空間轉(zhuǎn)錄組學揭示腫瘤干細胞微環(huán)境演講人CONTENTS空間轉(zhuǎn)錄組學：解析CSCs微環(huán)境的技術(shù)基石傳統(tǒng)認知與局限：CSCs微環(huán)境研究的“空間盲區(qū)”空間轉(zhuǎn)錄組學揭示CSCs微環(huán)境的時空動態(tài)與分子機制空間轉(zhuǎn)錄組學在CSCs微環(huán)境研究中的應用與挑戰(zhàn)總結(jié)與展望目錄空間轉(zhuǎn)錄組學揭示腫瘤干細胞微環(huán)境引言在腫瘤研究的漫長征程中，腫瘤干細胞（CancerStemCells,CSCs）始終是焦點所在——這些具備自我更新、多向分化及強致瘤能力的“種子細胞”，被認為是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源。然而，單有“種子”尚不足以孕育參天“腫瘤之樹”，其生長、侵襲與逃逸離不開周圍微環(huán)境的“土壤”滋養(yǎng)。傳統(tǒng)觀點中，腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment,TME）被視作靜態(tài)的“支持背景”，但近年研究發(fā)現(xiàn)，TME實則是與CSCs動態(tài)互作的“生態(tài)系統(tǒng)”：免疫細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、細胞外基質(zhì)等組分通過復雜的信號網(wǎng)絡，共同調(diào)控CSCs的干性維持、表型轉(zhuǎn)換與功能發(fā)揮。我曾在一項關(guān)于肝癌轉(zhuǎn)移的研究中遇到這樣的困惑：為何病理類型相同的患者，部分在術(shù)后早期即出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移，而另一些卻能長期帶瘤生存？彼時，我們通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移灶與非轉(zhuǎn)移灶中均存在CSCs亞群，但其轉(zhuǎn)錄特征并無顯著差異。這一結(jié)果提示我們：CSCs的功能或許不取決于其“內(nèi)在基因型”，而更多取決于其在組織中的“空間位置”及與周圍微環(huán)境的“互動方式”。然而，傳統(tǒng)研究方法難以捕捉這種空間動態(tài)——免疫組化雖能定位特定蛋白，卻無法全面展示分子圖譜；單細胞測序雖能解析細胞異質(zhì)性，卻丟失了空間坐標信息，如同知道一群人的職業(yè)與語言，卻不知他們在城市中的分布與互動關(guān)系?？臻g轉(zhuǎn)錄組學（SpatialTranscriptomics,ST）的出現(xiàn)，為這一困境帶來了破局之道。該技術(shù)能夠在保持組織空間結(jié)構(gòu)的前提下，原位捕獲數(shù)千個基因的轉(zhuǎn)錄信息，讓我們第一次以“上帝視角”觀察CSCs與其微環(huán)境的“空間對話”。正如我在分析第一例乳腺癌空間數(shù)據(jù)時的震撼：CSCs并非隨機散布在腫瘤組織中，而是傾向于聚集在血管周圍、成纖維細胞富集區(qū)或免疫邊界，形成具有功能意義的“空間生態(tài)位”。這種空間結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，徹底改變了我們對CSCs微環(huán)境的認知——它不再是混沌的“背景板”，而是由空間有序的“功能單元”精密構(gòu)建的“調(diào)控網(wǎng)絡”。本文將基于空間轉(zhuǎn)錄組學的技術(shù)突破，系統(tǒng)闡述其如何揭示CSCs微環(huán)境的時空動態(tài)、分子機制及臨床意義。從技術(shù)原理到生物學發(fā)現(xiàn)，從基礎機制到轉(zhuǎn)化應用，我們試圖描繪一幅CSCs與微環(huán)境“共舞”的全景圖，為腫瘤研究提供新的視角與思路。01空間轉(zhuǎn)錄組學：解析CSCs微環(huán)境的技術(shù)基石空間轉(zhuǎn)錄組學：解析CSCs微環(huán)境的技術(shù)基石要理解CSCs微環(huán)境的“空間邏輯”，首先需掌握能夠“看見”空間的技術(shù)工具?？臻g轉(zhuǎn)錄組學作為連接基因組學與組織形態(tài)學的橋梁，通過在原位捕獲轉(zhuǎn)錄本并賦予空間坐標，實現(xiàn)了“基因表達-細胞位置-組織結(jié)構(gòu)”的三維整合。自2016年首個ST方法（Visium）問世以來，技術(shù)迭代日新月異，分辨率從毫米級提升至亞細胞級，捕獲通量從千基因擴展至全轉(zhuǎn)錄組，為解析CSCs微環(huán)境的復雜性提供了前所未有的技術(shù)支撐。1空間轉(zhuǎn)錄組學的核心技術(shù)原理與分類空間轉(zhuǎn)錄組學的核心目標在于解決兩個關(guān)鍵問題：“哪里有細胞表達某個基因？”以及“這些細胞在組織中如何分布？”。根據(jù)技術(shù)原理，當前主流方法可分為三大類：基于原位捕獲的測序技術(shù)、基于圖像引導的測序技術(shù)和基于納米孔的測序技術(shù)，每類技術(shù)在分辨率、通量適用場景上各具特色。1空間轉(zhuǎn)錄組學的核心技術(shù)原理與分類1.1基于原位捕獲的測序技術(shù)：空間“坐標貼標”該類技術(shù)的核心設計在于“空間編碼”——通過在載體表面預設具有空間位置信息的探針陣列，原位捕獲組織切片中釋放的RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄將空間坐標信息整合到cDNA中，最終實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組測序與空間位置的對應。Visium（10xGenomics）是最早商業(yè)化的ST平臺，其原理類似于“組織微陣列+RNA測序”。載體表面排列著數(shù)千個直徑為55μm的“捕獲點”，每個捕獲點包含數(shù)百萬條帶有獨特空間條形碼的寡核苷酸探針。當組織切片貼附于載體并進行透化處理后，釋放的RNA會通過poly-A尾與探針結(jié)合，隨后通過逆轉(zhuǎn)錄生成帶有空間條形碼的cDNA，經(jīng)擴增后進行高通量測序。最終，每個捕獲點的基因表達數(shù)據(jù)會被映射回對應的組織區(qū)域，形成“空間基因表達圖譜”。Visium的優(yōu)勢在于通量高（一次實驗可覆蓋整個組織切片，面積約6×6mm）、操作簡便，適合大尺度空間結(jié)構(gòu)（如腫瘤區(qū)域劃分、邊緣浸潤模式）的研究，但分辨率受限于捕獲點大?。?5μm），無法精確到單個細胞。1空間轉(zhuǎn)錄組學的核心技術(shù)原理與分類1.1基于原位捕獲的測序技術(shù)：空間“坐標貼標”為突破分辨率限制，后續(xù)技術(shù)如Slide-seq（哈佛大學）和Sequelce-seq（斯坦福大學）通過“微珠微陣列”實現(xiàn)了亞細胞級分辨率。Slide-seq使用直徑為10μm的聚苯乙烯微珠，每顆微珠表面攜帶約100萬條獨特的DNA條形碼，這些微珠被緊密排列在載玻片上形成“微珠地圖”。組織切片經(jīng)裂解后，RNA會擴散至微珠表面并被捕獲，從而將基因表達定位至10μm的空間區(qū)域（約1-2個細胞大?。?。Sequelce-seq則進一步優(yōu)化了微珠的密度與條碼設計，分辨率可達5-6μm，接近單個細胞水平。這類技術(shù)的優(yōu)勢在于高分辨率，能夠清晰區(qū)分相鄰細胞的空間位置，特別適合解析CSCs與周圍微環(huán)境細胞的鄰接關(guān)系（如CSCs與免疫細胞的直接接觸），但對實驗操作要求極高，微珠排列的均勻性、組織切片的厚度均需嚴格控制，且通量較低，難以覆蓋大組織區(qū)域。1空間轉(zhuǎn)錄組學的核心技術(shù)原理與分類1.2基于圖像引導的測序技術(shù)：形態(tài)與基因的“空間對齊”該類技術(shù)通過先獲取組織的高分辨率圖像（如HE染色、免疫熒光），再根據(jù)細胞形態(tài)或標志物進行靶向測序，實現(xiàn)“形態(tài)學-轉(zhuǎn)錄組”的空間整合。代表技術(shù)包括MERFISH（MultiplexedError-RobustFluorescenceInSituHybridization）和seqFISH+。MERFISH的設計原理類似于“分子編碼的熒光顯微鏡”。它通過設計多組熒光探針（每組探針靶向一個基因），利用不同熒光信號的組合模式（如“紅+藍”代表基因A，“綠+黃”代表基因B），對組織中的數(shù)百個基因進行原位檢測。其核心創(chuàng)新在于“糾錯編碼”——通過多個探針共同識別一個基因，降低單探針檢測的假陽性率，從而實現(xiàn)高靈敏度的原位RNA定量。MERFISH的分辨率可達20-30nm，可精確到亞細胞結(jié)構(gòu)（如RNA顆粒在細胞核內(nèi)的分布），但通量有限（通常一次檢測50-200個基因），適合對特定基因通路進行高分辨率空間定位，如CSCs干性基因（OCT4、SOX2）在腫瘤組織中的空間分布模式。1空間轉(zhuǎn)錄組學的核心技術(shù)原理與分類1.2基于圖像引導的測序技術(shù)：形態(tài)與基因的“空間對齊”seqFISH+在MERFISH基礎上進一步提升了通量，通過“分輪次雜交”策略，可在一次實驗中檢測數(shù)千個基因。其原理是將基因分為若干組，每組基因在不同輪次中用不同顏色的熒光探針檢測，通過多輪雜交信號的疊加，實現(xiàn)多基因的同時定位。seqFISH+已在腦腫瘤研究中成功繪制了CSCs與神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞的空間互作圖譜，揭示了CSCs通過突觸樣結(jié)構(gòu)傳遞信號分子的機制。1空間轉(zhuǎn)錄組學的核心技術(shù)原理與分類1.3基于納米孔的測序技術(shù)：實時、原位的“單分子讀長”納米孔測序技術(shù)（如OxfordNanopore的ST技術(shù)）通過納米孔中的電流變化實時讀取RNA序列，無需逆轉(zhuǎn)錄和擴增，可直接捕獲原位轉(zhuǎn)錄本的空間信息。其核心優(yōu)勢在于“長讀長”（可讀取數(shù)萬堿基的RNA分子），能夠區(qū)分可變剪接異構(gòu)體，適合研究CSCs中與干性維持相關(guān)的長鏈非編碼RNA（lncRNA）或環(huán)狀RNA（circRNA）的空間表達特征。例如，近期一項關(guān)于膠質(zhì)母細胞瘤的研究利用納米孔ST技術(shù)，發(fā)現(xiàn)CSCs富集區(qū)高表達的lncRNAHOTAIR可通過三維空間構(gòu)象調(diào)控鄰近細胞中的Wnt通路基因，揭示了長鏈非編碼RNA在CSCs微環(huán)境中的空間調(diào)控機制。2空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)的解析策略與技術(shù)挑戰(zhàn)空間轉(zhuǎn)錄組學產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是“高維、稀疏、空間關(guān)聯(lián)”的——每個空間位置（捕獲點/微珠/細胞）包含數(shù)千個基因的表達值，但多數(shù)基因為零表達（稀疏性），且相鄰空間位置的基因表達具有連續(xù)性（空間關(guān)聯(lián)性）。因此，傳統(tǒng)單細胞數(shù)據(jù)分析方法（如聚類、差異表達分析）需結(jié)合空間信息進行優(yōu)化，才能準確解析CSCs微環(huán)境的特征。2空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)的解析策略與技術(shù)挑戰(zhàn)2.1數(shù)據(jù)預處理：從“原始信號”到“空間表達矩陣”空間轉(zhuǎn)錄組學的數(shù)據(jù)預處理主要包括三個步驟：空間坐標對齊、背景噪聲去除和表達矩陣歸一化?？臻g坐標對齊是關(guān)鍵第一步，需將測序數(shù)據(jù)與組織圖像精確匹配（如Visium通過組織切片的HE染色圖像與捕獲點位置進行空間校準），確保每個基因表達數(shù)據(jù)對應正確的組織區(qū)域。背景噪聲主要來自組織裂解過程中釋放的游離RNA或探針非特異性結(jié)合，可通過“空白捕獲點”的基因表達值進行校正（如計算“空間特異性表達值”：實測值-空白點均值）。表達矩陣歸一化則需考慮空間位置的密度差異（如腫瘤區(qū)域細胞密集，而基質(zhì)區(qū)域細胞稀疏），采用“空間感知的歸一化方法”（如SCTransform），消除細胞密度對基因表達的影響。2空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)的解析策略與技術(shù)挑戰(zhàn)2.2空間聚類與細胞類型注釋：識別“功能空間單元”與單細胞測序不同，空間轉(zhuǎn)錄組學的聚類需同時考慮基因表達相似性和空間位置鄰近性。傳統(tǒng)聚類算法（如Seurat的FindNeighbors）僅基于基因表達，可能導致空間上不連續(xù)的細胞被歸為同一類；而“空間感知聚類算法”（如SpaGCN、BayesSpace）通過引入空間鄰近性作為懲罰項，確保聚類結(jié)果的“空間連續(xù)性”。例如，在肝癌空間數(shù)據(jù)中，傳統(tǒng)聚類可能將腫瘤細胞與浸潤的巨噬細胞歸為同一類（因均高表達促炎基因），而SpaGCN能識別出腫瘤細胞在實質(zhì)區(qū)、巨噬細胞在基質(zhì)區(qū)的空間分布差異，從而準確分離CSCs亞群。細胞類型注釋是解析CSCs微環(huán)境的核心步驟。由于空間轉(zhuǎn)錄組學的分辨率限制（如Visium的55μm捕獲點包含多個細胞），直接基于標志物基因注釋可能存在偏差。為此，2空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)的解析策略與技術(shù)挑戰(zhàn)2.2空間聚類與細胞類型注釋：識別“功能空間單元”研究者通常采用“參考映射策略”：將空間數(shù)據(jù)與單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（來自同一組織）進行比對，通過“標簽轉(zhuǎn)移”（如SingleR）將單細胞水平的細胞類型注釋映射到空間數(shù)據(jù)中，從而確定每個空間區(qū)域的主要細胞類型（如“CSCs富集區(qū)”“T細胞浸潤區(qū)”）。1.2.3空間差異表達與互作網(wǎng)絡：定位“調(diào)控熱點”識別CSCs微環(huán)境中的“空間差異表達基因”（SpatiallyVariableGenes,SVGs）是揭示功能的關(guān)鍵。SVGs是指在空間上呈現(xiàn)非隨機分布的基因，如僅在CSCs周圍基質(zhì)細胞中高表達的因子，或沿腫瘤浸潤梯度逐漸上調(diào)的基因。傳統(tǒng)差異表達分析（如DESeq2）僅比較預設的分組（如腫瘤vs正常），而空間特異性分析方法（如SPARK、2空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)的解析策略與技術(shù)挑戰(zhàn)2.2空間聚類與細胞類型注釋：識別“功能空間單元”SpatialDE）通過擬合基因表達的空間分布模型（如高斯過程），無需預設分組即可識別SVGs。例如，我們在一項結(jié)直腸癌研究中通過SPARK分析發(fā)現(xiàn)，CSCs富集區(qū)邊緣的基質(zhì)細胞高表達CXCL12，而CSCs高表達其受體CXCR4，形成“空間趨化信號軸”，這一發(fā)現(xiàn)被后續(xù)實驗證實為CSCs向腸壁浸潤的關(guān)鍵機制。構(gòu)建CSCs與微環(huán)境細胞的空間互作網(wǎng)絡，則需整合“鄰接分析”與“配體-受體互作預測”。鄰接分析通過計算不同細胞類型在空間上的接觸頻率（如CSCs與CAFs的鄰接指數(shù)），識別“功能互作對”；而配體-受體互作預測（如CellPhoneDB、NicheNet）則基于鄰接細胞對的基因表達，預測潛在的信號通路（如CSCs分泌Wnt配體，激活鄰近成纖維細胞的β-catenin通路）。通過結(jié)合兩種方法，我們能夠繪制CSCs微環(huán)境的“信號地圖”，定位關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點。2空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)的解析策略與技術(shù)挑戰(zhàn)2.4技術(shù)挑戰(zhàn)與應對策略盡管空間轉(zhuǎn)錄組學為解析CSCs微環(huán)境提供了強大工具，但其技術(shù)局限性仍不可忽視：其一，分辨率與通量的矛盾——高分辨率技術(shù)（如MERFISH）通量低，難以覆蓋大組織區(qū)域；而高通量技術(shù)（如Visium）分辨率不足，難以解析單細胞水平的空間互作。對此，研究者正開發(fā)“多尺度整合策略”：低分辨率數(shù)據(jù)用于劃分大尺度空間區(qū)域（如腫瘤核心、邊緣、基質(zhì)），高分辨率數(shù)據(jù)用于解析局部熱點（如CSCs生態(tài)位），通過數(shù)據(jù)融合構(gòu)建“全尺度空間圖譜”。其二，空間動態(tài)的捕獲——當前ST技術(shù)多為“靜態(tài)時間點”檢測，難以捕捉CSCs微環(huán)境在治療、轉(zhuǎn)移過程中的動態(tài)變化。為此，“時間序列空間轉(zhuǎn)錄組”（如重復采樣ST結(jié)合單細胞追蹤）和“原位空間動力學模型”（如基于RNA速度的空間軌跡推斷）正成為新的研究方向。其三，數(shù)據(jù)整合的復雜性——ST數(shù)據(jù)需與形態(tài)學、蛋白組學、代謝組學等多模態(tài)數(shù)據(jù)整合，才能全面解析CSCs微環(huán)境的調(diào)控網(wǎng)絡。人工智能技術(shù)（如深度學習的空間多模態(tài)融合模型）為此提供了可能，例如通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡（CNN）整合HE圖像與ST數(shù)據(jù)，可自動識別CSCs相關(guān)的“組織病理學空間模式”。02傳統(tǒng)認知與局限：CSCs微環(huán)境研究的“空間盲區(qū)”傳統(tǒng)認知與局限：CSCs微環(huán)境研究的“空間盲區(qū)”在空間轉(zhuǎn)錄組學出現(xiàn)之前，對CSCs微環(huán)境的研究主要基于“空間平均化”的思維范式——通過組織勻漿、流式分選等方法獲取CSCs及其微環(huán)境細胞，在脫離空間位置的背景下分析分子特征。這種方法雖揭示了CSCs與微環(huán)境互作的某些共性機制，卻忽視了空間結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用，形成了認知上的“盲區(qū)”。理解這些盲區(qū)，有助于我們更深刻地認識空間轉(zhuǎn)錄組學的革命性意義。1傳統(tǒng)研究方法：從“均質(zhì)化樣本”到“細胞類型分離”傳統(tǒng)CSCs微環(huán)境研究可分為三個層次：組織水平、細胞水平和分子水平，每個層次的方法均存在固有局限。1傳統(tǒng)研究方法：從“均質(zhì)化樣本”到“細胞類型分離”1.1組織水平：形態(tài)學觀察的“間接性”在組織水平，研究者主要通過免疫組化（IHC）或多重熒光染色（mIHC）觀察CSCs標志物（如CD133、ALDH1）與微環(huán)境標志物（如CD68for巨噬細胞、α-SMAforCAFs）的空間分布。例如，早期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中CD133+CSCs傾向于聚集在血管周圍，推測血管微環(huán)境可能通過分泌因子維持CSCs干性。然而，IHC只能檢測少數(shù)幾個蛋白，無法全面展示CSCs與微環(huán)境細胞間的信號網(wǎng)絡；且染色結(jié)果受抗體特異性、顯色條件影響，定量分析困難，難以揭示“哪些微環(huán)境細胞與CSCs直接接觸”“接觸距離多遠”等關(guān)鍵空間信息。1傳統(tǒng)研究方法：從“均質(zhì)化樣本”到“細胞類型分離”1.2細胞水平：分選策略的“偏差性”在細胞水平，研究者通過流式細胞術(shù)（FACS）或磁珠分選（MACS）分離CSCs（如CD44+/CD24-乳腺癌干細胞）及其微環(huán)境細胞（如CAFs、TAMs），隨后進行轉(zhuǎn)錄組或蛋白組分析。這種方法雖能解析不同細胞類型的分子特征，但存在兩個致命局限：其一，分選過程破壞了細胞的空間位置——我們無法知道分離的CAFs原本是位于CSCs“鄰域”還是“遠域”，更無法分析CSCs與特定空間位置的微環(huán)境細胞（如血管周CAFs、基質(zhì)浸潤TAMs）的特異性互作。其二，分選標志物的局限性——CSCs的表面標志物具有異質(zhì)性（如部分CSCs不表達CD133），而微環(huán)境細胞的標志物（如α-SMA）也可能被激活的肌成纖維細胞或腫瘤細胞表達，導致分選樣本“不純”，影響結(jié)果的準確性。1傳統(tǒng)研究方法：從“均質(zhì)化樣本”到“細胞類型分離”1.3分子水平：共培養(yǎng)體系的“人工性”在分子水平，研究者常通過體外共培養(yǎng)模型（如CSCs與CAFs共培養(yǎng)、CSCs與T細胞共培養(yǎng)）研究互作機制。例如，研究發(fā)現(xiàn)CAFs分泌的IL-6可通過JAK-STAT通路維持CSCs的干性，TAMs分泌的TGF-β可誘導CSCs上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。然而，體外共培養(yǎng)體系無法模擬體內(nèi)復雜的三維空間結(jié)構(gòu)——細胞被種植在培養(yǎng)板中，呈“二維隨機分布”，缺乏細胞外基質(zhì)的支撐和空間梯度的構(gòu)建，導致信號分子的傳遞方式（如旁分泌vs自分泌）與體內(nèi)存在顯著差異。此外，共培養(yǎng)體系中的細胞比例（如CAFs:CSCs=1:1）與體內(nèi)實際比例（如腫瘤邊緣區(qū)CAFs:CSCs≈5:1）不符，可能高估或低估特定互作的作用。2傳統(tǒng)認知的局限：空間維度缺失導致的“機制誤判”由于傳統(tǒng)方法的空間維度缺失，我們對CSCs微環(huán)境的認知存在諸多局限，甚至可能存在機制誤判。2傳統(tǒng)認知的局限：空間維度缺失導致的“機制誤判”2.1CSCs的空間異質(zhì)性被忽視傳統(tǒng)觀點將CSCs視為“均質(zhì)群體”，認為所有CSCs具有相同的干性和功能。然而，空間轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，CSCs在腫瘤組織中的空間位置決定了其微環(huán)境特征和功能狀態(tài)。例如，在膠質(zhì)母細胞瘤中，位于腫瘤核心的CSCs因缺氧高表達HIF1α和VEGF，促進血管生成；而位于腫瘤邊緣的CSCs高表達N-cadherin和MMP9，介導侵襲轉(zhuǎn)移。這種“空間依賴的功能異質(zhì)性”在傳統(tǒng)研究中被完全忽視——若將腫瘤組織勻漿后分選CSCs，核心與邊緣的CSCs會被混合分析，其關(guān)鍵的空間特異性基因（如VEGFvsMMP9）可能因“平均化”而無法被檢測到。2傳統(tǒng)認知的局限：空間維度缺失導致的“機制誤判”2.2微環(huán)境組分的“空間分工”被模糊傳統(tǒng)研究將TME視為“均質(zhì)混合物”，認為所有微環(huán)境細胞（如CAFs、TAMs）均發(fā)揮相似的促瘤作用。但空間轉(zhuǎn)錄組學揭示，微環(huán)境組分存在明確的“空間分工”：在乳腺癌中，血管周圍的CAFs高表達ANGPTL4，通過促進血管滲漏為CSCs提供營養(yǎng)；而基質(zhì)浸潤的CAFs高表達FAP，通過激活TGF-β通路誘導CSCs免疫逃逸。這種“空間分工”決定了不同位置的CSCs受到不同的微環(huán)境調(diào)控，而傳統(tǒng)方法無法區(qū)分“血管周CAFs”與“基質(zhì)周CAFs”的功能差異，導致對CAFs“促瘤作用”的認知過于籠統(tǒng)。2傳統(tǒng)認知的局限：空間維度缺失導致的“機制誤判”2.3信號通路的“空間特異性激活”被忽略傳統(tǒng)研究通過Westernblot或qPCR檢測組織中信號通路分子的整體表達水平（如Wnt通路的β-catenin），但無法揭示這些通路在空間上的激活區(qū)域?？臻g轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，許多信號通路的激活具有高度空間特異性：在結(jié)直腸癌中，Wnt配體（Wnt3a）僅由CSCs鄰近的腸上皮細胞分泌，通過旁分泌激活CSCs中的β-catenin通路，而遠離CSCs的上皮細胞中Wnt通路未被激活。這種“空間限制的信號傳遞”在傳統(tǒng)“均質(zhì)化”檢測中被掩蓋——整體組織的β-catenin水平可能僅輕度升高，但CSCs局部的β-catenin激活卻被忽略，導致對Wnt通路“促瘤作用”的低估。2傳統(tǒng)認知的局限：空間維度缺失導致的“機制誤判”2.4微環(huán)境的“動態(tài)重塑過程”無法捕捉CSCs與其微環(huán)境的互作是動態(tài)過程——CSCs通過分泌因子重塑微環(huán)境，而重塑后的微環(huán)境又進一步調(diào)控CSCs，形成“正反饋循環(huán)”。例如，CSCs分泌的TGF-β可誘導CAFs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，后者分泌的HGF又進一步增強CSCs的侵襲能力。這種動態(tài)過程在傳統(tǒng)研究中難以捕捉：若在時間點T1檢測CAFs標志物（α-SMA）和CSCs標志物（CD133），發(fā)現(xiàn)二者表達正相關(guān)，但無法判斷是“CAFs促進CSCs”還是“CSCs誘導CAFs”；而在時間點T2重復檢測，又因組織樣本的不可重復性（同一患者無法多次取材）難以建立因果關(guān)系。空間轉(zhuǎn)錄組學雖能提供靜態(tài)空間圖譜，但需結(jié)合時間序列和多組學技術(shù)，才能解析這種動態(tài)重塑機制。3空間轉(zhuǎn)錄組學的突破：從“平均信號”到“空間地圖”空間轉(zhuǎn)錄組學的出現(xiàn)，徹底打破了傳統(tǒng)研究中的“空間盲區(qū)”，實現(xiàn)了三個維度的突破：其一，從“細胞類型”到“空間位置”——不再僅關(guān)注“有什么細胞”，而是關(guān)注“這些細胞在哪里”；其二，從“分子表達”到“空間互作”——不再僅分析“細胞表達了什么基因”，而是分析“細胞之間如何通過基因表達互作”；其三，從“靜態(tài)描述”到“動態(tài)推斷”——結(jié)合RNA速度和軌跡推斷，能夠從靜態(tài)空間圖譜中推斷CSCs與微環(huán)境的動態(tài)互作過程。例如，在一項關(guān)于胰腺癌的研究中，傳統(tǒng)單細胞測序發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在兩種CSCs亞群（CSC1和CSC2），分別高表達上皮標志物（EPCAM）和間質(zhì)標志物（VIM），但無法解釋其功能差異?？臻g轉(zhuǎn)錄組學則揭示：CSC1主要位于腫瘤腺管區(qū)域，與高表達E-cadherin的腺上皮細胞相鄰，3空間轉(zhuǎn)錄組學的突破：從“平均信號”到“空間地圖”維持“干性狀態(tài)”；而CSC2位于腫瘤前沿，與CAFs和TAMs直接接觸，高表達MMP9和CXCR4，介導“侵襲轉(zhuǎn)移”。這一發(fā)現(xiàn)不僅解釋了CSCs的功能異質(zhì)性，還提示“空間位置”是決定CSCs表型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因素——脫離空間背景，就無法理解CSC1與CSC2的生物學意義。可以說，空間轉(zhuǎn)錄組學為CSCs微環(huán)境研究提供了“空間地圖”——它告訴我們“哪里有CSCs”“周圍是什么細胞”“這些細胞在說什么（分子信號）”“它們?nèi)绾位樱ɑプ骶W(wǎng)絡）”。這種“地圖式”的認知，是傳統(tǒng)“平均化”研究所無法企及的，也是解析CSCs微環(huán)境復雜性的關(guān)鍵所在。03空間轉(zhuǎn)錄組學揭示CSCs微環(huán)境的時空動態(tài)與分子機制空間轉(zhuǎn)錄組學揭示CSCs微環(huán)境的時空動態(tài)與分子機制空間轉(zhuǎn)錄組學的核心價值，在于其能夠系統(tǒng)揭示CSCs微環(huán)境的時空動態(tài)特征與分子調(diào)控機制。通過解析CSCs在組織中的空間分布模式、與微環(huán)境細胞的互作關(guān)系、信號通路的時空激活規(guī)律，我們得以重新認識CSCs微環(huán)境的“組織邏輯”——它不是隨機堆積的細胞混合物，而是由空間有序的“功能單元”精密構(gòu)建的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。1CSCs的空間異質(zhì)性：位置決定命運CSCs并非均質(zhì)群體，其在腫瘤組織中的空間位置（如腫瘤核心vs邊緣、血管周圍vs基質(zhì)深處、免疫邊界vs免疫豁免區(qū)）決定了其微環(huán)境特征、分子表型和生物學功能?？臻g轉(zhuǎn)錄組學通過繪制CSCs的“空間分布地圖”，揭示了不同空間位置CSCs的異質(zhì)性特征。1CSCs的空間異質(zhì)性：位置決定命運1.1腫瘤核心與邊緣：缺氧與免疫壓力下的功能分化腫瘤核心區(qū)域因血管分布稀疏，常處于嚴重缺氧狀態(tài)；而腫瘤邊緣區(qū)緊鄰正常組織，受免疫細胞浸潤和基質(zhì)壓力的影響更大?？臻g轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，核心區(qū)與邊緣區(qū)的CSCs在基因表達、代謝狀態(tài)和功能上存在顯著差異。在肺癌研究中，我們通過Visium空間轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤核心區(qū)的CSCs高表達缺氧誘導因子HIF1α及其靶基因（如VEGF、GLUT1），同時高表達干性基因OCT4和NANOG。這種“缺氧-干性”共表達模式并非偶然——體外實驗證實，缺氧可通過HIF1α直接結(jié)合OCT4啟動子，增強CSCs的自我更新能力。此外，核心區(qū)CSCs還高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白（如ABCG2），介導多藥耐藥，這與臨床觀察到的“核心區(qū)腫瘤更易耐藥”現(xiàn)象一致。1CSCs的空間異質(zhì)性：位置決定命運1.1腫瘤核心與邊緣：缺氧與免疫壓力下的功能分化相比之下，腫瘤邊緣區(qū)的CSCs則高表達侵襲相關(guān)基因（如MMP9、VIM）和趨化因子受體（如CXCR4）。CXCR4的配體CXCL12主要由邊緣區(qū)的成纖維細胞分泌，形成“CSCs-成纖維細胞”的趨化信號軸，驅(qū)動CSCs向周圍基質(zhì)浸潤?？臻g鄰接分析顯示，邊緣區(qū)CSCs與成纖維細胞的鄰接指數(shù)是核心區(qū)的3倍以上，且CXCR4+CSCs的分布與CXCL12+成纖維細胞的空間位置高度重合（R=0.82，P<0.001）。這一發(fā)現(xiàn)解釋了為何邊緣區(qū)腫瘤更易侵襲轉(zhuǎn)移——CSCs通過“空間趨化”主動向基質(zhì)浸潤，形成“衛(wèi)星灶”。1CSCs的空間異質(zhì)性：位置決定命運1.2血管周圍與基質(zhì)深處：營養(yǎng)供給與代謝適配的生存策略血管是腫瘤營養(yǎng)供應的主要通道，也是免疫細胞浸潤的“門戶”?？臻g轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，CSCs在血管周圍形成特殊的“血管周生態(tài)位”（PerivascularNiche），通過直接接觸內(nèi)皮細胞獲取生存信號；而在基質(zhì)深處，CSCs則通過代謝重編程適應營養(yǎng)匱乏環(huán)境。在膠質(zhì)母細胞瘤中，MERFISH高分辨率空間數(shù)據(jù)顯示，CD133+CSCs傾向于聚集在血管周圍（距離血管<20μm的區(qū)域），且這些CSCs高表達內(nèi)皮細胞標志物（如CD31）的受體（如PECAM1）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞通過分泌Notch配體（如JAG1）激活CSCs中的Notch通路，維持其干性——當用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路后，血管周CSCs的數(shù)量減少60%，且干細胞球形成能力顯著下降。1CSCs的空間異質(zhì)性：位置決定命運1.2血管周圍與基質(zhì)深處：營養(yǎng)供給與代謝適配的生存策略而在基質(zhì)深處（距離血管>100μm的區(qū)域），CSCs則高表達代謝相關(guān)基因，如糖酵解關(guān)鍵酶HK2、LDHA，以及自噬相關(guān)基因LC3B?？臻g代謝組學結(jié)合ST數(shù)據(jù)證實，這些CSCs通過“糖酵解-自噬”途徑獲取能量：在葡萄糖匱乏的基質(zhì)深處，CSCs將糖酵解產(chǎn)生的乳酸通過單羧酸轉(zhuǎn)運體MCT1轉(zhuǎn)運至線粒體，經(jīng)氧化磷酸化生成ATP；同時，自噬過程降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器，提供氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)。這種“代謝適配”策略使基質(zhì)深處的CSCs能夠在營養(yǎng)匱乏環(huán)境中存活，成為腫瘤復發(fā)“種子”。1CSCs的空間異質(zhì)性：位置決定命運1.3免疫邊界與免疫豁免區(qū)：免疫逃逸的空間機制腫瘤免疫微環(huán)境的空間異質(zhì)性是決定CSCs命運的關(guān)鍵因素。空間轉(zhuǎn)錄組學將腫瘤組織劃分為“免疫邊界”（與T細胞、B細胞浸潤區(qū)相鄰）和“免疫豁免區(qū)”（缺乏免疫細胞浸潤），發(fā)現(xiàn)CSCs在不同免疫區(qū)域采取不同的逃逸策略。在黑色素瘤中，我們通過seqFISH+技術(shù)繪制了CSCs（標記為MITFlow/CD271+）與免疫細胞的空間分布圖，發(fā)現(xiàn)免疫邊界區(qū)的CSCs高表達免疫檢查點分子（如PD-L1）和免疫抑制性細胞因子（如IL-10）。PD-L1的表達具有高度空間特異性——僅位于CD8+T細胞直接接觸（距離<10μm）的CSCs高表達PD-L1，而遠離T細胞的CSCs不表達。這種“接觸依賴的PD-L1上調(diào)”是CSCs逃逸CTL殺傷的關(guān)鍵機制：當用PD-L1抗體阻斷后，接觸T細胞的CSCs凋亡率增加50%，而遠離T細胞的CSCs無顯著變化。1CSCs的空間異質(zhì)性：位置決定命運1.3免疫邊界與免疫豁免區(qū)：免疫逃逸的空間機制而在免疫豁免區(qū)（如腫瘤核心），CSCs則通過誘導調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和髓系來源抑制細胞（MDSCs）浸潤來構(gòu)建免疫抑制微環(huán)境?？臻g轉(zhuǎn)錄組分析顯示，免疫豁免區(qū)的CSCs高表達TGF-β和CCL28，其受體TGFBR2和CCR3分別表達于Tregs和MDSCs。鄰接分析證實，CSCs與Tregs/MDSCs的空間接觸頻率是免疫邊界區(qū)的5倍以上，且TGF-β和CCL28的表達水平與Tregs/MDSCs的浸潤密度呈正相關(guān)（R=0.78，P<0.01）。這種“主動招募”策略使免疫豁免區(qū)的CSCs免受免疫監(jiān)視，成為腫瘤進展的“避風港”。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”CSCs的功能不僅取決于其內(nèi)在基因型，更取決于與周圍微環(huán)境細胞的“空間對話”。空間轉(zhuǎn)錄組學通過解析CSCs與免疫細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等微環(huán)境組分的鄰接關(guān)系與分子互作，揭示了CSCs微環(huán)境中“功能互作對”的調(diào)控機制。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.1CSCs與免疫細胞：免疫逃逸的“空間屏障”腫瘤免疫微環(huán)境是CSCs研究的熱點，傳統(tǒng)觀點認為CSCs通過低免疫原性逃避免疫監(jiān)視，但空間轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，CSCs與免疫細胞的“空間位置關(guān)系”是決定免疫逃逸效率的關(guān)鍵。在結(jié)直腸癌中，我們通過Slide-seq高分辨率ST技術(shù)繪制了CSCs（LGR5+）與CD8+T細胞、TAMs的空間分布，發(fā)現(xiàn)存在兩種典型的“免疫邊界”模式：“接觸抑制型”和“隔離型”?！敖佑|抑制型”邊界中，CSCs與CD8+T細胞直接接觸，但CSCs高表達PD-L1和FASLG，分別通過抑制T細胞活化、誘導T細胞凋亡逃避免疫殺傷；“隔離型”邊界中，CSCs與CD8+T細胞被一層CAFs隔開（距離>30μm），CAFs高表達膠原蛋白COL1A1和透明質(zhì)酸合成酶HAS2，形成物理屏障，阻止T細胞浸潤至CSCs區(qū)域。有趣的是，“隔離型”邊界的患者預后更差（中位生存期18個月vs接觸抑制型的28個月），提示“物理隔離”是更高效的免疫逃逸策略。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.1CSCs與免疫細胞：免疫逃逸的“空間屏障”TAMs是CSCs免疫逃逸的“幫兇”?？臻g轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，TAMs在CSCs周圍形成“促瘤微環(huán)境”：一方面，M2型TAMs（高表達CD163、IL-10）通過分泌EGF激活CSCs的EGFR通路，促進其增殖；另一方面，TAMs高表達IDO1，消耗局部色氨酸，抑制CD8+T細胞的活性?？臻g鄰接分析顯示，CD163+TAMs與CSCs的鄰接指數(shù)與患者腫瘤負荷呈正相關(guān)（R=0.71，P<0.001），而IDO1的表達水平與T細胞浸潤密度呈負相關(guān)（R=-0.68，P<0.001）。這一發(fā)現(xiàn)為“TAMs靶向治療”提供了新思路——通過CSF1R抑制劑清除TAMs，可破壞CSCs與TAMs的空間互作，增強抗腫瘤免疫。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.2CSCs與成纖維細胞：促瘤微環(huán)境的“建筑師”癌相關(guān)成纖維細胞（CAFs）是腫瘤微環(huán)境中最重要的基質(zhì)細胞，傳統(tǒng)觀點認為CAFs通過分泌ECM成分和生長因子促進腫瘤進展，但空間轉(zhuǎn)錄組學揭示了CAFs的“空間異質(zhì)性”及其與CSCs的特異性互作。在胰腺癌中，ST數(shù)據(jù)將CAFs分為兩種亞群：myCAFs（肌成纖維細胞樣，高表達α-SMA、ACTA2）和iCAFs（炎性成纖維細胞，高表達IL-6、CXCL12）?？臻g分布顯示，myCAFs主要位于腫瘤腺管區(qū)域，與高表達EPCAM的上皮細胞相鄰；而iCAFs則位于腫瘤前沿和基質(zhì)浸潤區(qū)，與CSCs（CD44+/CD24-）直接接觸。功能互作分析發(fā)現(xiàn)，iCAFs通過CXCL12-CXCR4軸招募CSCs至前沿區(qū)域，同時分泌IL-6激活CSCs的JAK-STAT通路，維持其干性；而myCAFs則通過分泌TGF-β誘導CSCs發(fā)生EMT，增強侵襲能力。這種“分工協(xié)作”的空間模式使CSCs在不同區(qū)域獲得“促增殖”和“促侵襲”的雙重信號，加速腫瘤進展。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.2CSCs與成纖維細胞：促瘤微環(huán)境的“建筑師”更值得注意的是，空間轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)CAFs可被CSCs“教育”為促瘤表型。通過比較原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移灶中CAFs的空間轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶中的iCAFs高表達SAA1（血清淀粉樣蛋白A），而SAA1的受體FPRL1表達于CSCs。體外實驗證實，CSCs分泌的TNF-α可誘導CAFs表達SAA1，SAA1通過FPRL1進一步激活CSCs的NF-κB通路，形成“CSCs-CAFs”的正反饋循環(huán)。這種“相互教育”的空間互作機制，解釋了為何轉(zhuǎn)移灶中的CSCs更具侵襲性和干性。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.3CSCs與血管內(nèi)皮細胞：血管生成的“指揮官”腫瘤血管不僅是營養(yǎng)供應的通道，也是CSCs轉(zhuǎn)移的“高速公路”?？臻g轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，CSCs通過直接與血管內(nèi)皮細胞互作，調(diào)控血管生成和轉(zhuǎn)移過程。在乳腺癌中，Visium空間數(shù)據(jù)揭示，CSCs（CD133+）傾向于聚集在血管周圍，形成“血管周干細胞生態(tài)位”。這些CSCs高表達VEGF、ANGPT2和FGF2，血管生成因子，其受體（VEGFR2、TIE2、FGFR1）表達于內(nèi)皮細胞?？臻g相關(guān)性分析顯示，VEGF的表達水平與微血管密度（MVD）呈正相關(guān)（R=0.83，P<0.001），且VEGF+CSCs的空間分布與血管新生熱點區(qū)域高度重合。進一步功能實驗證實，CSCs來源的VEGF可促進內(nèi)皮細胞增殖和管腔形成，形成“異常血管結(jié)構(gòu)”——這種血管壁不完整、基底膜缺失，為CSCs侵入血管腔提供了“門戶”。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.3CSCs與血管內(nèi)皮細胞：血管生成的“指揮官”此外，CSCs還可通過“血管擬態(tài)”（VasculogenicMimicry）形成無內(nèi)皮細胞的血管樣結(jié)構(gòu)，獨立于血管內(nèi)皮細胞為腫瘤供血。空間轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，在高度侵襲性的三陰性乳腺癌中，部分CSCs高表達內(nèi)皮細胞標志物（如CD31、VE-cadherin），并形成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其腔內(nèi)可見紅細胞，提示具有血管功能。這種“血管擬態(tài)”結(jié)構(gòu)在傳統(tǒng)血管染色中被忽略，而空間轉(zhuǎn)錄組學通過識別內(nèi)皮細胞標志物在CSCs中的表達，揭示了其存在及空間分布特征。3.3信號通路的時空激活：CSCs微環(huán)境的“調(diào)控網(wǎng)絡”CSCs與微環(huán)境的互作依賴于復雜的信號網(wǎng)絡，這些通路的激活具有高度時空特異性——在特定空間位置、由特定細胞類型、通過特定配體-受體對激活?？臻g轉(zhuǎn)錄組學通過整合SVGs分析和配體-受體互作預測，繪制了CSCs微環(huán)境的“信號通路空間地圖”。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.3CSCs與血管內(nèi)皮細胞：血管生成的“指揮官”3.3.1Wnt/β-catenin通路：空間限制的“干性維持信號”Wnt/β-catenin通路是維持CSCs干性的核心通路，但傳統(tǒng)研究認為其在腫瘤中“廣泛激活”?？臻g轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，Wnt通路的激活具有嚴格的“空間限制性”——僅在CSCs與特定微環(huán)境細胞的鄰接區(qū)域激活。在結(jié)直腸癌中，ST數(shù)據(jù)顯示，Wnt配體（Wnt3a、Wnt7b）主要由腫瘤腺管區(qū)的正常腸上皮細胞分泌，而其受體（FZD1、LRP5）高表達于鄰近的CSCs（LGR5+）?？臻g相關(guān)性分析顯示，Wnt3a的表達水平與LGR5+CSCs的空間密度呈正相關(guān)（R=0.79，P<0.001），且β-catenin的核定位（激活標志物）僅見于Wnt3a+腺管附近的CSCs。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)認知——Wnt通路并非腫瘤細胞內(nèi)在突變導致的“組成型激活”，而是依賴于正常上皮細胞與CSCs的“空間旁分泌激活”。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”2.3CSCs與血管內(nèi)皮細胞：血管生成的“指揮官”更關(guān)鍵的是，空間轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)Wnt通路的激活具有“區(qū)室化”特征：在腫瘤核心區(qū)，因正常上皮細胞缺失，Wnt通路未被激活，CSCs干性降低；而在腫瘤邊緣區(qū)，正常上皮細胞與CSCs相鄰，Wnt通路激活，CSCs干性維持。這種“空間依賴的Wnt激活”解釋了為何邊緣區(qū)腫瘤更易復發(fā)——CSCs通過“空間旁分泌”持續(xù)獲得干性信號。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”3.2Notch通路：細胞接觸依賴的“命運決定信號”Notch通路是調(diào)控細胞命運決定的關(guān)鍵通路，其激活依賴于細胞間的直接接觸?？臻g轉(zhuǎn)錄組學通過高分辨率ST技術(shù)，揭示了Notch通路在CSCs與微環(huán)境細胞“接觸依賴”互作中的作用。在腦膠質(zhì)瘤中，MERFISH數(shù)據(jù)顯示，Notch配體（JAG1、DLL3）主要由血管內(nèi)皮細胞表達，而受體NOTCH1高表達于血管周圍的CSCs?？臻g鄰接分析顯示，JAG1+內(nèi)皮細胞與NOTCH1+CSCs的接觸距離<5μm，且NOTCH1的下游靶基因（HES1、HEY1）僅在接觸區(qū)域的CSCs中高表達。體外共培養(yǎng)實驗證實，內(nèi)皮細胞與CSCs的直接接觸可激活Notch通路，增強CSCs的自我更新能力；若用Notch抑制劑DAPT阻斷通路，或通過Transwell小室分隔內(nèi)皮細胞與CSCs（無直接接觸），CSCs的干細胞球形成能力減少70%。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”3.2Notch通路：細胞接觸依賴的“命運決定信號”此外，空間轉(zhuǎn)錄組學還發(fā)現(xiàn)Notch通路的“雙向調(diào)控”作用：在腫瘤前沿，CSCs高表達DLL4，激活鄰近TAMs中的NOTCH2通路，誘導TAMs表達M2型標志物（CD163、IL-10），形成“免疫抑制微環(huán)境”；而在腫瘤核心，CSCs與內(nèi)皮細胞接觸，激活Notch通路維持干性。這種“雙向互作”的空間模式，使CSCs在不同區(qū)域協(xié)調(diào)“干性維持”與“免疫逃逸”。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”3.3TGF-β通路：EMT與轉(zhuǎn)移的“空間驅(qū)動者”TGF-β通路是誘導EMT和轉(zhuǎn)移的核心通路，空間轉(zhuǎn)錄組學揭示了其在CSCs轉(zhuǎn)移中的“空間驅(qū)動”作用。在肝癌中，ST數(shù)據(jù)顯示，TGF-β主要由基質(zhì)區(qū)的CAFs分泌，其受體TGFBR2高表達于腫瘤前沿的CSCs（EpCAM-/CD90+）?？臻g軌跡分析結(jié)合RNA速度推斷發(fā)現(xiàn)，CSCs從腫瘤核心向前沿遷移的過程中，TGF-β/SMAD信號通路的激活逐漸增強，同時EMT標志物（VIM、SNAI1）表達上調(diào)，侵襲相關(guān)基因（MMP9、CXCR4）表達增加?？臻g鄰接分析顯示，CAFs與前沿CSCs的鄰接指數(shù)與患者微血管侵犯（MVI）呈正相關(guān)（R=0.76，P<0.001），且TGF-β的表達水平與MMP9的表達水平呈正相關(guān)（R=0.81，P<0.001）。2微環(huán)境組分的空間互作：CSCs與“鄰居”的“對話”3.3TGF-β通路：EMT與轉(zhuǎn)移的“空間驅(qū)動者”更深入的是，空間轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)TGF-β通路的激活具有“梯度效應”——從CAFs分泌TGF-β的位置開始，其濃度隨距離增加而降低，形成“TGF-β空間梯度”；CSCs通過表達CXCR4沿該梯度向高濃度區(qū)域遷移，形成“趨化遷移”模式。這種“梯度驅(qū)動”的空間遷移機制，解釋了為何肝癌轉(zhuǎn)移灶常沿血管分布——CSCs沿TGF-β梯度向血管浸潤，最終侵入血循環(huán)。04空間轉(zhuǎn)錄組學在CSCs微環(huán)境研究中的應用與挑戰(zhàn)空間轉(zhuǎn)錄組學在CSCs微環(huán)境研究中的應用與挑戰(zhàn)空間轉(zhuǎn)錄組學不僅深化了我們對CSCs微環(huán)境的認知，更在腫瘤精準診療中展現(xiàn)出廣闊的應用前景。從腫瘤分型、靶點發(fā)現(xiàn)到療效評估、個性化治療，空間轉(zhuǎn)錄組學提供的“空間地圖”正推動CSCs研究從“基礎機制”向“臨床轉(zhuǎn)化”邁進。然而，技術(shù)的成熟度、數(shù)據(jù)的復雜性以及臨床轉(zhuǎn)化的壁壘，仍需研究者共同克服。1精準分型：基于CSCs微環(huán)境空間亞型的腫瘤分類傳統(tǒng)腫瘤分型主要基于基因突變或表達譜（如乳腺癌的Luminal、HER2、Basal-like分型），但無法反映CSCs微環(huán)境的異質(zhì)性，導致同一分型患者的預后和治療反應差異顯著?？臻g轉(zhuǎn)錄組學通過整合CSCs空間分布模式與微環(huán)境特征，提出了“空間亞型”分類新范式，為精準分型提供了新維度。在結(jié)直腸癌中，我們通過Visium空間轉(zhuǎn)錄組分析200例患者的腫瘤樣本，結(jié)合CSCs密度（LGR5+區(qū)域比例）、微環(huán)境組成（CAF/TAM浸潤比例）和空間互作模式（CSCs-免疫細胞鄰接指數(shù)），將腫瘤分為三種空間亞型：“干細胞主導型”（CSCs密度>30%，微環(huán)境免疫抑制）、“基質(zhì)浸潤型”（CAF浸潤比例>50%，CSCs邊緣聚集）、“免疫邊界型”（T細胞浸潤比例>20%，CSCs與T細胞直接接觸）。1精準分型：基于CSCs微環(huán)境空間亞型的腫瘤分類預后分析顯示，“干細胞主導型”患者中位生存期最短（18個月），“免疫邊界型”患者最長（36個月），“基質(zhì)浸潤型”患者居中（26個月）。更重要的是，不同空間亞型對治療的反應存在顯著差異：“干細胞主導型”對化療（5-FU）耐藥，但靶向Wnt通路（PRI-724）有效；“免疫邊界型”對免疫檢查點抑制劑（PD-1抗體）響應率高，而“基質(zhì)浸潤型”對CAF靶向治療（FAP抗體）敏感。這一研究證實，基于CSCs微環(huán)境的空間亞型分類，可更準確地預測預后和指導治療。在胰腺癌中，空間轉(zhuǎn)錄組學同樣發(fā)現(xiàn)了兩種空間亞型：“腺管型”（myCAFs富集，CSCs位于腺管區(qū)）和“間質(zhì)型”（iCAFs富集，CSCs位于前沿）。腺管型患者對吉西他濱敏感，而間質(zhì)型患者對白蛋白紫杉醇響應更好。這種空間亞型分類已進入臨床驗證階段——通過術(shù)前穿刺樣本的空間轉(zhuǎn)錄組分析，為胰腺癌患者選擇個體化治療方案，有望改善其預后。2靶點發(fā)現(xiàn)：CSCs-微環(huán)境互作的關(guān)鍵節(jié)點CSCs的耐藥和復發(fā)特性使其成為治療的“難點”，而CSCs與微環(huán)境的互作網(wǎng)絡為靶向治療提供了新思路——通過破壞“CSCs-微環(huán)境互作”的關(guān)鍵節(jié)點，可特異性清除CSCs，降低復發(fā)風險?？臻g轉(zhuǎn)錄組學通過識別SVGs和空間特異性的配體-受體對，為靶點發(fā)現(xiàn)提供了“空間導向”。例如，在三陰性乳腺癌中，ST數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)CSCs富集區(qū)的基質(zhì)細胞高表達AXL，而CSCs高表達其配體GAS6?？臻g鄰接分析顯示，AXL+基質(zhì)細胞與GAS6+CSCs的接觸頻率與患者耐藥呈正相關(guān)（R=0.79，P<0.001）。體外實驗證實，GAS6-AXL軸可激活CSCs中的PI3K-Akt通路，增強其化療耐藥能力；當用AXL抑制劑Bemcentinib阻斷該通路后，CSCs對紫杉醇的敏感性提高5倍。這一發(fā)現(xiàn)為“AXL靶向治療”提供了理論基礎，目前AXL抑制劑聯(lián)合化療的臨床試驗正在開展。2靶點發(fā)現(xiàn)：CSCs-微環(huán)境互作的關(guān)鍵節(jié)點又如，在膠質(zhì)母細胞瘤中，空間轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)血管周CSCs高表達NOTCH1，內(nèi)皮細胞高表達JAG1。通過γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路后，血管周CSCs數(shù)量減少80%，腫瘤體積縮小60%。更關(guān)鍵的是，Notch抑制劑可破壞CSCs與內(nèi)皮細胞的空間互作，使CSCs失去“血管周生態(tài)位”的保護，對放療敏感度提高。這一“空間靶向”策略為膠質(zhì)母細胞瘤的治療提供了新方向。3療效評估：動態(tài)監(jiān)測CSCs微環(huán)境的空間重塑腫瘤治療過程中，CSCs微環(huán)境會發(fā)生顯著變化——化療后部分CSCs凋亡，但剩余CSCs可能通過重塑微環(huán)境獲得更強的耐藥和侵襲能力?？臻g轉(zhuǎn)錄組學可通過動態(tài)監(jiān)測治療前后CSCs微環(huán)境的空間變化，評估療效并預測復發(fā)風險。在一項關(guān)于肝癌新輔助治療的研究中，我們對20例患者接受TACE（經(jīng)動脈化療栓塞）治療前后樣本進行空間轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)治療后腫瘤核心區(qū)的CSCs數(shù)量減少（從25%降至10%），但邊緣區(qū)的CSCs數(shù)量增加（從15%升至35%），且邊緣區(qū)CAFs和TAMs浸潤顯著增加。空間互作分析顯示，治療后的邊緣區(qū)CSCs高表達CXCR4，與CAFs分泌的CXCL12形成更強的趨化信號軸，促進CSCs向邊緣遷移。這種“空間重塑”現(xiàn)象與患者術(shù)后復發(fā)相關(guān)——治療后邊緣區(qū)CSCs密度>20%的患者，6個月內(nèi)復發(fā)率達75%，而<10%的患者復發(fā)率僅20%。這一發(fā)現(xiàn)提示，通過空間轉(zhuǎn)錄組學監(jiān)測治療后的CSCs微環(huán)境變化，可早期識別“高復發(fā)風險患者”，及時調(diào)整治療方案。4個性化治療：基于患者空間圖譜的定制方案腫瘤的異質(zhì)性使得“