PROTEIN

ENGINEERING蛋白質工程21.全球生物制藥的市場快速增長，目前已達1970億美元，其中重組蛋白和抗體類藥物占絕大部分。2.截止到2012年，在歐洲或美國獲準上市的430多種生物藥品中，超過300種是重組蛋白和抗體藥物。3.據(jù)統(tǒng)計，截止2013年，超過900種基于蛋白和多肽類的藥物正處于研究和開發(fā)階段，用于治療超過100種疾病。生物制藥與蛋白質工程具備的知識基礎：分子生物學、分子遺傳學、生物化學、微生物學、細胞生物學、基因工程等蛋白質工程本課程共48學時：閉卷考試+課堂表現(xiàn)3課程的主要任務：1．掌握蛋白質工程的基本原理、基礎知識、基本技能2．熟悉蛋白質工程研究的主要方法和技術3．了解蛋白質工程領域的研究方向與最新科技成果蛋白質工程4第一章緒論第二章蛋白質結構基礎第三章蛋白質分子設計第四章蛋白質的修飾和表達第五章蛋白質的結構解析第六章蛋白質的分離與純化第七章蛋白質組學與生物信息學第八章蛋白工程的應用蛋白質工程5緒論教學內容：蛋白質工程的基本概念蛋白質工程的產生蛋白質工程的研究內容蛋白質工程的應用及意義6一、蛋白質工程的概念工程化：理念－設計－制造－功能實現(xiàn)

以蛋白質分子的結構規(guī)律及其生物功能的關系作為基礎，通過化學、物理和分子生物學的手段進行基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類對生產和生活的需求。7蛋白質工程是指通過蛋白質化學、蛋白質晶體學和動力學的研究，獲取有關蛋白質物理和化學等各方面的信息，在此基礎上利用生物技術手段對蛋白質的DNA編碼序列進行有目的的改造并分離、純化蛋白質，從而獲取自然界沒有的、具有優(yōu)良性質或適用于工業(yè)生產條件的全新蛋白質的過程。被稱為“第二代基因工程”

蛋白質工程的概述8二、蛋白質工程的誕生1983年，美國生物學家Ulmer博士在《Science》上發(fā)表了以“ProteinEngineering”為題的專論，首次明確提出蛋白質工程的概念，標志著蛋白質工程的誕生。Ulmer,K.M.(1983)“ProteinEngineering”,Science,219:666-671.

Theprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodellingofproteinstructureandfolding,arediscussed.

---Deliberatedesignandproductionofproteinswithnoveloralteredstructureandproperties,thatarenotfoundinnaturalproteins.9比較1：新蛋白的產生蛋白質工程產生新的蛋白質（工程）自然界中產生新的蛋白質（進化）都是產生了變異，但蛋白質工程速度比自然進化快10基因工程蛋白質工程相同點都要改造基因，都屬于分子水平產生的基因（型）無新基因（型）有新基因（型）產生的蛋白質原有的新的聯(lián)系蛋白質工程以基因工程為基礎，是基因工程的應用和延伸比較2：基因工程和蛋白質工程11比較3：酶工程與蛋白質工程的區(qū)別

酶工程：將酶所具有的生物催化作用，借助工程學的手段，應用于生產、生活、醫(yī)療診斷和環(huán)境保護等方面的一門科學技術。酶工程的重點在于對已存酶的合理充分利用和大量制備。蛋白質工程：重點則在于對已存在的蛋白質分子的改造。隨著蛋白質工程的發(fā)展，其成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質工程的一部分。12二、蛋白質工程的產生與發(fā)展為什么要進行？（需求）如何能進行？（支撐條件）何時崛起？13

需要是創(chuàng)新的第一動力，需求是發(fā)明創(chuàng)造的源泉和方向，而科學的知識是發(fā)明創(chuàng)造的工具。14medication1、DEMANDS蛋白質藥物的穩(wěn)定性半衰期不良反應免疫原性15CatalystforindustriesDEMANDS熱穩(wěn)定性化學穩(wěn)定性壓力穩(wěn)定性催化效率16Agriculture

DEMANDS生物學活性穩(wěn)定性Cow-HenryfromRoslinInstituteMilkwithhighconcentrationofa1-antitrypsin17FrancisCrick,JamesWatson,19621968RobertHolley,GobindKhorana,MarshallNirenberg1933ThomasHuntMorgan182、生物技術的發(fā)展WernerArber,1978,restrictionenzymesMichaelSmith,1993,PointmutationFrederickSanger,1980,DNASequencingSeveroOchoa,1959,SynthesisofRNAKaryB.Mullis,1993,PCR19GeraldM.Edelman,1972,AntibodystructureFrederickSanger,1958,StructureofinsulinBruceMerrifield,1984,PeptideSynthesis20JohnB.Fenn,KoichiTanaka,KurtWüthrich,2002,MassandNMRHerbertA.Hauptman,JeromeKarle,1985,X-RayCrystal21蛋白質工程誕生的基礎1）新的克隆技術，特別是完整的cDNA克隆技術；2）快速測定DNA序列測定；3）從DNA序列推算蛋白質順序的較好的計算機程序；4）蛋白質順序數(shù)據(jù)庫的建立，使一級結構相似的蛋白能被很快地鑒定出來，并由此研究其功能上的相似性；5）對原核生物和真核生物基因表達調控的進一步深入了解；6）用基因體外誘變的化學、酶學和合成技術的進展；7）X光晶體學的進展，包括較好的長浸提策略，同步輻射的應用，電子區(qū)域檢測器的出現(xiàn)，以及計算機輔助的數(shù)據(jù)分析；8）用計算機圖像系統(tǒng)為工具直接觀察晶體數(shù)據(jù)；9）核磁共振技術的改進，使溶液中原子分布能得到直接檢測。223、蛋白質工程產生的標志1982年，Winter等首次報道了通過基因定位誘變獲得改性的酪氨酸t(yī)RNA合成酶(Nature,299,1982)1983年，美國的Ulmer在《Science》上首先提出了“ProteinEngineering“——蛋白質工程誕生(Science,219:666-671.)23DESIGNandPRODUCE

BETTER

PROTEINS

BIOCHEMICALSTRUCTURE

FOLDDING

THERMODYNAMIC244、蛋白質工程與其他技術相互滲透（1）蛋白質工程與發(fā)酵工程發(fā)酵工程可以利用基因技術和細胞雜交技術選育出一大批生長速度快、代謝能力強、易于大量表達外源產物的新菌種，可為蛋白質工程提供優(yōu)良穩(wěn)定的工程菌株，并可為蛋白質工程中前期材料的制備等奠定重要基礎。25（2）蛋白質工程與基因工程蛋白質工程是從DNA水平改變基因入手，通過體外重組技術改造蛋白質或設計合成具有特定功能新蛋白質的新興研究領域，也就是說蛋白質的改造通常需要經過周密的分子設計，進而依賴基因工程獲得突變型蛋白質。目前，基因工程已為實現(xiàn)蛋白質工程提供了基因克隆、表達、突變及活性檢測等關鍵技術。26（3）蛋白質工程與細胞工程細胞工程是指以細胞為單位，在細胞和亞細胞水平上有目的地進行遺傳操作，通過細胞融合、核移植等方法，培養(yǎng)出人們需要的新物種，克服了源遠雜交的局限性。目前，細胞工程技術已為蛋白質工程提供了改良性狀的微生物細胞以及穩(wěn)定的動植物細胞系，以便更好的生產蛋白質；另外，細胞工程可通過細胞融合、轉基因技術改變生物的遺傳性狀或實現(xiàn)新型生物的構建，進而為蛋白質的生產提供更多良好的載體。27（4）蛋白質工程與酶工程由于大部分酶的化學本質是蛋白質，因此酶工程與蛋白質工程的發(fā)展密不可分。（5）蛋白質工程與生物信息技術利用生物信息學可以進行蛋白質結構的預測，其目的就是利用已知的一級序列來構建蛋白質的立體結構模型。281）蛋白質結構分析

2）蛋白質結構預測3）改造或創(chuàng)造新蛋白質

三、蛋白質工程的研究內容29

每一種蛋白質有自己獨特的aa順序，蛋白質功能部位的幾個aa殘基決定著蛋白質的功能，這幾個負責功能的aa殘基必須處于一個及其精密的空間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。這就是說，只要能維持蛋白質結構域的必需aa及空間構象不變，其功能域的生物學活性就會保持不變。所以只要改變構成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能通過改變aa達到改造蛋白質的目的。1、蛋白質結構分析301、蛋白質結構分析（研究核心）

1）收集大量的蛋白質分子結構的信息

2）建立結構與功能之間關系的數(shù)據(jù)

3）蛋白質結構與功能之間關系的理論研究三維空間結構的測定是證明新結構改變了原有生物功能的必需手段31主要事件：1934年，胃蛋白酶的x射線衍射照片J.Bernal,D.Crowfoot1957年，肌紅蛋白晶體結構Kendrew1959年，血紅蛋白晶體結構Perutz32晶體學技術（x射線晶體結構分析）：1.對原材料的要求：具有高度的均一性；影響因素有金屬離子、輔酶或一些成鍵的輔助集團的變化或缺失；蛋白質的酶解、氧化和還原；蛋白質的聚合效應等2.晶體生長的生化條件：pH值、離子強度、沉淀劑和添加劑的濃度等因素缺陷需要分離出足夠量的純蛋白質（幾毫克-幾十毫克），制備出單晶體，然后再進行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計算和分析蛋白質結構分析主要技術33多維核磁共振波譜技術：二維同核核磁共振方法：對氫原子核的二維核磁共振信號進行分析，主要用于β類蛋白質多維異核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白質和α螺旋的多肽

冷凍電鏡技術:避免了普通電鏡制樣的脫水過程，不破壞蛋白正常結構并且分辨率更高，尤其適用于大分子蛋白復合體的結構解析蛋白質結構分析主要技術3435施一公1.StructureofaYeastSpliceosomeat3.6AngstromResolution,10.1126/science.aac76292.Structuralbasisofpre-mRNAsplicing.10.1126/science.aac8159蛋白質空間結構的測定已經成為生命科學的“瓶頸”美國NIH投資1.25億美元，計劃測定1萬個蛋白質晶體結構；日本RIKEN將建16臺高分辨率核磁共振儀，用來測定小分子蛋白質結構技術上的障礙：在克隆、表達、純化和結晶過程中，大約20個蛋白質中能得到1個可供結構測定的晶體，并且一些蛋白質（膜蛋白）根本不可能被結晶現(xiàn)階段主要研究手段：根據(jù)氨基酸序列從理論上計算其相應空間結構成為蛋白質領域內科學家們的奮斗目標研究現(xiàn)狀361）蛋白質結構分析2）蛋白質結構預測3）改造或創(chuàng)造新蛋白質

三、蛋白質工程的研究內容372、結構預測

對天然蛋白質結構與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預測一定氨基酸序列肽鏈空間結構和生物功能根據(jù)特定的生物功能，設計蛋白質的氨基酸序列和空間結構

381、理論分析方法或從頭算方法(Abinitio)：該類方法假設折疊后的蛋白質取能量最低的構象2、統(tǒng)計方法：對已知結構的蛋白質進行統(tǒng)計分析，建立序列到結構的映射模型，進而根據(jù)映射模型對未知結構的蛋白質直接從氨基酸序列預測結構。這一類方法包括經驗性方法、結構規(guī)律提取方法、同源模型化方法等

2、結構預測

39生物信息學分析技術蛋白質結構的預測和設計40主要技術：分子動力學、分子熱力學等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時存在兩個原子等基本原則分析計算蛋白質分子的立體結構和生物功能研究現(xiàn)狀：尚在起步階段

411）蛋白質結構分析2）蛋白質結構預測3）改造或創(chuàng)造新蛋白質三、蛋白質工程的研究內容42

蛋白質分子設計按照被改造部位的多寡分為三種類型：3）改造或創(chuàng)造新蛋白質“大改”，即在了解蛋白質結構和功能的基礎上，從一級結構出發(fā)，設計自然界不存在的全新蛋白質?！靶「摹保簩σ阎Y構的蛋白質進行幾個殘基的替換來改善蛋白質的結構和功能；“中改”：對天然蛋白質分子進行大規(guī)模肽鏈或結構域替換以及對不同蛋白質的結構域進行拼接組裝；431）物理、化學法：對蛋白質進行變性、復性處理，修飾蛋白質側鏈官能團，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質形成一定的立體構像等等2）生物化學法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質，利用轉糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學基團，利用轉酰胺酶使蛋白質發(fā)生膠連等等缺點：缺乏特異性，不能針對特定的部位起作用3）基因重組技術或人工合成DNA：可以改造蛋白質而且可以實現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質創(chuàng)造和改造蛋白質方法：44修飾目標明確在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質功能之間關系之前，宜采用隨機誘變，造成堿基對的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標限定在一定的區(qū)域內，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標DNA明確以后，就可以運用定位突變等技術來進行研究45蛋白質工程的研究策略

生物學功能

蛋白質工程基因

氨基酸多肽鏈

蛋白質三維結構DNA合成分子設計

預期功能轉錄、翻譯DNA合成生物學中心法則反向生物學46蛋白質工程操作流程純化蛋白質合成寡核苷酸晶體結構模型蛋白質結構功能研究基因文庫克隆化基因計算機輔助設計M13克隆分子性質及分子定向改造方案DAN序列分子測試性質表達載體純化突變型蛋白質突變體47改變現(xiàn)有蛋白質結構的步驟

分離純化目標蛋白質

分析

蛋白質的一級結構

分析蛋白質的三維結構及結構與功能的關系根據(jù)蛋一級結構設計引物、克隆目的基因根據(jù)三維結構和結構與功能的關系及蛋白質改造的目的設計改造方案對目的基因定點突變改造后的基因在宿主細胞中表達分離純化表達的蛋白質分析功能和評價是否達到設計目的48蛋白質工程的支撐技術蛋白質結構解析技術生物信息學分析技術定點突變等遺傳操作技術49各類氨基酸自動測序儀蛋白質結構解析技術50X-raycrystallographicElectronDensityMap蛋白質結構解析技術51蛋白質結構解析技術核磁共振技術

NuclearMagneticResorrence52電子顯微技術蛋白質結構解析技術53生物信息學分析技術數(shù)據(jù)庫PDB/RCSB(ProteinDatabase)（/）SWISS-PROT（/sprot/）PIR（/iproclass/）54PDB/RCSB(ProteinDatabase)蛋白質結構數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank,簡稱PDB)是美國紐約Brookhaven國家實驗室于1971年創(chuàng)建的。PDB是目前最主要的收集生物大分子(蛋白質、核酸和糖)三維結構的數(shù)據(jù)庫,是通過X射線單晶衍射、核磁共振、電子衍射等實驗手段確定的蛋白質、多糖、核酸、病毒等生物大分子的三維結構數(shù)據(jù)庫。55SWISS-PROTSWISS-PROT是由Geneva大學和歐洲生物信息學研究所（EBI）于1986年聯(lián)合建立的，它是目前國際上權威的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫。SWISS-PROT中的蛋白質序列是經過注釋的。SWISS-PROT中的數(shù)據(jù)來源于不同源地：（1）從核酸數(shù)據(jù)庫經過翻譯推導而來；（2）從蛋白質數(shù)據(jù)庫PIR挑選出合適的數(shù)據(jù)；（3）從科學文獻中摘錄；（4）研究人員直接提交的蛋白質序列數(shù)據(jù)。56PIRPIR全稱TheProteinInformationResource，是一個集成了關于蛋白質功能預測數(shù)據(jù)的公共資源的數(shù)據(jù)庫，其目的是支持基因組/蛋白質組研究。PIR提供了在超家族、域和模體水平上的對蛋白的分類。PIR同時提供了蛋白的結構和功能信息，并給出了與其他40個數(shù)據(jù)庫之間的相互參考。57四、蛋白質工程的應用58醫(yī)藥領域生物材料能源領域農業(yè)領域工業(yè)領域其他領域提高酶的熱穩(wěn)定性延長制品在體內的半衰期提高蛋白質的抗氧化性提高重組蛋白質的活性及穩(wěn)定性降低制品的免疫原性改變酶的催化效率提高酶的專一性蛋白質工程技術應用解決的問題59實際應用方面:

到目前為止盡管人類已經發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種酶,但是真正具有商業(yè)價值即每年銷售額可超過1000萬美元的酶不過數(shù)十種。迫切需要對酶進行改造。60蛋白質工程在酶工程中的應用

誘變蛋白質氨基酸突變原定目標結果

T4溶菌酶Ilu→Cys構建二硫鍵成功增加熱穩(wěn)定性枯草桿菌Gly→Lys拓寬酶作用的成功蛋白酶底物范圍

Ala→Leu提高抗氧化性能

α-抗凝酶Met→Val提高抗氧化性能成功胰蛋白酶Gly→Ala提高酶水解專一性成功

β-內酰胺酶Ser→Cys驗證Ser對該酶成功的重要性

β-干擾素Cys→Ser提高穩(wěn)定性成功

白細胞介素-2Cys→Ser提高產物活性

不成功二氫葉酸還原酶Asp→Asn驗證酶的活性成功中心還原酶

611）提高蛋白質的穩(wěn)定性如葡萄糖異構酶（GI）突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應溫度提高10-12℃；酶比活相同2）融合蛋白質化學合成的腦啡肽（Enk）N端5肽編碼區(qū)，通過一連接3肽編碼區(qū)與人α1型干擾素IFN基因連接，在大腸桿菌中表達這一融合蛋白，融合蛋白抑制腫瘤細胞生長的活性顯著高于單純的IFN蛋白質工程在醫(yī)學上的應用623）治癌酶的改造如皰癥病毒胸腺嘧啶激酶(TK)是一種治療癌癥的酶，從大量的隨機突變中篩選出一種，在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力分別提高數(shù)十倍。

4）蛋白質活性的改變將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過臨床實驗。63胰島素治療豬人

全球已診斷的Ⅱ型糖尿病患者達1.3億人，我國已超過4000萬人.中國城市人口治療糖尿病每年直接人均醫(yī)療花費為451美元，治療患有糖尿病并發(fā)癥的患者花費則高達1694美元。在糖尿病用藥中，胰島素是最有效的糖尿病治療藥物之一，也是1型糖尿病人惟一的治療藥物。此外，還有30%～40%的2型糖尿病患者最終需要使用胰島素。64胰島素的改造天然胰島素的缺點:在高于生理濃度(10-8~10-10mol/L)自身聚合[藥用濃度高,>10-4mol/L]發(fā)揮生理功能需要單體形式與專一受體結合目標:研制以單體存在的胰島素65解決途徑基于類胰島素生長因子IGF-1是以單體形式存在,將胰島素B鏈的B28-B29的殘基序列顛倒成IGF-1相應序列向胰島素二聚體形成面引入帶電荷或具有大的側鏈的殘基,以阻礙二聚體的形成中國科學C輯2002；32（4）6667胰島素的緩釋改造胰島素屬小分子蛋白,皮下注射進入血液后被快速代謝,給藥頻繁運用不同策略對其緩釋,減少給藥次數(shù)維持血藥濃度,防止胰島素濃度過高造成低血糖問題68地特胰島素諾和平（Levemir）諾和諾德2013年銷售額18億美元5）嵌合抗體和人緣化抗體

嵌合抗體就是用人抗體的恒定區(qū)替代鼠單克隆抗體的恒定區(qū)，這樣它的免疫原性就顯著下降

人緣化抗體就是將抗原吸附區(qū)域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到最小，免疫原性也就最小。人緣化抗體如治療脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反應可以忽略不計。69飼料用酶的分子改良與產品研制飼料用抗菌肽的分子改良與產品研制重要農作物蛋白質標記的分離鑒定食品用酶及抗氧化酶的分子改良與產品研制有機磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良與產品研制重大動物疫病快速檢測試劑的研發(fā)

蛋白質工程在農業(yè)方面的應用70意義在醫(yī)藥、工業(yè)、農業(yè)、環(huán)保等方面應用前景廣泛對揭示生命現(xiàn)象的本質和生命活動的規(guī)律具有重要意義是蛋白質結構形成和功能表達的關系研究中不可替代的手段

基礎研究、應用開發(fā)711.構象的快速測定手段:

以分子定向改造為目標的蛋白質工程須借助于精確的三維結構信息,而目前主要靠X-射線單晶體結構分析,受到單晶培養(yǎng)的限制。目前正在尋求通過電子衍射三維分析、二維核磁共振等手段來克服上述限制蛋白質工程存在的問題722.基因高效表達以及有效的下游技術

尋找高效表達載體、分泌性寄生系統(tǒng)以及各種高效批量分離技術是克服這一限制的關鍵蛋白質工程存在的問題73復習思考題掌握蛋白質工程的概念熟悉蛋白質工程的基本研究內容關注蛋白質工程領域，了解蛋白質工程在生命科學中的應用及意義74751926年，Sumner從刀豆中提純了脲酶，首次證明酶的本質是蛋白質。1932年，英國化學家Krebs等提出合成尿素的鳥氨酸循環(huán)多酶反應途徑。1937年，Krebs公布了三羧酸循環(huán)的研究成果。1940年，德國生化學家Embclen和Megerbof公布了糖酵解途徑。隨后，脂肪酸氧化和核苷酸代謝途徑也相繼被闡明。同時期，我國生物化學家吳憲等提出蛋白質變性學說。3、生物技術的發(fā)展761953年，英國生物化學家桑格破譯出由17種51個aa組成的牛胰島素兩條多肽鏈的全部結構。1965年，我國首先在世界上成功人工合成了具有天然生物活力的蛋白質——結晶牛胰島素。1975年，O’Farrel建立了雙向電泳（2-DE）技術，可以用于組織與細胞中大規(guī)模蛋白質的分離。20世紀80年代末期，Hillenkamp發(fā)展了激光解吸質譜，F(xiàn)enn設計了電噴霧質譜，可以高效、精確地測量生物大分子的質量并測定部分序列，進而用于數(shù)據(jù)庫的檢測；Mann通過建立“肽指紋圖譜與肽序列標簽”等技術，實現(xiàn)了質譜準確、快速、自動化和大規(guī)模鑒定蛋白質的飛躍。771982年，Winter等首次報道通過基因定點誘變獲得改性。1983年，Ulmer在《Science》上發(fā)表了蛋白質teinEngineering的專論，標志著蛋白質工程的正式誕生。1982年~1985年，F(xiàn)orsht等對酪氨酰tRNA合成酶的分子進行了改造，根據(jù)X射線衍射實測該酶與底物結合部位的結構，通過定點突變技術改變與底物結合的aa殘基，還用動力學方法測量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機制，這就是最早的蛋白質工程。781984年，Perry通過將溶菌酶中Ile3改成Cys3，并進一步氧化成Cys3-Cys97二硫鍵，提高了酶的熱穩(wěn)定性，顯著改進了溶