ICS67.120.10B43DB12Thetechnicalstandardforclean2014-08-04發(fā)布2014-09-01實(shí)施天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)IDB12/T527—2014本標(biāo)準(zhǔn)的編寫符合GB/T1.1-2009的要求。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉建文、任景江、徐繼鵬、王志成、孫濤、李潔、劉瑩、曹建新。DB12/T527—20141奶牛結(jié)核病凈化技術(shù)規(guī)范本規(guī)范規(guī)定了奶牛結(jié)核病凈化的術(shù)語和定義、檢測(cè)方法、凈化措施、凈化群（場(chǎng)）的認(rèn)定、凈化群（場(chǎng)）的維持。本規(guī)范適用于從事奶牛飼養(yǎng)的單位和個(gè)人。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB16548-2006病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GB/T18645-2002動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)業(yè)部，農(nóng)醫(yī)發(fā)［2007］12號(hào)）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1牛結(jié)核病BovineTuberculosis（BTB）牛結(jié)核?。˙ovineTuberculosis,BTB）是由牛分枝桿菌（Mycobacteriumbovis）引起的一種人獸共患的慢性傳染病。3.2凈化Cleaning對(duì)某病發(fā)病地區(qū)采取一系列措施，達(dá)到消滅和清除傳染源的目標(biāo)。3.3變態(tài)反應(yīng)AllergyReaction變態(tài)反應(yīng)也叫超敏反應(yīng)，是指機(jī)體對(duì)某些抗原初次應(yīng)答后，再次接受相同抗原刺激時(shí)，發(fā)生的一種以機(jī)體生理功能紊亂或組織細(xì)胞損傷為主的特異性免疫應(yīng)答。3.4DB12/T527—20142γ-干擾素是指主要由淋巴細(xì)胞（如自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、CD4Th1和CD8T淋巴細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞）分泌的促炎性細(xì)胞因子。4檢測(cè)方法、4.1牛型結(jié)核分枝桿菌PPD（提純蛋白衍生物）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（即牛提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)）按GB/T18645-2002規(guī)定操作。4.2γ-干擾素ELISA試驗(yàn)作為牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)（見附錄A）。5凈化措施5.1檢測(cè)5.1.1成年牛每年春秋兩季各進(jìn)行一次檢測(cè)。5.1.2對(duì)奶牛群（場(chǎng)）存欄奶牛按100%比例進(jìn)行檢測(cè)。5.1.3初生犢牛應(yīng)于20日齡時(shí)進(jìn)行第一次檢測(cè)，100～120日齡時(shí)，進(jìn)行第二次檢測(cè)。5.1.4檢測(cè)時(shí)，首先用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。5.1.5凡牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性或疑似反應(yīng)者，應(yīng)3d后進(jìn)行γ-干擾素ELISA試驗(yàn)檢測(cè)，如γ-干擾素ELISA試驗(yàn)為陽性，按照本規(guī)范5.3規(guī)定處理；如為陰性，間隔3個(gè)月進(jìn)行復(fù)檢。5.1.6連續(xù)兩次檢測(cè)均為陰性者視為陰性牛。5.2隔離牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和γ-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果陽性或可疑牛須與受威脅的同群牛隔離，隔離場(chǎng)地周圍應(yīng)有自然屏障或人工柵欄。5.3陽性牛的處理5.3.1撲殺對(duì)確認(rèn)的結(jié)核病陽性牛全部撲殺。5.3.2無害化處理撲殺的結(jié)核病陽性牛，應(yīng)按照GB16548-2006進(jìn)行無害化處理。5.4消毒5.4.1緊急消毒奶牛群中檢出并剔出結(jié)核病陽性牛后，對(duì)污染的場(chǎng)所、用具、物品進(jìn)行嚴(yán)格消毒。飼養(yǎng)場(chǎng)的金屬設(shè)施、設(shè)備采取火焰、熏蒸等方式消毒；飼養(yǎng)場(chǎng)的圈舍、場(chǎng)地、車輛等，可選用2%燒堿等有效消毒藥消毒；飼養(yǎng)場(chǎng)的飼料、墊料可采取深埋發(fā)酵處理或焚燒處理；糞便采取堆積密封發(fā)酵方式，以及其他相應(yīng)的有效消毒方式。5.4.2日常消毒飼養(yǎng)場(chǎng)及牛舍出入口處，應(yīng)設(shè)置消毒池，內(nèi)置有效消毒劑，如3%～5%來蘇兒溶液或20％石灰乳等。消毒藥要定期更換，以保證一定的藥效。牛舍內(nèi)的一切用具應(yīng)定期消毒；產(chǎn)房每周進(jìn)行一次大消毒，分娩室在臨產(chǎn)牛生產(chǎn)前及分娩后各進(jìn)行一次消毒。5.5引種DB12/T527—201435.5.1異地調(diào)運(yùn)的奶牛，必須來自于非疫區(qū)，應(yīng)當(dāng)符合農(nóng)業(yè)部規(guī)定的健康標(biāo)準(zhǔn)。5.5.2跨省、自治區(qū)、直轄市引進(jìn)奶牛及其胚胎和精液，應(yīng)按《跨省調(diào)運(yùn)乳用種用動(dòng)物產(chǎn)地檢疫規(guī)程》向輸入地動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)申請(qǐng)辦理審批手續(xù)。5.5.3檢疫合格的奶牛經(jīng)市人民政府指定通道進(jìn)入，運(yùn)輸工具應(yīng)接受防疫消毒。調(diào)入后應(yīng)按農(nóng)業(yè)部《動(dòng)物檢疫管理辦法》相關(guān)規(guī)定隔離飼養(yǎng)30d，經(jīng)隔離檢疫合格的方可混群飼養(yǎng)。5.5.4進(jìn)口奶牛及其胚胎和精液，按照《進(jìn)境動(dòng)植物檢疫審批管理辦法》須向國(guó)家質(zhì)檢總局提出申請(qǐng)，辦理審批手續(xù)，經(jīng)檢疫合格入境后，需隔離45d，經(jīng)檢疫合格方能入關(guān)。5.6從業(yè)人員從事奶牛飼養(yǎng)和管理的人員每年要進(jìn)行健康檢查，發(fā)現(xiàn)患有結(jié)核病的應(yīng)調(diào)離崗位。6凈化群（場(chǎng)）的認(rèn)定奶牛群（場(chǎng)）同時(shí)滿足以下要求，認(rèn)定為達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。6.1連續(xù)2年以上無臨床病例。6.2按本規(guī)范5.1的規(guī)定連續(xù)2次以上全群檢測(cè)結(jié)果均為陰性。6.3引進(jìn)奶牛及其胚胎和精液的，符合本規(guī)范5.5的規(guī)定。7凈化群（場(chǎng)）的維持7.1達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)的奶牛群（場(chǎng)）每年進(jìn)行檢測(cè)。7.2發(fā)現(xiàn)陽性牛按照本規(guī)范5.3規(guī)定處理，同群牛按本規(guī)范5.1.2要求檢測(cè)。7.3按本規(guī)范5.5規(guī)定對(duì)異地調(diào)運(yùn)奶牛進(jìn)行檢疫。7.4按本規(guī)范5.4.2規(guī)定做好日常消毒。7.5按本規(guī)范5.6規(guī)定做好從業(yè)人員管理工作。DB12/T527—20144（資料性附錄）γ-干擾素ELISA試驗(yàn)A.1試驗(yàn)材料A.1.1牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA試劑盒（內(nèi)含酶標(biāo)板、牛γ-干擾素陽性對(duì)照、牛γ-干擾素陰性對(duì)照、血漿稀釋緩沖液、20倍濃縮洗液、100倍濃縮酶標(biāo)結(jié)合物、5倍濃縮酶標(biāo)結(jié)合物稀釋液、底物緩沖液、100倍濃縮的顯色劑溶液和終止液）A.1.2牛型提純結(jié)核菌素（牛型PPD）A.1.3禽型提純結(jié)核菌素（禽型PPD）A.1.4肝素鈉真空管A.1.5孔組織培養(yǎng)板A.1.6單道可調(diào)移液器及配套吸頭（20μL-200μL、100μL-1000μL、1mL-10mL）A.1.7道移液器及配套吸頭（50μL-300μL）A.1.8量筒（100mL、1L、2L）A.1.9有蓋離心管（1.5mL）A.1.10恒溫CO2培養(yǎng)箱A.1.11酶標(biāo)儀A.1.12洗板機(jī)A.2試劑配制A.2.1磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01MpH7.2)取磷酸氫二鈉1.096g、磷酸二氫鈉0.316g、氯化鈉8.5g，用蒸餾水定容至1000mL，調(diào)pH至7.2，滅菌后使用。A.2.2酶標(biāo)結(jié)合物用去離子水或蒸餾水重新溶解100倍濃縮的凍干酶標(biāo)結(jié)合物。A.2.3酶標(biāo)結(jié)合物稀釋液用去離子水或蒸餾水重新溶解5倍濃縮的酶標(biāo)結(jié)合物稀釋液。A.2.4牛γ-干擾素陽性對(duì)照用1mL去離子水或蒸餾水重新溶解。A.2.5牛γ-干擾素陰性對(duì)照用1mL去離子水或蒸餾水重新溶解。A.2.6洗液用去離子水或蒸餾水重新溶解20倍濃縮的洗液。A.2.7顯色劑溶液將100倍濃縮的顯色劑溶液用底物緩沖液做100倍稀釋配制。A.3試驗(yàn)方法A.3.1臨床樣本采集及預(yù)處理A.3.1.1樣本的采集牛靜脈無菌采血5mL，放入肝素鈉真空管中，輕輕顛倒幾次混合血液，形成肝素鈉抗凝全血。出現(xiàn)凝血的全血樣品不可用。A.3.1.2肝素鈉抗凝全血的運(yùn)送肝素鈉抗凝全血應(yīng)在周圍環(huán)境溫度（22±5）℃運(yùn)送，并且最好在采血后8h（最長(zhǎng)不超過30h）內(nèi)用于檢測(cè)。A.3.1.3定量吸取肝素鈉抗凝全血分裝前輕輕顛倒試管，充分混勻血液樣品。將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每份抗凝血樣品加3孔，每孔加1.5mL。A.3.1.4加入牛型PPD、禽型PPD和PBS向24孔培養(yǎng)板中每份樣品對(duì)應(yīng)的3個(gè)孔分別無菌加入100μL牛型PPD、禽型PPD和PBS（陰性抗原對(duì)照充分混勻。A.3.1.5全血孵育過夜將全血培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃孵育18h（全血可接受培養(yǎng)時(shí)間為16~DB12/T527—20145A.3.1.6收獲血漿經(jīng)過18h培養(yǎng)，用移液器小心吸取約400μL的上層血漿，轉(zhuǎn)入獨(dú)立的1.5mL離心管中，待測(cè)。吸取血漿時(shí)應(yīng)盡量避免吸入細(xì)胞。待測(cè)樣品可立即用于試驗(yàn)或-20℃冷凍貯存。A.3.2檢測(cè)方法A.3.2.1試驗(yàn)前將酶標(biāo)板和所有試劑恢復(fù)到室溫，試劑充分混勻。A.3.2.2向酶標(biāo)板中的96孔中分別加入50μL血漿稀釋緩沖液，再向相應(yīng)孔中加入50μL待測(cè)樣品和牛γ-干擾素陰、陽性對(duì)照樣品。對(duì)照樣品應(yīng)最后加入。充分振蕩1min，徹底混勻。封板，室溫22±5）℃]孵育60±5）min］。用洗板機(jī)洗滌6次，將酶標(biāo)板去殘留的洗液。A.3.2.3每孔加入100μL稀釋好的酶標(biāo)結(jié)合物，充分振蕩混勻。室溫孵育（60±5min洗滌6次。A.3.2.4每孔加入100μL新鮮配制的顯色劑溶液，充分振蕩混合。室溫避光孵育30min。A.3.2.5迅速加入50μL終止液，輕輕搖動(dòng)混勻。A.3.2.6終止后5min內(nèi)讀出OD450值，然后用OD450值計(jì)算結(jié)果。A.3.3結(jié)果判定A.3.3.1滿足以下2個(gè)條件試驗(yàn)方成立牛γ-干擾素陰性對(duì)照OD450值<0.13，且陰性對(duì)照重復(fù)孔OD450值差≤0.04；牛γ-干擾素陽性對(duì)