第三章——基因工程新人教版高中生物選擇性必修3第2節(jié)基因工程的基本操作程序第1課時步驟一、二一條小蟲引發(fā)的科技大戰(zhàn)

—中國農(nóng)科院棉花研究所開發(fā)抗蟲棉紀(jì)實思考問題：1.你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？2.培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟呢？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉

（有抗蟲特性）導(dǎo)入抗蟲基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定(1)概念：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。(2)實例：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。1、目的基因資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因那么，如何篩選目的基因呢？篩選方法從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選已知結(jié)構(gòu)科學(xué)家掌握了Bt基因的序列信息功能清晰Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才表現(xiàn)出毒性，對人和牲畜無影響2、目的基因的篩選2、目的基因的篩選測序技術(shù)測定核酸和蛋白質(zhì)序列序列數(shù)據(jù)庫以堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內(nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫序列比對工具把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的工具。通過比對識別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能利用測序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對比工具（如BLAST）等，找到合適的目的基因3、目的基因的獲取從基因文庫中獲取基因組文庫

含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體cDNA文庫

含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體cDNA：先由mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下獲得單鏈DNA，再利用DNA聚合酶，將單鏈DNA復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈DNA，即為cDNA。概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。3、目的基因的獲取人工合成法在已知目的基因核苷酸序列且基因較小的情況下，利用DNA合成儀自動合成化學(xué)方法直接人工合成3、目的基因的獲取90℃高溫

DNA在體外90℃高溫時變性會變成單鏈50℃低溫

引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合72℃適溫

DNA聚合酶在最適反應(yīng)溫度，沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈反應(yīng)原理

DNA半保留復(fù)制反應(yīng)條件

緩沖液、DNA模板、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物利用PCR擴增目的基因閱讀P77，獲取PCR的定義、條件、大致過程。耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（DNTP）引物待擴增的DNA片段（模板）5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。思考：1.PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較？PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原則原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子思考：

2.PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中

分離出目的基因？3.需要引物的原因？答：DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。瓊脂糖凝膠電泳

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。思考：4、如何對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？1.下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，錯誤的是A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現(xiàn)解旋C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量D.二者遵循的堿基互補配對原則相同√2.(2022·天津一中高二期中)下圖表示利用PCR技術(shù)擴增目的基因的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列敘述錯誤的是A.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B.在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段C.引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補配對，則不能有效擴增目的基因D.從理論上推測，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/4√DNA片段基因1

基因2

基因3放大終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子原核基因知識補充基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶識別和結(jié)合位點結(jié)束轉(zhuǎn)錄mRNA蛋白質(zhì)翻譯思考：如果直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，可能會出現(xiàn)什么樣的結(jié)果？

如何避免該結(jié)果的發(fā)生呢？游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，且游離的DNA片段不能穩(wěn)定遺傳。確保基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。1、目的：---基因工程的核心思考：要使Bt基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并能夠表達(dá)

和發(fā)揮作用，載體還需要哪些結(jié)構(gòu)？2、基因表達(dá)載體的組成思考：要各個元件有什么作用？---基因工程的核心目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀啟動子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復(fù)制原點：DNA復(fù)制的起始位點終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定。項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)_________________________位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比小組活動：請文字和箭頭表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程？載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種問題：該過程需要用到哪些工具酶？3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程使用一種限制酶進(jìn)行切割Bt基因和pBI121質(zhì)粒，共有幾種連接情況？請大家嘗試用膠帶模擬DNA連接酶進(jìn)行操作。探究?活動載體與目的基因反向連接載體與目的基因正向連接目的基因與目的基因之間的連接目的基因自身環(huán)化載體自身環(huán)化載體與載體之間的連接載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1問題探討選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割-G-CTTAA-A-TCTAG-G-CTTAA如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？3.(2022·天津濱海新區(qū)高二期末)下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述，錯誤的是A.啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點，組成它的基本單位是脫氧核

苷酸B.基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動子、終止密碼子、標(biāo)記基因

等組件C.人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可激活或抑制目的基因

的表達(dá)D.由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別√4.用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴增，設(shè)計了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶識別序列。擴增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的（）C解析利用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段擴增時，當(dāng)引物與母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，子鏈延伸總是從5′端到3′端。據(jù)此依題意和圖示分析可知，擴增后得到的絕大部分DNA片段如圖D所示。√5.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述不正確的是A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，可用PstⅠ和HindⅢ

切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環(huán)化和反

向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長√圖解限制酶的選擇原