌CobetiaC.marina鹽單胞菌屬HalomonasH.alkaliphila、H.neptuniaH.alkaliphila咸海鮮球菌屬JeotgalicoccusJ.nanhaiensis乳球菌屬LactococcusL.garvieae微桿菌屬M(fèi)icrobacteriumM.flavescens海洋球型菌屬OceanisphaeraO.marina副球菌屬ParacoccusP.seriniphilusP.seriniphilusP.seriniphilus發(fā)光桿菌屬PhotobacteriumP.damselaeP.damselae羅威登斯菌屬ProvidenciaP.vermicola假交替單胞菌屬PseudoalteromonasP.spongiaeP.spongiae假魯杰氏菌屬PseudoruegeriaP.aquimaris嗜冷桿菌屬PsychrobacterP.alimentarius、P.celer、P.maritimus、P.namhaensisP.celer、P.faecalis、鹽水球菌屬SalinicoccusS.halodurans薩維奇菌屬SavageaS.faecisuis葡萄球菌屬StaphylococcusS.equorum、S.haemolyticusS.nepalensis、S.saprophyticus黃桿菌屬TenacibaculumT.lutimarisT.lutimarisT.lutimarisT.discolor、T.lutimaris弧菌屬VibrioV.alginolyticus、V.brasiliensis、V.harveyi、V.mediterranei、V.owensii、V.parahaemolyticusV.alginolyticus、V.mediterranei、V.owensiiV.alginolyticus、V.mediterranei、V.owensiiV.kanaloae、1.3.4對蝦主要病原檢出情況對采集的對蝦及飼料樣品分別進(jìn)行EHP蝦肝腸胞子蟲、VpAHPND細(xì)菌分子及WSSV、IHHNV、D1V1、CMNV4種病毒檢測。檢測結(jié)果如表2-7所示，各采樣點(diǎn)所取全部樣品均檢出CMNV，采樣點(diǎn)2和采樣點(diǎn)5的蝦中檢出EHP陽性，5個(gè)采樣點(diǎn)的樣品均檢出不同程度的DIV1感染，WSSV、IHHNV、AHPND均無檢出。表2-7樣品病原檢測結(jié)果Tab.2-7Pathogendetectionresultsofsamples采樣點(diǎn)samplingpoint樣品種類sampletype樣品來源samplesource病原pathogenWSSVEHPIHHNVDIV1AHPNDCMNV1健康蝦池1+池2+發(fā)病蝦池3+池4+-+鮮餌大鹵蟲++小鹵蟲++鹵蟲卵+蝦苗海南+2健康蝦池2-++-+-+發(fā)病蝦池3++-+鮮餌大鹵蟲+-++毛蝦++-+3發(fā)病蝦池1++-+4發(fā)病蝦池1+-++5生長緩慢蝦池1-+++注：*表示蝦苗；“-”表示陰性；“+”表示套式PCR僅有第二輪檢出陽性；“++”表示套式PCR一輪、二輪均為陽性Notes:*meansshrimplarvae;"-"meansnegative;"+"meansthatonlythesecondroundofnestedPCRispositive;"++"meansthatboththefirstandsecondroundsofnestedPCRarepositive1.3.5主要可疑細(xì)菌性病原的PirAB檢測7株可疑細(xì)菌性病原PirAB檢測結(jié)果如圖2-3所示，檢測結(jié)果均為陰性，表明7株可疑病原菌均不攜帶兩種毒力基因。1.4討論凡納濱對蝦是包括中國在內(nèi)的許多國家目前養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)上最重要的對蝦之一ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>FAO</Author><Year>2020</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[80]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>FAO</author></authors></contributors><titles><title>FisheryandAquacultureStatistics2018/FAOannuaire</title><secondary-title>Statistiquesdespêchesetdel'aquaculture2018/FAOanuario</secondary-title></titles><periodical><full-title>Statistiquesdespêchesetdel'aquaculture2018/FAOanuario</full-title></periodical><dates><year>2020</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[80]，凡納濱對蝦產(chǎn)業(yè)受到細(xì)菌或病毒引起的各種疾病的極大限制ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Vogeley</Author><Year>2019</Year><RecNum>11</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[81]</style></DisplayText><record><rec-number>11</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">11</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Vogeley,JoanaLyra</author><author>Interaminense,JulianaAguiar</author><author>Buarque,DiegoSouza</author><author>daSilva,SuziannyMariaBezerraCabral</author><author>Coimbra,MariaRaquelMoura</author><author>Peixoto,SílvioMaurano</author><author>Soares,RobertaBorda</author></authors></contributors><titles><title>GrowthandimmunegeneexpressionofLitopenaeusvannameifedBacillussubtilisandBacilluscirculanssupplementeddietsandchallengedwithVibrioparahaemolyticus</title><secondary-title>AquacultureInternational</secondary-title></titles><periodical><full-title>AquacultureInternational</full-title></periodical><pages>1451-1464</pages><volume>27</volume><number>5</number><dates><year>2019</year></dates><isbn>0967-6120 1573-143X</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1007/s10499-019-00399-x</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[81]。病害的發(fā)生是由環(huán)境因子、病原微生物和機(jī)體自身免疫力相互作用的結(jié)果。本文針對濰坊濱海開發(fā)區(qū)及壽光市室內(nèi)養(yǎng)殖凡納濱對蝦突發(fā)死亡開展了病原分子流行病學(xué)排查，研究結(jié)果顯示發(fā)病凡納濱對蝦存在EHP、DIV1、CMNV感染，來自海南的蝦苗樣品感染CMNV，細(xì)菌分離鑒定結(jié)果顯示海南蝦苗中溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌為優(yōu)勢菌，存在系統(tǒng)感染風(fēng)險(xiǎn)。鮮活餌料樣品中也存在DIV1、CMNV感染，對養(yǎng)殖場的對蝦養(yǎng)殖造成一定的影響。同時(shí)從發(fā)病對蝦體內(nèi)及養(yǎng)殖水體中分離出7種可疑病原菌，弧菌定量結(jié)果顯示，發(fā)病對蝦體內(nèi)及水中的弧菌數(shù)均高于正常蝦，表明當(dāng)前凡納濱對蝦的養(yǎng)殖面臨多種疾病風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本文的病原檢測及潛在細(xì)菌性病原的分析結(jié)果，結(jié)合發(fā)病癥狀，推測本次凡納濱對蝦出現(xiàn)突發(fā)性死亡的主要原因是弧菌感染所致，而EHP、DIV1、CMNV陽性感染可能會對對蝦的發(fā)病起到一定的協(xié)同致病作用。養(yǎng)殖用蝦苗攜帶致病原，表明對蝦育苗場的育苗關(guān)鍵環(huán)節(jié)有待病原的排查與風(fēng)險(xiǎn)管控。圖A為PirA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果;圖B為PirB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果;圖C為引物AP4-F1/R1PCR產(chǎn)物;圖D為引物AP4-F2/R2PCR產(chǎn)物;M.DL2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn);1-7.分別為菌株V.mediterranei、V.brasiliensis、V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus、V.owensii、P.damselae;N.陰性對照;P.陽性對照Fig.APCRproductsofgenePirA;Fig.BPCRproductsofgenePirB;Fig.CPCRproductsofprimerAP4-F1/R1;Fig.DPCRproductsofprimerAP4-F2/R2;M.DL2000DNAMarker;1-7.bacterialstrainsV.mediterranei、V.brasiliensis、V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus、V.owensiiandP.damselae;N.negativecontrol;P.positivecontrol圖2-3可疑細(xì)菌性病原PirA、PirB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2-3PCRproductsofgenePirAandPirBofsuspectedbacterialpathogensEHP最早在泰國的斑節(jié)對蝦中發(fā)現(xiàn)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sriurairatana;</Author><Year>2004</Year><RecNum>35</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[82]</style></DisplayText><record><rec-number>35</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">35</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">KanokpornChayaburakul</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">;</style><styleface="normal"font="default"size="100%">GaryNash;PhusitPratanpipat;SiripornSriurairatana;</style></author><author>BoonsirmWithyachumnarnkul</author></authors></contributors><titles><title>Multiplepathogensfoundingrowth-retardedblacktigershrimpPenaeusmonodoncultivated inThailand</title><secondary-title>DISEASESOFAQUATICORGANISMS </secondary-title></titles><pages>89-96</pages><volume>60</volume><dates><year>2004</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[82]，是近年來對對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響的疾病之一ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Thitamadee</Author><Year>2016</Year><RecNum>5</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[83]</style></DisplayText><record><rec-number>5</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="tp22fv2al552pmee52dvttwzs9wxt2zzvvev"timestamp="1644913977">5</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Thitamadee,Siripong</author><author>Prachumwat,Anuphap</author><author>Srisala,Jiraporn</author><author>Jaroenlak,Pattana</author><author>Salachan,PaulVinu</author><author>Sritunyalucksana,Kallaya</author><author>Flegel,TimothyW.</author><author>Itsathitphaisarn,Ornchuma</author></authors></contributors><titles><title>ReviewofcurrentdiseasethreatsforcultivatedpenaeidshrimpinAsia</title><secondary-title>Aquaculture</secondary-title></titles><periodical><full-title>Aquaculture</full-title></periodical><pages>69-87</pages><volume>452</volume><section>69</section><dates><year>2016</year></dates><isbn>00448486</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.aquaculture.2015.10.028</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[83]。有研究表明，EHP的致病率不高，但會導(dǎo)致對蝦生長緩慢ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[30,84]。CMNV是于2014年在我國首次報(bào)道的一種新的RNA病毒，可引起對蝦偷死病。CMNV在主要對蝦養(yǎng)殖地區(qū)的廣泛流行，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。感染CMNV后，凡納濱對蝦發(fā)病較為緩慢，伴隨著整個(gè)養(yǎng)殖周期。患病對蝦表現(xiàn)為甲殼變軟，肝胰腺萎縮且顏色變淡，部分腹節(jié)肌肉發(fā)白，患病對蝦個(gè)體間體長存在大小不均的現(xiàn)象。觀察本文發(fā)病的凡納濱對蝦外觀癥狀，發(fā)現(xiàn)與感染該病的凡納濱對蝦癥狀存在差異，表明CMNV感染并非是本次凡納濱對蝦突發(fā)性死亡的主要原因ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Zhang</Author><Year>2014</Year><RecNum>6</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>6</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645087392">6</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Zhang,Q.</author><author>Liu,Q.</author><author>Liu,S.</author><author>Yang,H.</author><author>Liu,S.</author><author>Zhu,L.</author><author>Yang,B.</author><author>Jin,J.</author><author>Ding,L.</author><author>Wang,X.%JJournalofGeneralVirology</author></authors></contributors><titles><title>Anewnodavirusisassociatedwithcovertmortalitydiseaseofshrimp</title></titles><pages>2700-2709</pages><volume>95</volume><number>Pt_12</number><dates><year>2014</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[3]。DIV1是一種新發(fā)疫病，能夠?qū)е聦ξr的高死亡率。2014年，Qiu等人從浙江某對蝦養(yǎng)殖場采集患病凡納濱對蝦，通過研究對比，確認(rèn)該病是由未知的新虹彩病毒引起的，并于2017年暫時(shí)將其命名為蝦血細(xì)胞虹彩病ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>邱亮；陳蒙蒙；萬曉媛；李晨</Author><Year>2017</Year><RecNum>37</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[85]</style></DisplayText><record><rec-number>37</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255i