信立方質(zhì)譜培訓(xùn)中心課程導(dǎo)航課程目錄01質(zhì)譜基礎(chǔ)原理離子化技術(shù)、質(zhì)量分析器工作機(jī)制02儀器組成與工作流程系統(tǒng)啟動、灌注操作及進(jìn)樣準(zhǔn)備03質(zhì)譜軟件操作Masslynx項目管理與方法編輯04方法開發(fā)與優(yōu)化參數(shù)調(diào)節(jié)、定量方法建立技巧05數(shù)據(jù)采集與處理色譜圖解析、質(zhì)量控制要點06應(yīng)用案例分享藥物代謝、食品安全、臨床檢測07維護(hù)與故障排查日常維護(hù)、常見問題解決方案質(zhì)譜前沿技術(shù)第一章質(zhì)譜基礎(chǔ)原理質(zhì)譜分析是現(xiàn)代分析化學(xué)的核心技術(shù)之一。通過將樣品分子離子化并測定其質(zhì)荷比,我們可以獲得分子結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量等關(guān)鍵信息。本章將深入探討質(zhì)譜技術(shù)的基本原理和核心概念?；A(chǔ)概念質(zhì)譜分析法簡介質(zhì)譜分析技術(shù)通過離子化分子,精確測定質(zhì)荷比(m/z),從而獲得分子的質(zhì)量信息。該技術(shù)能夠生成分子離子及碎片離子,為揭示分子結(jié)構(gòu)提供關(guān)鍵線索。高靈敏度可檢測痕量級別樣品,最低可達(dá)飛克級(fg)快速分析單次分析通常在數(shù)分鐘內(nèi)完成,適合高通量篩查廣泛應(yīng)用涵蓋藥物、環(huán)境、食品、臨床等多個領(lǐng)域質(zhì)譜儀的核心組成質(zhì)譜儀由四個關(guān)鍵系統(tǒng)組成,每個系統(tǒng)在分析過程中扮演著不可或缺的角色。從樣品引入到最終信號檢測,各部件協(xié)同工作,確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。進(jìn)樣系統(tǒng)氣相色譜、液相色譜或直接進(jìn)樣方式,根據(jù)樣品性質(zhì)選擇離子源EI、CI、ESI、APCI、MALDI等多種離子化技術(shù)質(zhì)量分析器四極桿、飛行時間、離子阱等不同類型分析器檢測器電子倍增器或法拉第杯將離子信號轉(zhuǎn)換為電信號離子化方式詳解離子化是質(zhì)譜分析的第一步,不同的離子化技術(shù)適用于不同類型的樣品。選擇合適的離子化方式是獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。電子轟擊(EI)硬電離技術(shù),能量約70eV產(chǎn)生豐富的碎片信息適合小分子揮發(fā)性樣品譜圖庫檢索標(biāo)準(zhǔn)方法電噴霧(ESI)軟電離技術(shù),保留分子離子適合極性和大分子樣品可與液相色譜聯(lián)用廣泛用于生物大分子分析大氣壓化學(xué)電離(APCI)適合中等極性樣品離子化效率高抗基質(zhì)干擾能力強常用于藥物代謝研究激光解吸(MALDI)適合高分子量生物樣品蛋白質(zhì)、多肽分析首選基質(zhì)輔助電離質(zhì)量范圍可達(dá)數(shù)十萬道爾頓質(zhì)量分析器工作原理1四極桿分析器通過射頻(RF)和直流(DC)電壓的組合,只允許特定質(zhì)荷比的離子通過。四根平行桿狀電極產(chǎn)生振蕩電場,實現(xiàn)質(zhì)量篩選。2飛行時間(TOF)基于離子在無場漂移區(qū)的飛行時間與質(zhì)量平方根成正比的原理。質(zhì)量越大,飛行時間越長,分辨率可達(dá)數(shù)萬。3離子阱分析器在三維或二維電場中捕獲離子,可進(jìn)行多級質(zhì)譜(MSn)分析,特別適合復(fù)雜分子的結(jié)構(gòu)解析和碎片研究。第二章儀器組成與操作流程掌握儀器的正確操作流程是獲得可靠數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。本章將詳細(xì)介紹信立方質(zhì)譜儀的啟動、灌注、進(jìn)樣等關(guān)鍵操作步驟,幫助您建立規(guī)范的實驗操作習(xí)慣。儀器型號信立方質(zhì)譜儀主要型號介紹HCLASS/QDa四極桿質(zhì)譜系統(tǒng),結(jié)構(gòu)緊湊,操作簡便,適合常規(guī)定性定量分析。質(zhì)量范圍20-1250Da,靈敏度優(yōu)異,是入門級用戶的理想選擇。TripleQuad三重四極桿質(zhì)譜,定量分析金標(biāo)準(zhǔn)。具有母離子掃描、子離子掃描、中性丟失掃描等多種掃描模式,靈敏度和選擇性極高。QTOF高分辨四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜,兼具高分辨率和高質(zhì)量精度。分辨率可達(dá)40000以上,質(zhì)量精度小于2ppm,適合未知物鑒定和結(jié)構(gòu)解析。儀器啟動與系統(tǒng)灌注正確的啟動和灌注流程是保證儀器穩(wěn)定運行的前提。系統(tǒng)灌注不僅能排除管路中的氣泡,還能確保流動相成分均勻,避免基線漂移和重復(fù)性差的問題。流動相準(zhǔn)備使用HPLC級或質(zhì)譜級溶劑,通過0.22μm濾膜過濾,超聲脫氣15-30分鐘。檢查溶劑瓶液位,確保充足。四元泵灌注在MSConsole中選擇Purge功能,設(shè)置流速5-10mL/min,灌注每個通道3-5分鐘,觀察壓力穩(wěn)定后停止。自動進(jìn)樣器灌注灌注進(jìn)樣針和定量環(huán),使用洗針液和樣品溶劑分別灌注,確保無氣泡殘留。檢查廢液瓶容量,及時清空。系統(tǒng)檢查啟動數(shù)據(jù)采集,觀察基線穩(wěn)定性和噪聲水平。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品測試,確認(rèn)靈敏度和峰形正常后方可進(jìn)行樣品分析。進(jìn)樣前準(zhǔn)備流程1樣品預(yù)處理根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適的前處理方法。液體樣品需離心(10000-13000rpm,5-10分鐘),去除顆粒物。固體樣品需適當(dāng)稀釋或溶解。2樣品過濾使用0.22μm針頭濾器或離心濾管過濾樣品,防止顆粒堵塞管路和色譜柱。生物樣品建議使用蛋白沉淀或固相萃取進(jìn)一步凈化。3流動相配制精確稱量或量取溶劑,按比例混合。添加酸、堿或緩沖鹽時需充分混勻。流動相應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,避免長時間放置導(dǎo)致變質(zhì)。4儀器狀態(tài)檢查檢查泵壓是否正常(通常50-200bar),柱溫穩(wěn)定,檢測器響應(yīng)正常。運行空白樣品,確認(rèn)無記憶效應(yīng)和污染峰。重要提示:所有與樣品接觸的器皿應(yīng)使用質(zhì)譜級或HPLC級溶劑清洗,避免污染影響分析結(jié)果。樣品應(yīng)在4℃保存,分析前恢復(fù)至室溫。儀器操作界面介紹Masslynx主界面軟件核心控制中心,包含項目管理、方法編輯、數(shù)據(jù)采集和處理等功能模塊。左側(cè)為項目瀏覽器,中間為方法編輯區(qū),右側(cè)為實時監(jiān)控窗口。MSConsole控制面板實時監(jiān)控儀器狀態(tài),包括真空度、溫度、電壓等參數(shù)?？蛇M(jìn)行離子源清洗、泵灌注、自動進(jìn)樣器初始化等維護(hù)操作。液相方法編輯器設(shè)置流動相梯度、流速、柱溫等色譜參數(shù)。支持多通道泵控制,可編輯復(fù)雜的梯度程序。包含自動進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)置功能。第三章質(zhì)譜軟件操作Masslynx是Waters公司開發(fā)的專業(yè)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和處理軟件,功能強大且用戶友好。本章將系統(tǒng)介紹軟件的核心功能,包括項目管理、方法編輯、數(shù)據(jù)采集等關(guān)鍵操作。軟件操作Masslynx軟件項目管理良好的項目管理習(xí)慣能夠提高工作效率,避免數(shù)據(jù)丟失和混淆。建議為每個實驗或課題建立獨立的項目文件夾,并采用清晰的命名規(guī)則。1新建項目在Masslynx主界面選擇File→NewProject,輸入項目名稱,選擇保存路徑。建議使用日期+項目名格式,如"20240115_藥物代謝研究"。2模板選擇根據(jù)分析類型選擇合適的項目模板(定性、定量、MSE等)。模板包含預(yù)設(shè)的方法和處理流程,可大幅提高效率。3樣品列表管理在SampleList中添加樣品信息,包括樣品名、進(jìn)樣體積、位置等。支持Excel導(dǎo)入,批量添加樣品。4數(shù)據(jù)備份定期將項目文件夾備份至外部存儲設(shè)備或服務(wù)器。Masslynx數(shù)據(jù)包含原始數(shù)據(jù)(.raw)和處理結(jié)果,文件較大需注意存儲空間。質(zhì)譜方法編輯SIR方法建立選擇離子記錄(SIR)模式適用于已知化合物的定量分析,具有高靈敏度和選擇性。打開MSMethodEditor在主界面選擇MSMethod→New,選擇儀器類型(QDa/TQD/QTOF等)設(shè)置掃描模式選擇SIR模式,輸入目標(biāo)離子的m/z值,設(shè)置Dwell時間(通常0.1-0.5秒)優(yōu)化參數(shù)調(diào)節(jié)錐孔電壓(ConeVoltage)15-50V,采樣頻率10Hz,根據(jù)化合物性質(zhì)優(yōu)化保存方法命名方法文件,建議包含化合物名稱和電離模式,如"Caffeine_ESI_Pos.exp"參數(shù)優(yōu)化技巧:錐孔電壓影響離子傳輸效率和碎片化程度。較低電壓保留分子離子,較高電壓產(chǎn)生碎片。建議通過進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行優(yōu)化。液相方法編輯液相色譜條件的設(shè)置直接影響分離效果和分析時間。合理的梯度程序能夠提高峰容量,改善峰形,縮短分析周期。流動相設(shè)置定義A、B、C、D四個通道的流動相組成。常見配置:A為水+0.1%甲酸,B為乙腈或甲醇+0.1%甲酸。確保流動相與質(zhì)譜兼容,避免使用不揮發(fā)性鹽。梯度程序編輯在GradientTable中輸入時間和各通道比例。初始條件通常為高水相比例,逐步增加有機(jī)相比例實現(xiàn)梯度洗脫。包含平衡時間(3-5倍柱體積)確保重復(fù)性。溫度控制柱溫箱溫度通常設(shè)置為25-40℃,提高柱效和重復(fù)性。樣品室溫度建議設(shè)為4-10℃,防止生物樣品降解。部分化合物需要特定溫度條件優(yōu)化分離。進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)置進(jìn)樣體積(通常1-20μL)、洗針液組成、洗針次數(shù)等。StrongWash用于清洗外壁,WeakWash用于清洗內(nèi)壁,減少交叉污染和記憶效應(yīng)。數(shù)據(jù)采集流程1方法加載在SampleList中為每個樣品指定對應(yīng)的MS方法和LC方法,檢查方法兼容性2系統(tǒng)平衡運行空白進(jìn)樣,確認(rèn)基線穩(wěn)定,壓力正常,無干擾峰3采集啟動點擊RunQueue開始批量采集,軟件自動按序列表順序進(jìn)樣分析4實時監(jiān)控觀察TIC(總離子流色譜圖)和質(zhì)譜圖,及時發(fā)現(xiàn)異常情況5數(shù)據(jù)保存采集完成后數(shù)據(jù)自動保存為.raw格式,包含完整的質(zhì)譜和色譜信息第四章方法開發(fā)與優(yōu)化方法開發(fā)是質(zhì)譜分析的核心環(huán)節(jié),需要綜合考慮靈敏度、選擇性、重復(fù)性等多個因素。本章將介紹從化合物信息收集到參數(shù)優(yōu)化的完整流程,幫助您建立穩(wěn)健可靠的分析方法。分子量計算化合物分子量計算準(zhǔn)確計算化合物的分子量是建立質(zhì)譜方法的第一步。需要區(qū)分單同位素質(zhì)量和平均質(zhì)量,并考慮離子化過程中質(zhì)子或其他加合物的影響。單同位素質(zhì)量使用最豐富的同位素計算,如12C、1H、16O。高分辨質(zhì)譜使用此數(shù)值,精度可達(dá)小數(shù)點后4-5位。平均分子量考慮所有天然同位素的豐度加權(quán)平均值。單位分辨質(zhì)譜通常使用此數(shù)值,與化學(xué)式量接近。離子化模式選擇ESI正離子模式常見[M+H]?、[M+Na]?、[M+NH?]?;負(fù)離子模式常見[M-H]?、[M+COOH]?。需在m/z計算時加減相應(yīng)質(zhì)量。Masslynx軟件內(nèi)置分子量計算器(Tools→MolecularWeightCalculator),輸入分子式即可快速計算各種離子形式的m/z值,并顯示同位素分布模式。定量方法建立(Quanlynx)Quanlynx是Masslynx的定量分析模塊,支持內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等多種定量策略。建立定量方法需要準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品,繪制工作曲線,并驗證方法的線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度。新建定量方法打開Quanlynx,選擇NewQuantitationMethod,選擇對應(yīng)的MS方法文件。定義分析類型(藥物分析、環(huán)境分析等)和數(shù)據(jù)處理算法。添加化合物在CompoundList中添加目標(biāo)化合物,輸入化合物名稱、分子式、定量離子m/z值。如使用內(nèi)標(biāo)法,需同時添加內(nèi)標(biāo)化合物及其m/z值。設(shè)置工作曲線定義標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍,通常6-8個濃度點,覆蓋預(yù)期樣品濃度。選擇曲線類型(線性、二次、對數(shù)等)和權(quán)重因子(1/x、1/x2等)。數(shù)據(jù)處理參數(shù)設(shè)置積分參數(shù)、峰識別閾值、保留時間窗口等。定義濃度單位(ng/mL、μg/L等)和結(jié)果報告格式。保存方法并進(jìn)行驗證實驗。方法優(yōu)化技巧錐孔電壓優(yōu)化錐孔電壓(ConeVoltage)是影響靈敏度的關(guān)鍵參數(shù)。通過進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品,在10-80V范圍內(nèi)逐步增加電壓,繪制響應(yīng)-電壓曲線,選擇響應(yīng)最強且碎片化適中的電壓值。通常小分子最優(yōu)值在20-40V,大分子在40-60V。采樣頻率與信噪比采樣頻率(SamplingFrequency)影響數(shù)據(jù)點密度和信噪比。高頻率(20Hz)提供更多數(shù)據(jù)點,峰形更平滑,但會降低靈敏度。低頻率(5Hz)提高靈敏度,但可能導(dǎo)致峰形失真。建議根據(jù)峰寬選擇:窄峰用高頻,寬峰用低頻。梯度優(yōu)化策略初始梯度設(shè)置較緩,觀察目標(biāo)化合物的洗脫位置。調(diào)整梯度斜率,使相鄰峰分離度>1.5。對于早洗脫化合物,可延長等度洗脫時間;對于晚洗脫化合物,加快梯度速率。最終在15-20分鐘內(nèi)完成分析為宜。第五章數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析數(shù)據(jù)處理是將原始信號轉(zhuǎn)化為有意義結(jié)果的關(guān)鍵步驟。本章將介紹色譜圖和質(zhì)譜圖的解析技巧、分子式擬合方法以及質(zhì)量控制要點,幫助您從復(fù)雜數(shù)據(jù)中提取準(zhǔn)確可靠的信息。色譜圖與質(zhì)譜圖解析峰識別與積分在TIC或EIC中識別目標(biāo)化合物峰,檢查峰形是否對稱,有無肩峰或拖尾。手動或自動設(shè)置積分基線,確保峰面積準(zhǔn)確。對于共洗脫峰,使用質(zhì)譜選擇性提取離子色譜圖(EIC)進(jìn)行區(qū)分。多通道數(shù)據(jù)對比同時查看TIC、UV檢測器信號和質(zhì)譜圖,驗證峰的歸屬。比較不同m/z通道的信號強度和保留時間,判斷是否存在共洗脫或離子抑制現(xiàn)象。利用DAD光譜輔助定性。質(zhì)譜圖解讀基礎(chǔ)觀察分子離子峰[M+H]?或[M-H]?,確認(rèn)分子量。分析碎片離子,推斷可能的斷裂位置。注意同位素峰簇,Cl、Br等元素有特征的同位素模式。高電壓下碎片豐富,有助于結(jié)構(gòu)確認(rèn)。分子式擬合與結(jié)構(gòu)推斷高分辨質(zhì)譜能夠提供精確質(zhì)量數(shù)據(jù),通過與理論值比對,可以推斷未知化合物的分子式。結(jié)合碎片離子信息和數(shù)據(jù)庫檢索,能夠進(jìn)一步確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu)。精確質(zhì)量測定使用高分辨質(zhì)譜(QTOF)測定分子離子的精確m/z值,質(zhì)量誤差通常<5ppm。校正質(zhì)量后,輸入元素組成范圍(C、H、N、O等)。分子式擬合利用Masslynx的ElementalComposition功能,根據(jù)精確質(zhì)量和同位素分布模式,自動生成可能的分子式列表,按得分排序。不飽和度計算計算不飽和度(RDB或DegreeofUnsaturation),推斷環(huán)或雙鍵數(shù)量。RDB=(2C+2+N-H-X)/2,其中C、H、N、X為各元素數(shù)目。氮規(guī)則驗證氮規(guī)則:含偶數(shù)個N原子的化合物,分子離子為偶數(shù)m/z;含奇數(shù)個N,分子離子為奇數(shù)m/z。利用此規(guī)則排除不合理的分子式。碎片離子輔助分析MS/MS碎片,推斷官能團(tuán)位置和連接方式。常見碎片:丟失H?O(18)、CO?(44)、CH?(15)等。對比標(biāo)準(zhǔn)品或數(shù)據(jù)庫譜圖。質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量控制質(zhì)量校正定期使用校正液(如PEG、亮氨酸腦啡肽)進(jìn)行質(zhì)量校正,確保質(zhì)量準(zhǔn)確度。高分辨質(zhì)譜建議每天校正,單位分辨質(zhì)譜每周校正。校正后質(zhì)量偏差應(yīng)<0.1Da(單位分辨)或<5ppm(高分辨)。記錄校正結(jié)果,作為質(zhì)量控制檔案。背景噪聲控制運行溶劑空白,檢查基線噪聲水平。理想基線應(yīng)平直,噪聲<1000counts。如噪聲過高,檢查流動相純度、管路污染、離子源清潔度。鑒別干擾峰來源:系統(tǒng)峰(固定m/z和保留時間)、污染峰(不規(guī)則出現(xiàn))、樣品基質(zhì)峰。重復(fù)性驗證定期進(jìn)樣質(zhì)控樣品(QC),監(jiān)控方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。保留時間RSD應(yīng)<1%,峰面積RSD應(yīng)<10%(定量分析)或<15%(定性分析)。繪制質(zhì)控圖(Levey-Jennings圖),及時發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)偏移。建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP),確保不同操作人員和不同時間的結(jié)果一致性。第六章應(yīng)用案例分享質(zhì)譜技術(shù)在藥物研發(fā)、食品安全、臨床診斷等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。通過實際案例的分享,我們將展示如何將理論知識轉(zhuǎn)化為解決實際問題的能力,體會質(zhì)譜技術(shù)的強大功能和應(yīng)用價值。藥物分析藥物代謝物分析實例研究背景藥物代謝研究是新藥開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定代謝產(chǎn)物,了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化途徑,評估藥物安全性和有效性。分析策略樣品制備收集給藥后不同時間點的血漿或尿液樣品,使用液-液萃取或SPE凈化,去除內(nèi)源性干擾物質(zhì)。UHPLC-QTOF分析使用C18色譜柱分離,梯度洗脫。QTOF采集全掃描+ddMS2模式,保留時間窗口觸發(fā)二級質(zhì)譜。代謝物識別利用MetaboLynx軟件進(jìn)行代謝物自動檢索,基于精確質(zhì)量、同位素模式、MS/MS碎片,鑒定氧化、還原、水解、結(jié)合等代謝產(chǎn)物。典型代謝反應(yīng)識別I相反應(yīng):羥基化(+16Da)、脫烷基(-14/-28Da)、還原(-2Da)。II相反應(yīng):葡萄糖醛酸化(+176Da)、硫酸化(+80Da)、谷胱甘肽結(jié)合(+305Da)。通過中性丟失掃描或前體離子掃描快速篩查特定類型代謝物。食品安全檢測案例質(zhì)譜技術(shù)在食品安全監(jiān)管中發(fā)揮著不可替代的作用,能夠快速篩查和精確定量農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、非法添加物等有害物質(zhì),保障公眾健康。農(nóng)藥殘留多組分檢測使用QuEChERS方法提取,LC-MS/MS檢測數(shù)百種農(nóng)藥。三重四極桿MRM模式,每種化合物監(jiān)測2對離子對,定性+定量。檢出限可達(dá)μg/kg級,滿足國標(biāo)要求。建立數(shù)據(jù)庫,自動比對保留時間和離子比,提高篩查效率。獸藥殘留監(jiān)控針對畜禽產(chǎn)品中抗生素、激素類藥物的檢測。樣品經(jīng)酸化提取、固相萃取凈化,LC-MS/MS分析。重點監(jiān)測磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類等禁用或限用獸藥。定期參加實驗室間比對和盲樣考核,確保數(shù)據(jù)可靠。非法添加物快速篩查建立"黑名單"化合物數(shù)據(jù)庫,涵蓋瘦肉精、蘇丹紅、三聚氰胺等非法添加物。采用高分辨質(zhì)譜Non-target篩查模式,無需