膠原及其降解產(chǎn)物的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)探究報(bào)告目錄TOC\o"1-3"\h\u12130膠原及其降解產(chǎn)物的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)探究報(bào)告 1168851.1引言 1172571.2實(shí)驗(yàn)材料和儀器 3213591.1.1材料和試劑 3262151.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 391711.3實(shí)驗(yàn)方法 426261.3.1膠原及其降解產(chǎn)物的制備 4137751.3.2膠原及其降解產(chǎn)物的基礎(chǔ)理化性質(zhì)表征 696741.3.3膠原及其降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及性能表征 841971.4結(jié)果與分析 10106601.4.1氨基酸組成分析 10308841.4.2SDS凝膠電泳圖 1324581.4.3溶解度測(cè)定 15128701.4.4粘度測(cè)定 16259321.4.5紫外光譜分析 17179271.4.6紅外光譜分析 18295971.4.7圓二色譜分析 1910141.4.8差示掃描量熱法分析 221.1引言膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布最廣泛、含量最豐富的大分子結(jié)構(gòu)類蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量為30萬道爾頓，是細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，擁有特色三股螺旋結(jié)構(gòu)。膠原與生物體內(nèi)組織器官的形成、衰老、病變都有著十分密切的聯(lián)系。良好的生物相容性、生物可降解性、弱抗原性和細(xì)胞親和性，使得天然膠原在臨床醫(yī)學(xué)、生物材料、醫(yī)學(xué)美容、日用化學(xué)品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。近年來，隨著膠原應(yīng)用需求的日益增加，傳統(tǒng)陸生膠原已不滿足人們的需求，水產(chǎn)膠原的研究和應(yīng)用越來越受到業(yè)內(nèi)關(guān)注。從水產(chǎn)加工廢棄物中制備的天然膠原、膠原水解物等逐漸在生物材料、日用化學(xué)品中大放異彩。目前，水產(chǎn)動(dòng)物膠原常規(guī)提取方法有：堿提取、酸提取、酶解提取、熱水提取和中性鹽提取?？紤]到膠原在生物體組織中的差異性分布，我們選取膠原含量豐富的水產(chǎn)動(dòng)物皮，通過弱酸提取，制得所需原料-天然活性膠原。以采購的天然牛跟鍵膠原和實(shí)驗(yàn)室提取的天然多寶魚膠原為原料，分別采用冷凍研磨、熱變性處理等方式得到深度研磨膠原片段和熱變性膠原肽。其中，天然膠原具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的生物活性；研磨膠原片段分子量變小，有部分片段仍保持有三螺旋結(jié)構(gòu)；熱變性膠原分子量變小，三螺旋結(jié)構(gòu)改變，失去生物活性；膠原肽分子量極小，水溶性極好，滲透能力強(qiáng)，無三螺旋結(jié)構(gòu)，無生物活性；重組類人膠原水溶性好、批次穩(wěn)定、排異反應(yīng)低。膠原及其降解產(chǎn)物在臨床醫(yī)學(xué)、生物材料、醫(yī)學(xué)美容、日用化學(xué)品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其中，日用化學(xué)品由于產(chǎn)品種類多、受眾廣、對(duì)膠原產(chǎn)品性能要求相對(duì)寬泛等因素，成為膠原類產(chǎn)品應(yīng)用的最主要領(lǐng)域之一。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，不同類型、不同來源膠原或膠原水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性能的差異化比較和分析尚不完善，不同來源和類型膠原對(duì)日用化學(xué)品功能的影響尚不明確，一定程度上限制了各類膠原產(chǎn)品的科學(xué)化應(yīng)用。為此，將上述實(shí)驗(yàn)室制備的各類膠原產(chǎn)品和市場(chǎng)購置的膠原肽、重組膠原等共計(jì)10種膠原產(chǎn)品為分析對(duì)象，通過氨基酸組成、SDS凝膠電泳、溶解度、粘度、紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜和差示掃描量熱，測(cè)定各類膠原的基礎(chǔ)理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)性能，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。1.2實(shí)驗(yàn)材料和儀器1.1.1材料和試劑表1.1主要材料和試劑Table1.1Mainmaterialsandreagents實(shí)驗(yàn)原料及試劑規(guī)格產(chǎn)地天然牛跟腱膠原創(chuàng)爾生物有限公司天然多寶魚膠原實(shí)驗(yàn)室自提水解牛皮膠原肽食品級(jí)常州洋生物科技有限公司水解魚皮膠原肽食品級(jí)常州洋生物科技有限公司膠原三肽98%陜西本禾生物工程有限公司重組類人膠原98%陜西本禾生物工程有限公司超純水實(shí)驗(yàn)室自制十二烷基硫酸鈉（SDS）上海捷瑞生物技術(shù)工程有限公司考馬斯亮藍(lán)上海捷瑞生物技術(shù)工程有限公司1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器表1.2實(shí)驗(yàn)儀器Table1.2Experimentalinstruments實(shí)驗(yàn)儀器生產(chǎn)廠家型號(hào)磁力攪拌器上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司Feb-85電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司DHG-9140A超純水機(jī)成都優(yōu)普儀器UPH-II-5T高速離心機(jī)上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司L4045D超聲波清洗器科導(dǎo)超聲波儀器有限公司SK3300LHC隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司GHP-9050冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)學(xué)儀器廠LGJ-10D紫外分光光度儀美國GARY50公司GARY50紅外光譜儀美國ThermoNicolet公司NEXUS差示掃描量熱儀美國TA公司DSCQ2000圓二色譜儀日本JASCO公司JASCO-1500氨基酸自動(dòng)分析儀日本日立有限公司日立835-50電泳儀北京市六一儀器廠DYY-6D旋轉(zhuǎn)流變儀英國馬爾文儀器有限公司Kinexus1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1膠原及其降解產(chǎn)物的制備（1）天然膠原的制備①提取于武漢市常青花園超市購買多寶魚若干條，采用人工剝離的方法進(jìn)行動(dòng)物皮采取，所有的膠原制備過程均在4℃下進(jìn)行。將動(dòng)物皮上多余的肌肉組織與色素用手術(shù)刀剔除，然后用去離子水清洗、風(fēng)干、稱重，接著將其剪為2×2cm小塊。將風(fēng)干的小塊多寶魚皮加入容量為3000mL的干凈燒杯中，后加入無水乙醚，使其料液比為1:10（g/mL），再將燒杯口用保鮮膜封住，燒杯中加入磁子，中等速度磁力攪拌24h，進(jìn)行第一次脫脂，脫脂后將魚皮分離，并回收溶劑。待魚皮上殘留的溶劑揮發(fā)干爽后，加入10%正丁醇，（料液比為1:10），進(jìn)行第二次脫脂，用保鮮膜封住燒杯口，磁力攪拌24h，每8h更換一次溶劑，后分離魚皮。使用去離子水洗滌第二次脫脂后的魚皮至中性，風(fēng)干后加入0.1mol/LNaOH溶液，料液比為1:20，然后進(jìn)行雜蛋白脫除。將燒杯口用保鮮膜封住，燒杯中加入磁子，中等速度磁力攪拌24h，每8h更換一次溶劑，后分離魚皮，將魚皮使用去離子水洗滌至中性，瀝干后，進(jìn)行風(fēng)干處理，等到表面干爽后進(jìn)行酸溶初提。加入0.5mol/L乙酸溶液，料液比為1:60，不定時(shí)攪拌4d。隨時(shí)增加乙酸溶液，保持最初料液比。在低溫操作臺(tái)中，使用小孔濾布進(jìn)行過濾，用手使勁捏壓，使濾渣濾液充分分離。②純化將稱量好的NaCl加入到魚皮處理得到的濾液中，使濾液中NaCl濃度為1.6mol/L，后充分進(jìn)行鹽析（加鹽時(shí)，邊加邊用手捏碎，使其大塊狀分散開來，避免鹽析不充分。），12h后使用小孔濾布進(jìn)行過濾，用手使勁捏壓，然后得到留取沉淀物。將得到的沉淀物用0.1mol/L乙酸進(jìn)行溶解，后將溶液灌裝至透析袋中，放置在大燒杯進(jìn)行透析，先用0.1mol/L的乙酸進(jìn)行透析處理，每8h進(jìn)行一次溶劑的更換，直至去除Cl-（用AgNO3溶液檢驗(yàn)）。再用超純水進(jìn)行透析，每8h更換一次溶劑，直至透析外液呈中性（用pH試紙檢測(cè)）。將透析完成的膠原倒入平皿中，上負(fù)保鮮膜封口，防治藥品被污染，并扎若干小孔，保證后期真空干燥交流正常。將平皿置于-18℃的冰箱中中預(yù)凍24h，后將預(yù)凍完成的膠原放入真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行48h的干燥環(huán)節(jié)。取少量膠原用0.1mol/L的乙酸進(jìn)行溶解，后用圓二色譜儀測(cè)試，觀察是否具備生物活性。將冷凍干燥后的膠原取出裝入保鮮袋中，標(biāo)記并置于-18℃中保藏。（2）熱變性膠原的制備①溶解膠原用0.1mol/L的乙酸在低溫操作臺(tái)進(jìn)行溶解，目測(cè)為均一無顆粒溶液時(shí)停止磁力攪拌，若有氣泡，靜置一段時(shí)間。選取合適長(zhǎng)度無破損的透析袋，待膠原基本無氣泡時(shí)進(jìn)行灌裝，注意夾子需用橡皮筋二次固定。每8h更換一次去離子水，換水兩天左右時(shí)拆開透析袋，用pH試紙檢測(cè)pH，pH為5~6即可。將透析好的膠原放入50mL離心管，寫好標(biāo)簽，放置低溫操作臺(tái)備用。②熱變性膠原預(yù)熱水浴鍋為80℃。將裝有膠原的離心管放入小燒杯中，繼而放入水浴鍋中，在80℃中水浴1h。取少量熱變性膠原用圓二色譜儀測(cè)試，觀察是否具有三螺旋結(jié)構(gòu)。（3）膠原片段的制備①預(yù)處理膠原海綿將牛跟腱或多寶魚膠原海綿剪成小碎塊，裝在50mL離心管中。將膠原小碎塊置于-18℃中預(yù)凍24h，后將預(yù)凍完成的膠原小碎塊放入真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行12h干燥處理。待小碎塊水分去除完全后，從真空冷凍干燥機(jī)中取出，放在低溫操作臺(tái)備用。②冷凍研磨洗凈研磨工具，烘干，放在低溫操作臺(tái)備用。將膠原小碎塊放入研磨工具中，注意用馬克筆在外層做標(biāo)記。用液氮冷凍3h，后用研磨機(jī)研磨5min，再冷凍3h研磨5min，研磨時(shí)間共為60min。（4）其他膠原及其降解產(chǎn)物的準(zhǔn)備以純度高、分子量小、水溶性強(qiáng)為購買標(biāo)準(zhǔn)，挑選不同種源的膠原肽四種，分別為水解牛皮膠原蛋白肽、水解魚皮膠原蛋白肽、膠原三肽、類人膠原蛋白，常溫密封進(jìn)行保存，以備后期實(shí)驗(yàn)使用。1.3.2膠原及其降解產(chǎn)物的基礎(chǔ)理化性質(zhì)表征（1）氨基酸組成分析參照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法，使用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)膠原及其降解產(chǎn)物的氨基酸組成進(jìn)行分析。分別準(zhǔn)確稱取一定量的膠原及其降解產(chǎn)物樣品，用含有2%（v/v）石碳酸的6mol/L鹽酸在110℃真空條件下進(jìn)行樣品的水解。反應(yīng)24h后，經(jīng)過濾定容，取一定量水解樣品加壓蒸干，再用0.02mol/L稀鹽酸溶解定容，量取30μL，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定分析，所有樣品重復(fù)測(cè)定三次，然后將平均值作為測(cè)定最終結(jié)果。（2）SDS凝膠電泳大分子膠原分子量的測(cè)定使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析表征。首先將大分子膠原溶解于0.1mol/L醋酸中配置成2mg/mL的溶液。隨后，將膠原溶液用5倍體積的SDS上樣緩沖液按料液比4:1稀釋，用渦旋震蕩儀混合均勻，使蛋白質(zhì)變性，4℃冷藏備用。用4%濃縮凝膠制第一層膠，用去離子水封層，觀察無漏液情況后凝固40分鐘，待出現(xiàn)清晰的分層界面后倒去水層，用濾紙盡量吸去多余水分，進(jìn)行下一層膠的制作。后用5%分離凝膠制備聚丙烯酰胺凝膠的第二層膠，將分離凝膠加入完成后插入上樣梳子，靜待40分鐘，待膠凝固后，拔除梳子，進(jìn)行上樣。然后將上樣后的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行恒流電泳，1×的電泳緩沖液由3.03gTris堿、18.77g甘氨酸、1.0gSDS和1000mL去離子水共同組成。電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃剝除，置于固定液中固定1h，后用考馬斯亮藍(lán)R250染色3h，并在甲醇和乙酸（2:1）混合物中浸泡脫色，每6小時(shí)換一次脫色液，直至聚丙烯酰胺凝膠上蛋白條帶清晰出現(xiàn)。通過與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，表征大分子膠原的分子量。小分子膠原肽分子量的測(cè)定使用Tricine-SDS電泳。將小分子膠原溶解在0.1mol/L乙酸中配置成5mg/mL的溶液。隨后，將膠原溶液用2倍體積的SDS上樣緩沖液按料液比2:1稀釋，用渦旋震蕩儀混合均勻，4℃冷藏備用。小分子電泳凝膠層用15.5%的分離膠、10%的夾層膠與4%的濃縮膠制備而成。待膠凝固上樣梳子拔除后，先將電泳槽放入4℃低溫操作臺(tái)中，外槽加入適量1×陽極緩沖液，內(nèi)槽加入適量1×陰極緩沖液，電壓30V預(yù)電泳10min，后將將樣品緩慢加入點(diǎn)樣孔，進(jìn)行電泳環(huán)節(jié)，30V電泳1h，100V電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部后停止電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃剝除，置于固定液中固定1h，后用考馬斯亮藍(lán)R250染色3h，并在甲醇和乙酸（2:1）混合物中浸泡脫色，每6小時(shí)換一次脫色液，直至聚丙烯酰胺凝膠上蛋白條帶清晰出現(xiàn)。通過與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，表征小分子膠原肽的分子量。（3）溶解度將10種膠原及其降解產(chǎn)物稱量0.1g，加入3mL超純水磁力攪拌48h，后用8000r/min的速度離心5min，將上清液倒出，留取底部沉淀物，在-18℃預(yù)凍24h后，真空冷凍干燥3天，后取出殘余固體，稱量質(zhì)量，計(jì)算溶解度，。（4）粘度使用旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)定膠原及其降解產(chǎn)物水溶液的粘度大小。將樣品配制為2mg/mL水溶液，使用旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)定其水溶液粘度，定剪切速率為300s-1，取點(diǎn)間隔5s，溫度10℃，儀器穩(wěn)定時(shí)間60s，測(cè)試時(shí)間120s。1.3.3膠原及其降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及性能表征（1）紫外光譜分析（UV）采用紫外光譜分析10種膠原及其降解產(chǎn)物的紫外吸收峰。用0.5mol/L醋酸溶液溶解樣品，配制成濃度為1mg/mL的膠原溶液。在室溫下用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。掃描波長(zhǎng)范圍190~800nm，波長(zhǎng)精度1nm。（2）紅外光譜分析（FTIR）使用紅外光譜儀測(cè)定10種膠原及其降解產(chǎn)物的的紅外特征峰。將膠原海綿樣品用小刀切開刨碎，與干燥研磨后的溴化鉀粉末混合壓片，樣品與溴化鉀粉末的體積比為1:100，待壓出半透明藥片后進(jìn)行分析測(cè)試。利用美國ThermoNicolet公司生產(chǎn)的傅里葉變換紅外光譜儀，數(shù)據(jù)采集參數(shù)分辨率為2cm-1/點(diǎn)，掃描次數(shù)為16次，掃描范圍為4000~500cm-1。自動(dòng)進(jìn)行校正、平滑。每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，最終取平均值。后使用Origin軟件對(duì)紅外譜圖進(jìn)行處理。（3）圓二色譜分析（CD）通過圓二色譜儀進(jìn)行膠原及其降解產(chǎn)物的三螺旋結(jié)構(gòu)表征的研究。分別準(zhǔn)確稱取一定量的膠原及其降解產(chǎn)物，溶于0.1mol/L醋酸溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的溶液。將溶液樣品加入1mm光徑的石英池，室溫條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有樣品均扣除空白背景的峰值，在250nm~190nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄CD圖譜為3次掃描的平均值。后用analysis窗口進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析。并計(jì)算Rpn值（正峰與負(fù)峰峰值之比）表征膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。（4）差示掃描量熱法（DSC）用差式掃描量熱儀測(cè)定樣品變性溫度。儀器采用金屬銦進(jìn)行校正（銦的熔融焓28.451J/g，熔點(diǎn)為165.4℃）。精確稱取一定量樣品，置于鋁盒中，壓蓋密封。掃描樣品，從30℃加熱到150℃，升溫速率為5℃/min，樣品室的氮?dú)饬髁繛?0mL/min。用空鋁盒作為空白對(duì)照。從DSC轉(zhuǎn)移曲線的最大峰值得到樣品的收縮溫度。

1.4結(jié)果與分析1.4.1氨基酸組成分析氨基酸的種類與排列方式?jīng)Q定了膠原的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)，為闡述不同物種、同一物種不同處理方式膠原的氨基酸區(qū)別，將10種膠原及其降解產(chǎn)物通過氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其不同種類氨基酸富集度來判斷對(duì)膠原其他理化性質(zhì)的影響，結(jié)果如表1.3所示?？v觀檢測(cè)，膠原及其降解產(chǎn)物不管來源如何，均不存在半胱氨酸、色氨酸，組氨酸、酪氨酸和異亮氨酸的含量也較少，富含甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、羥脯氨酸和丙氨酸，其中特征氨基酸為羥脯氨酸。表1.3膠原及其降解產(chǎn)物氨基酸組成表（殘基數(shù)量/1000個(gè)氨基酸殘基）Table1.3Aminoacidcompositionofcollagenanditsdegradationproducts（Numberofresidues/1000aminoacidresidues）氨基酸天然牛跟腱天然多寶魚研磨牛跟腱研磨多寶魚重組類人膠原天冬氨酸50.5148.0851.9548.041.98蘇氨酸16.6721.2716.2821.800.99絲氨酸31.9551.9733.3654.271.19谷氨酸73.9370.9575.8271.954.87脯氨酸120.0891.22111.7191.535.57甘氨酸300.68294.65305.17310.2817.70丙氨酸110.15123.39121.12126.115.17胱氨酸1.485.854.756.340.89纈氨酸19.3518.6224.5517.351.88蛋氨酸1.4914.471.1716.241.49異亮氨酸11.027.7711.128.450.60亮氨酸23.1219.0421.6515.460.60酪氨酸4.375.323.935.00236.63苯丙氨酸11.6014.369.9013.900.00賴氨酸21.8227.3421.9226.021.89組氨酸6.456.385.156.34708.89精氨酸64.3065.9565.5168.393.18羥脯氨酸127.02111.37110.9591.533.48注：表中數(shù)據(jù)表示氨基酸殘基數(shù)占1000個(gè)氨基酸殘基數(shù)的比例

氨基酸熱變性牛跟腱熱變性多寶魚牛肽魚肽膠原三肽天冬氨酸51.3046.2950.8663.7448.87蘇氨酸16.0721.8117.1726.3324.89絲氨酸33.3351.7137.7474.2741.95谷氨酸76.3571.8581.2591.4778.68脯氨酸107.7886.57129.0187.17128.45甘氨酸306.39303.03326.26291.27330.16丙氨酸120.76119.44124.75125.75118.41胱氨酸7.396.025.444.848.33纈氨酸23.9525.4724.9521.6023.58蛋氨酸1.0015.206.5016.8711.14異亮氨酸11.388.1911.3711.5011.24亮氨酸21.5519.1523.3523.2211.84酪氨酸4.6914.211.674.941.51苯丙氨酸14.8717.8711.6213.878.03賴氨酸23.2528.1330.6035.1530.51組氨酸5.197.014.909.3510.34精氨酸65.9766.8265.3674.0571.55羥脯氨酸105.7989.2345.2124.6137.53注：表中數(shù)據(jù)表示氨基酸殘基數(shù)占1000個(gè)氨基酸殘基數(shù)的比例表1.4各膠原樣本的氨基酸分布數(shù)據(jù)Table1.4Aminoaciddistributiondataofeachcollagensample亞氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸帶電荷氨基酸天然牛跟腱247.10124.4493.58218.02天然多寶魚203.60119.0399.67218.70研磨牛跟腱223.65127.7693.58221.35研磨多寶魚184.05120.00100.76220.75熱變性牛跟腱213.57128.6494.41223.05熱變性多寶魚175.80119.14101.96221.10牛肽174.22131.10100.86231.97魚肽165.98127.55113.40240.94膠原三肽111.78155.20118.55273.75重組類人膠原9.057.85713.96721.81不帶電荷極性氨基酸總極性氨基酸非極性氨基酸羥基化率%天然牛跟腱181.49400.52597.0051.41天然多寶魚205.40424.10570.0549.42研磨牛跟腱166.69388.04607.2249.61研磨多寶魚188.83409.59584.0749.11熱變性牛跟腱161.88384.93607.6849.53熱變性多寶魚193.17414.27579.7150.20牛肽109.29341.25651.3125.95魚肽119.02359.96631.7121.61膠原三肽147.03420.79574.3821.02重組類人膠原244.78966.5931.5138.46注：亞氨基酸=脯氨酸+羥脯氨酸；酸性氨基酸=天冬氨酸+谷氨酸；堿性氨基酸=賴氨酸+組氨酸+精氨酸；帶電荷氨基酸=酸性氨基酸+堿性氨基酸；不帶電荷極性氨基酸=蘇氨酸+絲氨酸+蛋氨酸+酪氨酸+羥脯氨酸；總極性氨基酸=帶電荷氨基酸+不帶電荷極性氨基酸；非極性氨基酸=甘氨酸+丙氨酸+脯氨酸+纈氨酸+異亮氨酸+亮氨酸+苯丙氨酸；羥基化率%=100*（羥脯氨酸/亞氨基酸）從表中可看出，除類人重組膠原外，其余9種膠原及其降解產(chǎn)物均符合型膠原蛋白的氨基酸組成特征，甘氨酸含量占總氨基酸含量的1/3左右，如天然牛跟腱膠原（306.39）、天然多寶魚膠原（303.03），這是因?yàn)槟z原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是區(qū)段序列Gly-X-Y氨基酸序列重復(fù)而成[61]。亞氨基含量（脯氨酸和羥脯氨酸）約占1/4，且不同種源的羥脯氨酸含量差異顯著。不同種源中，天然牛跟腱膠原的亞氨基含量（247.10）比相應(yīng)的天然多寶魚膠原（203.60）高約20%；研磨牛跟腱膠原片段（223.65）比研磨多寶魚片段（184.05）高約22%；熱變性牛跟腱膠原（213.57）比熱變性多寶魚（175.80）高約21%；水解牛肽（174.22）高于水解魚肽（165.98）約5%，表明牛跟腱產(chǎn)品的亞氨基含量都高于多寶魚產(chǎn)品，這可能是牛與多寶魚棲息環(huán)境的差異所導(dǎo)致的。同一魚源膠原產(chǎn)品的亞氨基含量關(guān)系為：天然多寶魚膠原（203.60）>研磨多寶魚膠原片段（184.05）>熱變性多寶魚膠原肽（175.80）>水解魚肽（165.98），表明不同處理方式會(huì)對(duì)膠原亞氨基含量產(chǎn)生影響，但其內(nèi)在機(jī)理還未探明。膠原的羥脯氨酸能夠促進(jìn)肽鏈間氫鍵的形成，氫鍵能夠維持膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，故脯氨酸的羥基化程度與具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原蛋白的熱穩(wěn)定性有密切關(guān)系，羥基化程度越高，熱穩(wěn)定性越好[62,63]。故通過羥基化率可推測(cè)活性牛跟腱膠原（51.41）的熱穩(wěn)定性將優(yōu)于活性多寶魚膠原（49.42）。研磨后的膠原中含有部分有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原片段，故它的熱穩(wěn)定性趨勢(shì)應(yīng)與天然膠原蛋白一致，為牛跟腱>多寶魚。牛跟腱膠原為陸地哺乳動(dòng)物膠原，多寶為水產(chǎn)膠原，由于棲息環(huán)境不同，牛跟腱的熱穩(wěn)定性應(yīng)優(yōu)于多寶魚。1.4.2SDS凝膠電泳圖電泳通過膠原及其降解產(chǎn)物的帶電荷粒子移動(dòng)速率的不同，在直流電場(chǎng)中將樣品進(jìn)行分離。為闡述不同物種、同一物種不同處理方式膠原的分子量大小，將10種膠原及其降解產(chǎn)物使用SDS凝膠電泳法進(jìn)行測(cè)定，探究不同分子量對(duì)膠原其他理化性質(zhì)的影響。其結(jié)果如圖1.1所示。圖1.1膠原及其降解產(chǎn)物SDS凝膠電泳圖Figure1.1SDSgelelectrophoresisofcollagenanditsdegradationproducts其中1為天然牛跟鍵膠原、2為天然多寶魚膠原、3為熱變性牛跟鍵膠原肽、4為熱變性多寶魚膠原肽、5為冷凍研磨牛跟鍵膠原片段、6為冷凍研磨多寶魚膠原片段、7為牛肽、8為魚肽、9為膠原三肽、10為類人重組膠原從圖1.1可看出，活性牛跟腱、多寶魚膠原的SDS凝膠電泳圖有四條清晰的條帶，從上到下依次為γ（少量，分子量在200KDa以上）、β（分子量約為210KDa）、α1（分子量約為118KDa）和α2（分子量約為110KDa）。β條帶是兩條α鏈所構(gòu)成的二聚體，而γ條帶則是結(jié)構(gòu)比較完整的膠原三聚體，圖中1、2條帶的α1含量大約是α2的兩倍，可推斷實(shí)驗(yàn)室提取天然膠原是由α1，α2兩條分子量不同的肽鏈構(gòu)成的（α1）2α2螺旋結(jié)構(gòu)[64]。同時(shí)，這些典型的I型膠原條帶特征，可以推測(cè)出實(shí)驗(yàn)室提取的活性膠原基本保持了完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。熱變性牛跟腱、多寶魚膠原肽與冷凍研磨牛跟腱、多寶魚膠原片段由于后期處理，分子量變小。熱變性的膠原肽平均分子量大于冷凍研磨膠原片段的分子量，推測(cè)熱變性的膠原肽在高溫水解為分子量較小的膠原肽，溫度降低后，分散的膠原肽部分重新聚合在一起，分子內(nèi)纏結(jié)程度變高，形成具有彈力的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使分子量再次變大，但也有部分小分子肽的存在。研磨過后的膠原片段在15KDa~100KDa的區(qū)間內(nèi)較為均勻分布，比熱變性的膠原肽分子量更小，推測(cè)研磨的撞擊破壞力較強(qiáng)，使小分子片段無法再次聚集成長(zhǎng)鏈；膠原肽的分子量在10KDa以下，都具有較小的分子量，類人膠原蛋白未出現(xiàn)清晰的條帶，推測(cè)樣品濃度不夠或者所購買的樣品質(zhì)量不過關(guān)，并非為膠原蛋白產(chǎn)品。1.4.3溶解度測(cè)定不同物質(zhì)由于其理化性質(zhì)的不同，在水中的溶解度也不盡相同。膠原及其降解產(chǎn)物在水中的溶解度如圖1.2所示。圖1.2膠原及其降解產(chǎn)物的水溶劑溶解度圖Fig.1.2Solubilitydiagramofcollagenanditsdegradationproductsinwater注：a,b,c,d,e,f,g,h表示膠原及其降解產(chǎn)物的水溶劑溶解度存在顯著性差異，α=0.05從圖1.2我們可以看出，膠原及其降解產(chǎn)物中天然活性膠原溶解度最低，天然膠原本不溶于冷水熱水[65]，此時(shí)呈現(xiàn)出的溶解度推測(cè)為制備時(shí)少量天然膠原被分解為多肽，夾雜在膠原海綿中，使之具有一定的溶解性，且天然多寶魚膠原的溶解性顯著低于天然牛跟腱膠原（p<0.05）；冷凍研磨后的膠原片段因?yàn)榉肿恿孔冃?，故在水中的溶解度變高，但由于還含有部分具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原片段，溶解度不如水解膠原肽好，顯著低于水解膠原肽（p<0.05）；熱變性后的膠原遇冷水長(zhǎng)時(shí)間放置，有小許溶脹，分子內(nèi)更加纏結(jié)，部分復(fù)性成為凝膠狀態(tài)，故在水中的溶解度小于冷凍研磨的膠原片段；膠原肽類分子量小，完全溶解于水中，水溶性極好，其中膠原三肽的溶解性最好，水解膠原肽物種間無顯著性差別（p>0.05）。

1.4.4粘度測(cè)定膠原由于天然的三螺旋結(jié)構(gòu)，分子間纏結(jié)密切，化學(xué)鍵能大，故有較大的粘度。經(jīng)過處理后的膠原降解產(chǎn)物三螺旋結(jié)構(gòu)解旋或部分丟失，使得其粘度會(huì)發(fā)生變化。采用旋轉(zhuǎn)流變儀定剪切速率模式測(cè)定膠原及其降解產(chǎn)物的粘度，結(jié)果如表1.5所示。表1.5膠原及其降解產(chǎn)物水溶液粘度Table1.5TheviscosityofcollagenanditsdegradationproductsinaqueoussolutionNameviscosity（PA.S）N-BAT-C0.69510bN-FS-C0.94203aG-BAT-CF0.01092cG-FS-CF0.01107cRH-C0.00103dNameviscosity（PA.S）T-BAT-CP0.01012cT-FS-CP0.01021cH-BAT-CP0.00104dH-FS-CP0.00113dGXY-CP0.00105d注：a,b,c,d表示膠原及其降解產(chǎn)物的粘度存在顯著性差異，α=0.05根據(jù)表中數(shù)據(jù)可以看出，天然膠原中，多寶魚的粘度顯著大于牛跟腱（p<0.05），這可能是膠原提取和純化工藝的差異所引起的；熱變性與研磨后的膠原粘度都較小，無顯著性差別（p>0.05），推測(cè)原因?yàn)閮烧叻肿恿肯嘟荒z原肽的粘度最小，物種間無顯著性差別（p>0.05）。觀察數(shù)據(jù)可發(fā)發(fā)現(xiàn)，膠原及其降解產(chǎn)物水溶液的粘度與其分子量有很大關(guān)系，分子量越大，粘度越大，粘度從大到小排列分別為活性膠原>熱變性膠原肽>研磨膠原片段>膠原肽。

1.4.5紫外光譜分析紫外可見吸收光譜利用在190~800nm光譜區(qū)中膠原樣品對(duì)輻射的吸收從而進(jìn)行測(cè)定分析，蛋白質(zhì)展現(xiàn)出的紫外光譜是其分子中各種紫外生色基團(tuán)加和的結(jié)果。膠原的主要紫外生色基為芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），這些生色基團(tuán)可在230~310nm的紫外區(qū)間范圍內(nèi)有吸收，生成膠原的特征吸收峰（出峰位置在230nm處），故紫外光譜可用于膠原特征峰的測(cè)試，對(duì)樣品是否為膠原蛋白進(jìn)行定性分析，同時(shí)探測(cè)可蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。為探究不同物種、同一物種不同處理方式膠原的紫外光譜區(qū)別，將10種膠原及其降解產(chǎn)物通過紫外分光光度儀進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，其結(jié)果如圖1.3所示。圖1.3膠原及其降解產(chǎn)物的紫外光譜圖Fig.1.3Ultravioletspectraofcollagenanditsdegradationproducts由上圖可看出除類人膠原蛋白外，其余9種膠原及其降解產(chǎn)物的紫外最大吸收峰均在230nm處，符合I型膠原的特征紫外吸收，在278nm處無源自苯丙氨酸微弱的正峰，在259nm處也無源自酪氨酸的峰，推測(cè)原因?yàn)槟z原含量過低，未捕捉到其信號(hào)。1.4.6紅外光譜分析傅里葉變換紅外光譜圖可用于研究膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。一般用于研究膠原的原始結(jié)構(gòu)、明確膠原交聯(lián)、變性、自組裝等處理后結(jié)構(gòu)的變化情況。圖1.4膠原及其降解產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜圖Fig.1.4Fourierinfraredspectraofcollagenanditsdegradationproducts10種膠原及其降解產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜圖如圖1.4所示，測(cè)試的10種膠原蛋白中除類人膠原的紅外光譜圖外均有I型膠原蛋白的特征吸收峰：酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺I帶、酰胺II帶及酰胺III帶。其中9種膠原及其降解產(chǎn)物的酰胺A帶在3323cm-1左右處，表征為N-H伸縮振動(dòng)與氫鍵的締合；3084cm-1左右處有表示酰胺B帶C-N伸縮振動(dòng)的弱吸收峰；酰胺II帶均在1565cm-1左右，酰胺III帶均在1238cm-1左右，其中酰胺II與N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)相關(guān)，酰胺III帶與膠原分子中C-N的伸縮振動(dòng)有關(guān)。這些出峰位置的相似表明9種膠原及其降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)相同?？傮w來說，除類人膠原蛋白外其余9種膠原蛋白的紅外譜圖相似，特征吸收峰位置接近，表明這9種膠原的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。1.4.7圓二色譜分析圓二色譜可表征膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，并在較稀蛋白質(zhì)溶液中能快速、簡(jiǎn)單進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè)，從而獲得有關(guān)膠原構(gòu)象的多種信息。天然膠原中的Gly-X-Y肽段的重復(fù)序列使得膠原呈現(xiàn)螺旋構(gòu)象的聚脯氨酸II型。通常，具有生物活性的膠原分子的CD圖譜會(huì)在220nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)一個(gè)正峰，在197nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰，表征其具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被完全破壞時(shí)，正峰會(huì)完全消失[66]，且197nm處的負(fù)峰減弱。同時(shí)，熱變性處理后的膠原即使重新恢復(fù)至室溫，其三螺旋結(jié)構(gòu)也不會(huì)還原，即熱變性處理對(duì)膠原的活性破壞是不可逆的。膠原及其降解產(chǎn)物在190~250nm的的圓二色譜見圖1.5。圖1.5膠原及其降解產(chǎn)物的圓二色譜圖Fig.1.5Circulardichrogramofcollagenanditsdegradationproducts在蛋白質(zhì)或多肽中主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵。當(dāng)平面圓偏振光通過這些光活性基團(tuán)時(shí)，光活性中心對(duì)平面圓偏振光中的左、右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生吸收差值，由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是蛋白質(zhì)的圓二色性。遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二光譜在肽鍵吸收峰范圍內(nèi)，反映了主鏈構(gòu)象。膠原由三條α肽鏈組成，α肽鏈自身為α螺旋結(jié)構(gòu)，三條α肽鏈則以平行、右手螺旋形式纏繞成“草繩狀”三股螺旋結(jié)構(gòu)[67]。1.6膠原及其降解產(chǎn)物的Rpn值Table1.6RPNvaluesofcollagenanditsdegradationproducts-PAGEIII-NameRpnN-BAT-C0.185853N-FS-C0.111255G-BAT-CF0.094676G-FS-CF0.084449RH-C0.425565NameRpnT-BAT-CP0.001061T-FS-CP0.003913H-BAT-CP0.012991H-FS-CP0.006196GXY-CP0.007211由圖可以看出，實(shí)驗(yàn)室提取的活性牛跟腱膠原在225nm左右