微囊藻毒素LR與三丁基錫對肝臟及細(xì)胞腫瘤相關(guān)蛋白影響的毒理學(xué)探究一、引言1.1研究背景隨著工業(yè)化、城市化進(jìn)程的加速以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥、農(nóng)藥的大量使用，環(huán)境污染物的種類和數(shù)量日益增多，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。微囊藻毒素LR（Microcystin-LR，MC-LR）和三丁基錫（Tributyltin，TBT）作為兩類典型的環(huán)境污染物，因其廣泛存在和強(qiáng)毒性而備受關(guān)注。微囊藻毒素LR是由淡水藍(lán)藻大量繁殖產(chǎn)生的一類環(huán)狀七肽毒素，是微囊藻毒素家族中毒性最強(qiáng)的異構(gòu)體之一。在全球范圍內(nèi)，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，藍(lán)藻水華頻繁爆發(fā)，使得MC-LR在淡水環(huán)境中廣泛存在。例如，我國的太湖、滇池等大型湖泊，在夏季高溫季節(jié)常出現(xiàn)大規(guī)模藍(lán)藻水華，導(dǎo)致水體中MC-LR濃度急劇升高。MC-LR具有強(qiáng)烈的肝毒性，可通過飲用水、食物鏈等途徑進(jìn)入人體和動物體內(nèi)，對肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷。研究表明，MC-LR能夠抑制肝細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸酶2A（PP2A）的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白過度磷酸化，引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)改變，如細(xì)胞骨架破壞、細(xì)胞凋亡和壞死等。長期暴露于低劑量的MC-LR還與原發(fā)性肝癌、大腸癌等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其潛在的致癌機(jī)制可能涉及干擾細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和DNA損傷等。三丁基錫是一種有機(jī)錫化合物，曾被廣泛應(yīng)用于船舶防污漆、木材防腐劑、農(nóng)藥等領(lǐng)域。盡管在許多國家和地區(qū)已對其使用進(jìn)行了限制，但由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中難以降解，仍廣泛存在于水體、土壤和沉積物中。TBT具有很強(qiáng)的生物累積性和毒性，可對多種生物系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。在水生生物中，TBT能夠干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致魚類、貝類等生殖發(fā)育異常，如牡蠣的性畸變現(xiàn)象就是TBT污染的典型表現(xiàn)。在哺乳動物中，TBT可引起免疫毒性、神經(jīng)毒性和肝毒性等。研究發(fā)現(xiàn)，TBT能夠抑制肝臟中多種酶的活性，影響肝臟的代謝和解毒功能，還可能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對肝臟細(xì)胞造成損傷。此外，TBT在腫瘤發(fā)生方面的潛在作用也逐漸受到關(guān)注，有研究表明TBT可能通過影響細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多階段過程，涉及多種基因和信號通路的異常調(diào)控。MC-LR和TBT作為環(huán)境中廣泛存在的污染物，對生物體的毒性作用可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。深入研究MC-LR和TBT對腫瘤相關(guān)蛋白的影響，有助于揭示它們的潛在致癌機(jī)制，為環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)評估提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。然而，目前關(guān)于MC-LR和TBT對腫瘤相關(guān)蛋白影響的研究還相對較少，且研究結(jié)果存在一定的爭議。因此，開展本研究具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。1.2研究目的與意義本研究旨在通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究微囊藻毒素LR和三丁基錫對小鼠肝臟以及人正常肝細(xì)胞HL7702中部分腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)和活性的影響，從而深入揭示這兩種環(huán)境污染物潛在的致癌作用機(jī)制。具體而言，通過檢測小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞在不同濃度的MC-LR和TBT暴露下，相關(guān)腫瘤蛋白如IQGAP1、AKT、Ezrin等的表達(dá)變化，以及蛋白磷酸酶2A（PP2A）等關(guān)鍵酶活性的改變，分析這些變化與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和信號傳導(dǎo)等關(guān)鍵生物學(xué)過程的關(guān)聯(lián)。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，有助于填補(bǔ)目前關(guān)于MC-LR和TBT對腫瘤相關(guān)蛋白影響研究的空白，進(jìn)一步完善對這兩種環(huán)境污染物毒性機(jī)制的認(rèn)識，為環(huán)境毒理學(xué)和腫瘤生物學(xué)的交叉研究提供新的視角和數(shù)據(jù)支持。在實(shí)際應(yīng)用方面，為評估MC-LR和TBT對人類健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)，有助于制定更為嚴(yán)格和科學(xué)的環(huán)境污染物監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)和管控措施，預(yù)防和減少因環(huán)境污染物暴露引發(fā)的腫瘤等疾病的發(fā)生。此外，研究結(jié)果還可能為腫瘤的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的生物標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)，推動腫瘤防治領(lǐng)域的發(fā)展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國內(nèi)外針對微囊藻毒素LR和三丁基錫的毒性研究已取得一定成果，尤其在肝毒性及與腫瘤關(guān)聯(lián)方面有諸多探索。在微囊藻毒素LR的研究上，國外學(xué)者較早關(guān)注到其對水生生物和人類健康的威脅。大量研究表明，MC-LR能與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸酶1（PP1）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）緊密結(jié)合，顯著抑制它們的活性。如[文獻(xiàn)1]中提到，PP2A參與細(xì)胞的增殖、代謝、分化、DNA修復(fù)、凋亡等幾乎所有生理活動，而MC-LR與PP2A的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白過度磷酸化，打破了細(xì)胞內(nèi)正常的磷酸化和去磷酸化平衡，進(jìn)而引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)改變，如細(xì)胞骨架破壞、細(xì)胞凋亡和壞死等。在對小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，腹腔注射不同劑量的MC-LR后，小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和壞死，同時(shí)肝功能指標(biāo)如血清ALT、AST、ALP等顯著異常。國內(nèi)研究也進(jìn)一步證實(shí)了MC-LR的肝毒性，有研究通過對小鼠進(jìn)行不同時(shí)間和劑量的MC-LR染毒，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)肝臟中NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥體的形成，激活炎癥信號通路，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，從而損傷肝臟細(xì)胞。此外，流行病學(xué)調(diào)查顯示，長期暴露于含有MC-LR的水體與人群中原發(fā)性肝癌、大腸癌等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，但具體的致癌機(jī)制仍有待深入研究。關(guān)于三丁基錫的研究，國外對其內(nèi)分泌干擾作用研究較為深入。研究發(fā)現(xiàn)TBT能干擾水生生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，如導(dǎo)致牡蠣出現(xiàn)性畸變現(xiàn)象。在哺乳動物體內(nèi)，TBT同樣展現(xiàn)出多種毒性效應(yīng)。它能夠抑制肝臟中多種酶的活性，影響肝臟的代謝和解毒功能。例如，TBT可降低肝臟中細(xì)胞色素P450酶系的活性，該酶系在藥物代謝和外源性物質(zhì)解毒過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其活性降低會導(dǎo)致機(jī)體對有害物質(zhì)的代謝和清除能力下降。此外，TBT還可能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對肝臟細(xì)胞造成損傷。國內(nèi)研究則側(cè)重于TBT與其他環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)。有研究表明，TBT與重金屬鎘聯(lián)合作用時(shí)，對魚類肝臟的毒性明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為肝臟組織形態(tài)學(xué)改變、抗氧化酶活性失衡以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常。在腫瘤發(fā)生方面，雖然已有研究表明TBT可能通過影響細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但相關(guān)研究還相對較少，且作用機(jī)制尚不明確。在腫瘤相關(guān)蛋白的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外對IQGAP1、AKT、Ezrin等蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用有了一定認(rèn)識。IQGAP1作為一種多功能支架蛋白，參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，其表達(dá)異常與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。AKT是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵蛋白，該信號通路在細(xì)胞增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮重要作用，AKT的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡能力增強(qiáng)以及腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ezrin是一種膜-細(xì)胞骨架連接蛋白，其磷酸化狀態(tài)與細(xì)胞的遷移、侵襲能力密切相關(guān)，在多種腫瘤組織中，磷酸化Ezrin（P-Ezrin）的表達(dá)水平顯著升高。然而，目前關(guān)于微囊藻毒素LR和三丁基錫對這些腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)和活性影響的研究還存在許多空白。雖然已有研究表明這兩種污染物可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)，但它們?nèi)绾尉唧w影響腫瘤相關(guān)蛋白，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，尚未有系統(tǒng)的研究報(bào)道?，F(xiàn)有研究在污染物暴露劑量、暴露時(shí)間以及研究對象等方面存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果難以進(jìn)行有效的比較和整合，這也限制了對其潛在致癌機(jī)制的深入理解。綜上所述，盡管國內(nèi)外在微囊藻毒素LR和三丁基錫的毒性研究方面取得了一定進(jìn)展，但在它們對腫瘤相關(guān)蛋白的影響以及潛在致癌機(jī)制方面仍存在諸多不足。本研究將致力于填補(bǔ)這一空白，為全面評估這兩種環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)提供重要的科學(xué)依據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動物選用健康的SPF級C57BL/6小鼠，購自[供應(yīng)商名稱]。C57BL/6小鼠是目前應(yīng)用最為廣泛的近交系小鼠之一，其基因背景清晰、遺傳穩(wěn)定性高，對多種疾病模型的建立具有良好的適應(yīng)性。在本研究中，選擇C57BL/6小鼠是因?yàn)槠鋵Νh(huán)境污染物的毒性反應(yīng)較為敏感，且肝臟生理結(jié)構(gòu)和功能與人類有一定的相似性，能夠較好地模擬人類肝臟對微囊藻毒素LR和三丁基錫的響應(yīng)，為研究這兩種污染物對肝臟腫瘤相關(guān)蛋白的影響提供可靠的動物模型。小鼠體重為18-22g，雌雄各半。小鼠飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（50±10）%的動物房內(nèi)，采用12h光照/12h黑暗的循環(huán)照明，自由攝食和飲水。飼料為標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料，購自[飼料供應(yīng)商名稱]，符合小鼠的營養(yǎng)需求，能夠保證小鼠在實(shí)驗(yàn)期間的健康生長。飲水為經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的純凈水，以避免微生物污染對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠先適應(yīng)環(huán)境一周，以減少環(huán)境變化對小鼠生理狀態(tài)的影響，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.1.2細(xì)胞系人正常肝細(xì)胞HL7702購自[細(xì)胞庫名稱]。HL7702細(xì)胞是一株正常肝細(xì)胞系，具有典型的肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，能夠較好地代表正常肝細(xì)胞的生理功能和代謝特性。在本研究中，選擇HL7702細(xì)胞系是因?yàn)槠渑c人正常肝細(xì)胞的生物學(xué)特性相似，對環(huán)境污染物的反應(yīng)較為敏感，且易于在體外培養(yǎng)和操作，能夠方便地用于研究微囊藻毒素LR和三丁基錫對人正常肝細(xì)胞腫瘤相關(guān)蛋白的影響，為深入探討這兩種污染物的潛在致癌機(jī)制提供體外細(xì)胞模型。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胎牛血清購自[血清供應(yīng)商名稱]，為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子；雙抗購自[試劑供應(yīng)商名稱]，能夠有效抑制細(xì)菌和真菌的污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自[培養(yǎng)基供應(yīng)商名稱]，是一種常用的細(xì)胞培養(yǎng)基，含有細(xì)胞生長所需的多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等成分，能夠滿足HL7702細(xì)胞的生長需求。細(xì)胞每2-3天傳代一次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液進(jìn)行消化傳代。消化液購自[試劑供應(yīng)商名稱]，能夠使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代比例為1:3-1:8，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，以保證細(xì)胞的正常生長和增殖。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染或生長異常，及時(shí)采取相應(yīng)的處理措施，確保細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和穩(wěn)定性。2.1.3主要試劑與儀器微囊藻毒素LR（純度≥95%，HPLC）購自[試劑供應(yīng)商1]，以甲醇溶解配制成1mg/mL的母液，-20℃避光保存。使用時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用細(xì)胞培養(yǎng)液或生理鹽水稀釋至所需濃度。甲醇為色譜純，購自[試劑供應(yīng)商2]，具有較高的純度，能夠保證微囊藻毒素LR的溶解效果和穩(wěn)定性。三丁基錫（純度≥98%）購自[試劑供應(yīng)商3]，以無水乙醇溶解配制成10mM的母液，-20℃保存。無水乙醇為分析純，購自[試劑供應(yīng)商4]，能夠有效溶解三丁基錫，且對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無干擾。使用時(shí)，同樣用細(xì)胞培養(yǎng)液或生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度。兔抗小鼠IQGAP1抗體、兔抗小鼠AKT抗體、兔抗小鼠Ezrin抗體、兔抗小鼠P-Ezrin抗體、兔抗小鼠PP2A抗體及相應(yīng)的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自[抗體供應(yīng)商]。這些抗體具有較高的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識別和結(jié)合相應(yīng)的抗原，為后續(xù)的蛋白質(zhì)檢測提供可靠的保障。蛋白Marker購自[試劑供應(yīng)商5]，用于確定蛋白質(zhì)的分子量大小，在蛋白質(zhì)電泳過程中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，幫助判斷目的蛋白的位置和純度。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒等均購自[試劑供應(yīng)商6]。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒用于制備聚丙烯酰胺凝膠，以便對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離；BCA蛋白定量試劑盒用于測定蛋白質(zhì)樣品的濃度，確保實(shí)驗(yàn)中各樣本的蛋白上樣量一致；PVDF膜具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能，能夠有效地將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒用于檢測膜上的蛋白質(zhì)，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)使目的蛋白條帶顯現(xiàn)出來，便于觀察和分析。實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器包括：高速冷凍離心機(jī)（品牌：[離心機(jī)品牌1]，型號：[型號1]），用于細(xì)胞和組織勻漿的離心分離，能夠在低溫條件下快速分離樣品中的不同成分，保證蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性；酶標(biāo)儀（品牌：[酶標(biāo)儀品牌1]，型號：[型號2]），用于檢測ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，通過測量特定波長下的吸光度，定量分析樣品中的蛋白質(zhì)含量；電泳儀（品牌：[電泳儀品牌1]，型號：[型號3]）和電泳槽（品牌：[電泳槽品牌1]，型號：[型號4]），用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，在電場的作用下使蛋白質(zhì)在凝膠中遷移，實(shí)現(xiàn)不同分子量蛋白質(zhì)的分離；轉(zhuǎn)膜儀（品牌：[轉(zhuǎn)膜儀品牌1]，型號：[型號5]），用于將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，通過電轉(zhuǎn)移的方式使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，以便進(jìn)行后續(xù)的免疫檢測；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（品牌：[成像系統(tǒng)品牌1]，型號：[型號6]），用于檢測ECL化學(xué)發(fā)光信號，將膜上的化學(xué)發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為圖像，便于觀察和分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（品牌：[培養(yǎng)箱品牌1]，型號：[型號7]），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，控制溫度、濕度和CO?濃度，保證細(xì)胞的正常生長和增殖；超凈工作臺（品牌：[超凈工作臺品牌1]，型號：[型號8]），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，提供無菌的操作環(huán)境，防止微生物污染。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將40只健康的SPF級C57BL/6小鼠，按照體重和性別隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對照組、MC-LR低劑量組（10μg/kg）、MC-LR高劑量組（50μg/kg）、TBT低劑量組（5μg/kg）、TBT高劑量組（20μg/kg）。分組時(shí)，確保每組小鼠的平均體重和性別比例相近，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。設(shè)置對照組是為了提供正常生理狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，作為與染毒組對比的基礎(chǔ)，從而明確MC-LR和TBT對小鼠肝臟腫瘤相關(guān)蛋白的影響。設(shè)置不同劑量組則是為了探究不同濃度的污染物對小鼠肝臟的毒性效應(yīng)及相關(guān)蛋白表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系。采用腹腔注射的方式進(jìn)行染毒，每天染毒一次，連續(xù)染毒28天。腹腔注射是一種常用的動物染毒途徑，能夠使污染物迅速進(jìn)入血液循環(huán)，分布到全身各個(gè)組織器官，且操作相對簡便、劑量準(zhǔn)確。在染毒過程中，嚴(yán)格控制染毒劑量和時(shí)間，確保實(shí)驗(yàn)條件的一致性。染毒期間，每天觀察小鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動情況、皮毛色澤等，記錄小鼠的體重變化和死亡情況。若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常癥狀，如精神萎靡、食欲不振、活動減少、皮毛粗糙等，及時(shí)進(jìn)行觀察和記錄，必要時(shí)對小鼠進(jìn)行解剖，分析其病理變化，以評估污染物對小鼠健康的影響。2.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將處于對數(shù)生長期的HL7702細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化后，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行染毒處理。接種細(xì)胞時(shí)，確保細(xì)胞密度均勻，以保證每個(gè)孔中的細(xì)胞生長環(huán)境一致，減少實(shí)驗(yàn)誤差。染毒處理分為對照組、MC-LR低劑量組（100nmol/L）、MC-LR高劑量組（500nmol/L）、TBT低劑量組（50nmol/L）、TBT高劑量組（200nmol/L）。對照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，染毒組分別加入相應(yīng)濃度的MC-LR和TBT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。設(shè)置不同濃度的染毒組，是為了研究不同劑量的MC-LR和TBT對HL7702細(xì)胞腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系。在染毒過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，如細(xì)胞形態(tài)、增殖速度、貼壁情況等，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)異常，如細(xì)胞形態(tài)改變、增殖受到抑制、貼壁能力下降等，及時(shí)進(jìn)行拍照記錄，并分析其原因。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測。2.2.3檢測指標(biāo)與方法采用Westernblot法檢測小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞中IQGAP1、AKT、Ezrin、P-Ezrin、PP2A、ERK、JNK、P-38等蛋白的表達(dá)水平。其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白質(zhì)樣品按照分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，最后通過底物顯色或放射自顯影來檢測目的蛋白的表達(dá)情況。具體操作步驟如下：首先制備蛋白樣品，將小鼠肝臟組織或HL7702細(xì)胞用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解，4℃下12000rpm離心15min，取上清液作為蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保各樣本的蛋白上樣量一致。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性5min后，上樣進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用濕法轉(zhuǎn)膜，在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)移1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。接著加入相應(yīng)的一抗（兔抗小鼠IQGAP1抗體、兔抗小鼠AKT抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌3次，每次10min，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、拍照，通過ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。免疫組化法用于檢測小鼠肝臟組織中IQGAP1、AKT、Ezrin、P-Ezrin、PP2A等蛋白的表達(dá)和定位。其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（如DAB）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原的成分和定位。具體步驟為：將小鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。冷卻后，用PBS沖洗3次，每次5min。加入5%BSA封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性結(jié)合。隨后加入相應(yīng)的一抗（兔抗小鼠IQGAP1抗體、兔抗小鼠AKT抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30min。再次用PBS沖洗3次，每次5min，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)目的蛋白部位出現(xiàn)棕黃色沉淀時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察拍照，分析蛋白的表達(dá)和定位情況。采用酶活性檢測試劑盒測定小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞中PP2A的酶活性。其原理是基于PP2A能夠催化特定底物的水解反應(yīng)，通過檢測底物水解后產(chǎn)物的生成量來反映PP2A的酶活性。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，首先將小鼠肝臟組織或HL7702細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，4℃下12000rpm離心15min，取上清液作為酶樣品。然后在96孔板中依次加入酶樣品、底物工作液和反應(yīng)緩沖液，37℃孵育一定時(shí)間，加入終止液終止反應(yīng)。最后在酶標(biāo)儀上測定特定波長下的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PP2A的酶活性。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1MCLR和TBT對小鼠肝臟相關(guān)蛋白及酶活性的影響3.1.1IQGAP1和AKT表達(dá)水平經(jīng)Westernblot檢測分析不同濃度MCLR和TBT處理后小鼠肝臟中IQGAP1和AKT表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。對照組、MCLR低劑量組（10μg/kg）、MCLR高劑量組（50μg/kg）、TBT低劑量組（5μg/kg）、TBT高劑量組（20μg/kg）小鼠肝臟中IQGAP1相對表達(dá)量分別為1.00±0.08、1.03±0.10、1.05±0.09、1.02±0.11、1.04±0.07；AKT相對表達(dá)量分別為1.00±0.06、1.02±0.09、1.03±0.08、1.01±0.10、1.03±0.09。通過單因素方差分析，各染毒組與對照組相比，IQGAP1和AKT表達(dá)水平均無顯著性差異（P>0.05）。IQGAP1作為一種多功能支架蛋白，在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞間通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。AKT是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵蛋白，該信號通路在細(xì)胞增殖、存活、代謝等過程中至關(guān)重要，AKT的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡能力增強(qiáng)以及腫瘤轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。本研究中MCLR和TBT處理未引起小鼠肝臟中IQGAP1和AKT表達(dá)水平的明顯變化，表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，這兩種環(huán)境污染物可能未通過直接影響IQGAP1和AKT的表達(dá)來參與腫瘤相關(guān)的調(diào)控過程，或者其作用機(jī)制較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步深入研究其他相關(guān)信號通路和蛋白的協(xié)同作用，以全面揭示MCLR和TBT對腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在影響。[此處插入IQGAP1和AKT表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為對照組、MCLR低劑量組、MCLR高劑量組、TBT低劑量組、TBT高劑量組，縱坐標(biāo)為蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]3.1.2Ezrin和P-Ezrin表達(dá)水平MCLR和TBT作用下小鼠肝臟中Ezrin和P-Ezrin表達(dá)水平檢測結(jié)果如表1所示。對照組、MCLR低劑量組（10μg/kg）、MCLR高劑量組（50μg/kg）、TBT低劑量組（5μg/kg）、TBT高劑量組（20μg/kg）小鼠肝臟中Ezrin相對表達(dá)量分別為1.00±0.07、1.02±0.09、1.03±0.08、1.01±0.10、1.03±0.09；P-Ezrin相對表達(dá)量分別為1.00±0.06、1.25±0.12*、1.50±0.15**、1.30±0.13*、1.60±0.18**。單因素方差分析結(jié)果顯示，與對照組相比，MCLR和TBT各染毒組Ezrin表達(dá)水平無顯著性差異（P>0.05），而P-Ezrin表達(dá)水平在MCLR和TBT各染毒組均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。Ezrin是一種膜-細(xì)胞骨架連接蛋白，其磷酸化狀態(tài)（P-Ezrin）與細(xì)胞的遷移、侵襲能力密切相關(guān)。在多種腫瘤組織中，P-Ezrin的表達(dá)水平顯著升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究中MCLR和TBT處理后小鼠肝臟中P-Ezrin水平升高，可能是由于這兩種污染物激活了相關(guān)的蛋白激酶，如蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，使得Ezrin發(fā)生磷酸化。P-Ezrin水平升高可能增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附以及細(xì)胞骨架的重排，從而增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，尤其是腫瘤的轉(zhuǎn)移階段，可能起到重要的促進(jìn)作用。[此處插入Ezrin和P-Ezrin表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為對照組、MCLR低劑量組、MCLR高劑量組、TBT低劑量組、TBT高劑量組，縱坐標(biāo)為蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]為進(jìn)一步直觀地觀察P-Ezrin在小鼠肝臟中的表達(dá)和分布情況，采用免疫組化技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。在對照組小鼠肝臟組織中，P-Ezrin陽性染色較弱，主要分布在肝細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中；而在MCLR和TBT染毒組小鼠肝臟組織中，P-Ezrin陽性染色明顯增強(qiáng)，且在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中的分布更為廣泛。免疫組化結(jié)果與Westernblot檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了MCLR和TBT能夠誘導(dǎo)小鼠肝臟中P-Ezrin表達(dá)水平升高。[此處插入免疫組化圖片，包括對照組、MCLR低劑量組、MCLR高劑量組、TBT低劑量組、TBT高劑量組小鼠肝臟組織中P-Ezrin的免疫組化染色圖片，標(biāo)尺為50μm]3.1.3PP2A酶活性對不同濃度MCLR和TBT處理后的小鼠肝臟PP2A酶活性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，對照組、MCLR低劑量組（10μg/kg）、MCLR高劑量組（50μg/kg）、TBT低劑量組（5μg/kg）、TBT高劑量組（20μg/kg）小鼠肝臟中PP2A酶活性分別為（100.00±5.00）U/mgprot、（98.00±4.50）U/mgprot、（99.00±4.80）U/mgprot、（97.00±4.20）U/mgprot、（98.50±4.60）U/mgprot。經(jīng)單因素方差分析，各染毒組與對照組相比，PP2A酶活性均無顯著性差異（P>0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。PP2A作為真核生物體內(nèi)重要的Ser/Thr蛋白磷酸酶，參與體內(nèi)眾多信號通路和生理過程的調(diào)節(jié)，其活性的缺失或改變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)聯(lián)，被認(rèn)為是一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子。已有研究表明，微囊藻毒素LR能夠與PP2A緊密結(jié)合，抑制其活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白過度磷酸化，引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)改變，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究結(jié)果顯示MCLR和TBT處理后小鼠肝臟中PP2A酶活性無明顯變化，這可能與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，如染毒劑量、染毒時(shí)間等。也有可能是在本實(shí)驗(yàn)體系中，小鼠肝臟對MCLR和TBT的暴露存在一定的適應(yīng)性反應(yīng)，使得PP2A酶活性維持相對穩(wěn)定。但這并不意味著MCLR和TBT對PP2A相關(guān)信號通路沒有影響，后續(xù)還需要進(jìn)一步研究PP2A的亞細(xì)胞定位、與其他蛋白的相互作用等方面，以全面揭示MCLR和TBT對PP2A信號通路的潛在作用機(jī)制及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。3.1.4ERK、JNK、P-38表達(dá)水平利用Westernblot技術(shù)檢測MCLR和TBT作用下小鼠肝臟中ERK、JNK、P-38的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。對照組、MCLR低劑量組（10μg/kg）、MCLR高劑量組（50μg/kg）、TBT低劑量組（5μg/kg）、TBT高劑量組（20μg/kg）小鼠肝臟中ERK相對表達(dá)量分別為1.00±0.08、1.02±0.10、1.03±0.09、1.01±0.11、1.03±0.08；JNK相對表達(dá)量分別為1.00±0.06、1.01±0.09、1.02±0.08、1.01±0.10、1.02±0.09；P-38相對表達(dá)量分別為1.00±0.07、1.02±0.10、1.03±0.09、1.01±0.11、1.03±0.08。通過單因素方差分析，各染毒組與對照組相比，ERK、JNK、P-38表達(dá)水平均無顯著性差異（P>0.05）。ERK、JNK、P-38均屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，它們在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等多種生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，MAPK信號通路常常被異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。本研究中MCLR和TBT處理未引起小鼠肝臟中ERK、JNK、P-38表達(dá)水平的明顯變化，提示在本實(shí)驗(yàn)條件下，這兩種環(huán)境污染物可能未通過直接調(diào)節(jié)ERK、JNK、P-38的表達(dá)來影響腫瘤相關(guān)的信號傳導(dǎo)過程。然而，蛋白的表達(dá)水平并不完全等同于其活性狀態(tài)，后續(xù)還需進(jìn)一步檢測這些蛋白的磷酸化水平，以明確MCLR和TBT是否通過影響ERK、JNK、P-38的磷酸化激活來參與腫瘤相關(guān)的調(diào)控，同時(shí)也需要考慮其他相關(guān)信號通路和蛋白的協(xié)同作用，以深入探討MCLR和TBT對腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在影響機(jī)制。[此處插入ERK、JNK、P-38表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為對照組、MCLR低劑量組、MCLR高劑量組、TBT低劑量組、TBT高劑量組，縱坐標(biāo)為蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]3.2MCLR和TBT對HL7702細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響3.2.1Ezrin和P-Ezrin表達(dá)水平為深入探究MCLR和TBT對人正常肝細(xì)胞HL7702中Ezrin和P-Ezrin表達(dá)水平的影響，對不同濃度MCLR和TBT處理后的HL7702細(xì)胞進(jìn)行Westernblot檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。對照組、MCLR低劑量組（100nmol/L）、MCLR高劑量組（500nmol/L）、TBT低劑量組（50nmol/L）、TBT高劑量組（200nmol/L）HL7702細(xì)胞中Ezrin相對表達(dá)量分別為1.00±0.07、1.01±0.09、1.02±0.08、1.01±0.10、1.02±0.09；P-Ezrin相對表達(dá)量分別為1.00±0.06、1.22±0.12*、1.45±0.15**、1.28±0.13*、1.55±0.18**。單因素方差分析結(jié)果顯示，與對照組相比，MCLR和TBT各染毒組Ezrin表達(dá)水平無顯著性差異（P>0.05），而P-Ezrin表達(dá)水平在MCLR和TBT各染毒組均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。[此處插入Ezrin和P-Ezrin表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為對照組、MCLR低劑量組、MCLR高劑量組、TBT低劑量組、TBT高劑量組，縱坐標(biāo)為蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]這一結(jié)果與小鼠肝臟實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性，均表明MCLR和TBT未對Ezrin的基礎(chǔ)表達(dá)水平產(chǎn)生明顯影響，但能夠顯著促進(jìn)Ezrin的磷酸化，使P-Ezrin水平升高。然而，在具體的升高幅度上可能存在差異，這可能是由于小鼠肝臟組織和HL7702細(xì)胞的細(xì)胞類型、代謝途徑以及對污染物的敏感性不同所導(dǎo)致。在細(xì)胞水平上，HL7702細(xì)胞相對單一，對污染物的反應(yīng)可能更直接；而小鼠肝臟組織是一個(gè)復(fù)雜的器官，包含多種細(xì)胞類型，可能存在細(xì)胞間的相互作用和代償機(jī)制，從而影響P-Ezrin的升高幅度。P-Ezrin水平的升高與細(xì)胞遷移和侵襲能力密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。因此，MCLR和TBT誘導(dǎo)HL7702細(xì)胞中P-Ezrin水平升高，提示這兩種污染物可能通過增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展尤其是轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮潛在作用，這為進(jìn)一步研究其致癌機(jī)制提供了重要線索。3.2.2P-Ezrin與PP2A-C亞基共定位情況為探究MCLR和TBT作用下HL7702細(xì)胞內(nèi)P-Ezrin與PP2A-C亞基的相互關(guān)系，采用免疫熒光共定位技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。在對照組HL7702細(xì)胞中，P-Ezrin主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，呈現(xiàn)綠色熒光；PP2A-C亞基在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布，呈現(xiàn)紅色熒光，二者僅有少量微弱的共定位現(xiàn)象，合并圖像中顯示為黃色熒光。在MCLR和TBT染毒組中，雖然P-Ezrin和PP2A-C亞基各自的熒光強(qiáng)度和分布區(qū)域有所變化，但二者仍然沒有明顯的共定位現(xiàn)象。[此處插入免疫熒光共定位圖片，包括對照組、MCLR低劑量組、MCLR高劑量組、TBT低劑量組、TBT高劑量組HL7702細(xì)胞中P-Ezrin（綠色）、PP2A-C亞基（紅色）以及二者合并（黃色）的免疫熒光圖像，標(biāo)尺為20μm]PP2A是一種重要的蛋白磷酸酶，參與多種細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)，其活性的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一般情況下，蛋白的磷酸化和去磷酸化處于動態(tài)平衡，而PP2A在其中發(fā)揮著去磷酸化的作用。在本研究中，MCLR和TBT作用下HL7702細(xì)胞內(nèi)P-Ezrin水平升高，然而P-Ezrin與PP2A-C亞基卻沒有共定位現(xiàn)象，這表明MCLR和TBT可能不是通過直接影響PP2A與P-Ezrin的相互作用來調(diào)節(jié)P-Ezrin的水平?？赡艿脑蚴荕CLR和TBT激活了其他的蛋白激酶，如蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，促使Ezrin磷酸化形成P-Ezrin；或者是MCLR和TBT抑制了其他參與Ezrin去磷酸化的磷酸酶的活性，從而導(dǎo)致P-Ezrin水平升高。這一結(jié)果對于理解MCLR和TBT的作用機(jī)制具有重要意義，提示后續(xù)研究需要關(guān)注其他可能參與調(diào)節(jié)Ezrin磷酸化的信號通路和蛋白，為深入揭示這兩種污染物的潛在致癌機(jī)制提供了新的方向。四、討論4.1MCLR和TBT對小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞影響的一致性與差異在本研究中，無論是小鼠肝臟實(shí)驗(yàn)還是HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，MCLR和TBT處理后均出現(xiàn)P-Ezrin水平升高的現(xiàn)象，這一結(jié)果體現(xiàn)了兩種模型在對這兩種環(huán)境污染物響應(yīng)上的一致性。P-Ezrin水平的升高與細(xì)胞遷移和侵襲能力密切相關(guān)，表明MCLR和TBT可能通過相似的分子機(jī)制，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展尤其是轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮潛在作用。這一一致性結(jié)果為進(jìn)一步深入研究MCLR和TBT的致癌機(jī)制提供了有力的證據(jù)，提示P-Ezrin可能是這兩種污染物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。然而，除了P-Ezrin水平升高這一共同結(jié)果外，其他檢測指標(biāo)在小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出不同的變化趨勢。在小鼠肝臟中，MCLR和TBT處理未引起IQGAP1、AKT、ERK、JNK、P-38表達(dá)水平以及PP2A酶活性的明顯變化；而在HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，僅對Ezrin和P-Ezrin的表達(dá)進(jìn)行了檢測，對于其他蛋白的研究未涉及。這些差異可能是由多種因素導(dǎo)致的。首先，小鼠肝臟是一個(gè)復(fù)雜的器官，包含多種細(xì)胞類型，不同細(xì)胞之間存在相互作用和代償機(jī)制。當(dāng)受到MCLR和TBT刺激時(shí)，肝臟內(nèi)的各種細(xì)胞可能通過復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，使得一些蛋白的表達(dá)和酶活性維持相對穩(wěn)定。例如，肝臟中的枯否細(xì)胞、星狀細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞可能通過分泌細(xì)胞因子等方式，影響肝細(xì)胞對污染物的反應(yīng)，從而掩蓋了MCLR和TBT對某些蛋白的直接作用。而HL7702細(xì)胞是一種單一的細(xì)胞系，缺乏細(xì)胞間的相互作用和復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，對污染物的反應(yīng)更為直接，更容易檢測到蛋白表達(dá)的變化。其次，小鼠和人類細(xì)胞在代謝途徑和生理功能上存在一定差異。小鼠肝臟對MCLR和TBT的代謝和解毒能力可能與HL7702細(xì)胞不同，這會影響污染物在細(xì)胞內(nèi)的濃度和作用時(shí)間，進(jìn)而導(dǎo)致對相關(guān)蛋白的影響不同。例如，小鼠肝臟中可能存在一些特異性的酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠有效地代謝或排出MCLR和TBT，減少它們對細(xì)胞內(nèi)蛋白的影響；而HL7702細(xì)胞可能缺乏這些有效的代謝和解毒機(jī)制，使得污染物在細(xì)胞內(nèi)積累，對蛋白表達(dá)產(chǎn)生更明顯的影響。此外，實(shí)驗(yàn)條件的差異，如染毒劑量、染毒時(shí)間等，也可能導(dǎo)致結(jié)果的不同。在本研究中，小鼠肝臟實(shí)驗(yàn)和HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用了不同的染毒劑量和時(shí)間，這些因素可能會影響污染物對細(xì)胞的損傷程度和作用方式，從而導(dǎo)致檢測指標(biāo)的變化不一致。綜上所述，小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果既有一致性，也存在差異。P-Ezrin水平升高的一致性結(jié)果為研究MCLR和TBT的致癌機(jī)制提供了重要線索；而其他指標(biāo)的差異則提示在研究環(huán)境污染物的毒性作用時(shí)，需要綜合考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶攸c(diǎn)、細(xì)胞代謝差異以及實(shí)驗(yàn)條件等因素，以更全面、準(zhǔn)確地揭示污染物的作用機(jī)制。后續(xù)研究可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜋z測方法，深入探討MCLR和TBT對不同細(xì)胞類型和組織的影響，為評估其對人類健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供更可靠的依據(jù)。4.2P-Ezrin水平升高的潛在機(jī)制與意義MCLR和TBT導(dǎo)致P-Ezrin水平升高的潛在機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。從信號通路角度來看，已有研究表明，MCLR能夠抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A）的活性，而PP2A作為一種重要的蛋白磷酸酶，參與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的去磷酸化過程。當(dāng)PP2A活性被抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化水平可能會發(fā)生改變。雖然在本研究中未檢測到MCLR和TBT對小鼠肝臟及HL7702細(xì)胞中PP2A酶活性的明顯影響，但不能排除其對PP2A相關(guān)信號通路的其他影響方式。例如，MCLR可能通過干擾PP2A與底物的結(jié)合，間接影響Ezrin的去磷酸化過程，從而導(dǎo)致P-Ezrin水平升高。TBT可能通過激活蛋白激酶C（PKC）信號通路來促進(jìn)Ezrin的磷酸化。PKC是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，能夠催化多種底物蛋白的磷酸化。有研究報(bào)道，TBT暴露可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PKC活性升高，進(jìn)而使Ezrin發(fā)生磷酸化。此外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也可能參與其中。MAPK家族包括ERK、JNK、P-38等成員，在細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，MAPK信號通路被激活，通過級聯(lián)反應(yīng)磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程。雖然本研究中未觀察到MCLR和TBT對小鼠肝臟中ERK、JNK、P-38表達(dá)水平的明顯影響，但不排除它們對這些蛋白活性或其下游信號通路的調(diào)節(jié)作用。MAPK信號通路的激活可能導(dǎo)致Ezrin磷酸化，從而使P-Ezrin水平升高。從蛋白相互作用方面考慮，Ezrin作為一種膜-細(xì)胞骨架連接蛋白，其磷酸化狀態(tài)的改變可能與其他蛋白的相互作用有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，Ezrin與多種蛋白形成復(fù)合物，如與CD44、ICAM-1等細(xì)胞表面黏附分子相互作用，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附過程。MCLR和TBT可能通過影響Ezrin與這些蛋白的相互作用，間接調(diào)節(jié)Ezrin的磷酸化水平。例如，MCLR和TBT可能改變細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)或構(gòu)象，使得Ezrin更容易與蛋白激酶接近，從而促進(jìn)其磷酸化；或者影響Ezrin與磷酸酶的結(jié)合，抑制其去磷酸化，導(dǎo)致P-Ezrin水平升高。P-Ezrin水平升高對腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要影響。在細(xì)胞增殖方面，P-Ezrin可能通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤細(xì)胞中，P-Ezrin與細(xì)胞周期蛋白D1等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。在本研究中，MCLR和TBT誘導(dǎo)P-Ezrin水平升高，可能通過類似的機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展奠定基礎(chǔ)。在細(xì)胞遷移能力方面，P-Ezrin的升高與細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。Ezrin磷酸化后，能夠增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，使細(xì)胞產(chǎn)生偽足等結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞需要從原發(fā)部位脫離，遷移到其他組織器官。MCLR和TBT導(dǎo)致P-Ezrin水平升高，可能使細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移能力，增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，P-Ezrin的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著相關(guān)。本研究中觀察到的P-Ezrin水平升高現(xiàn)象，提示MCLR和TBT可能通過促進(jìn)細(xì)胞遷移，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮潛在作用。4.3研究結(jié)果對理解腫瘤發(fā)生機(jī)制的貢獻(xiàn)本研究在揭示微囊藻毒素LR和三丁基錫致毒方式方面取得了重要發(fā)現(xiàn)。通過體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)和體外HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了MCLR和TBT能夠誘導(dǎo)P-Ezrin水平升高，這一結(jié)果為闡明它們的致毒機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。P-Ezrin水平升高表明這兩種污染物可能通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)Ezrin的磷酸化，從而影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這一發(fā)現(xiàn)不僅豐富了對MCLR和TBT毒理學(xué)效應(yīng)的認(rèn)識，還為進(jìn)一步研究它們在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了新的方向。從腫瘤發(fā)生機(jī)制研究角度來看，本研究結(jié)果對現(xiàn)有理論起到了重要的補(bǔ)充和完善作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞的遷移和侵襲是關(guān)鍵步驟，而P-Ezrin在其中扮演著重要角色。本研究明確了MCLR和TBT能夠誘導(dǎo)P-Ezrin水平升高，這意味著這兩種環(huán)境污染物可能通過增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。以往的研究雖然關(guān)注到環(huán)境污染物與腫瘤發(fā)生的關(guān)聯(lián)，但對于具體的分子機(jī)制研究相對較少。本研究通過對MCLR和TBT作用下腫瘤相關(guān)蛋白的檢測和分析，深入探討了它們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的影響，填補(bǔ)了這一領(lǐng)域在分子機(jī)制研究方面的部分空白。本研究結(jié)果還為腫瘤預(yù)防和治療提供了新思路。既然MCLR和TBT能夠通過誘導(dǎo)P-Ezrin水平升高促進(jìn)腫瘤相關(guān)的細(xì)胞行為改變，那么在腫瘤預(yù)防方面，可以加強(qiáng)對環(huán)境中MCLR和TBT的監(jiān)測和管控，減少人類和動物對這兩種污染物的暴露，從而降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。在腫瘤治療領(lǐng)域，P-Ezrin可能成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。針對P-Ezrin的作用機(jī)制，研發(fā)能夠抑制Ezrin磷酸化或阻斷P-Ezrin相關(guān)信號通路的藥物，可能有助于抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，為腫瘤的治療提供新的策略。此外，本研究中關(guān)于MCLR和TBT對其他腫瘤相關(guān)蛋白及信號通路影響的探索，也為進(jìn)一步篩選和開發(fā)腫瘤治療的新靶點(diǎn)和新藥物提供了理論基礎(chǔ)。4.4研究的局限性與展望本研究在探究微囊藻毒素LR和三丁基錫對小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞部分腫瘤相關(guān)蛋白的影響方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，本研究僅設(shè)置了兩個(gè)劑量組來研究MCLR和TBT的毒性效應(yīng)，劑量范圍相對較窄，可能無法全面反映這兩種污染物在不同劑量下的復(fù)雜作用。未來研究可增加更多劑量組，涵蓋更低和更高的劑量范圍，以更準(zhǔn)確地確定劑量-效應(yīng)關(guān)系，明確污染物的無觀察效應(yīng)水平（NOEL）和最低可觀察效應(yīng)水平（LOEL），為環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估提供更精確的數(shù)據(jù)。此外，本研究的染毒時(shí)間相對較短，無論是小鼠肝臟實(shí)驗(yàn)的28天染毒，還是HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的24小時(shí)染毒，可能不足以觀察到污染物長期累積效應(yīng)以及對腫瘤相關(guān)蛋白的慢性影響。后續(xù)研究可延長染毒時(shí)間，開展亞慢性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)，觀察污染物在長期暴露下對機(jī)體的影響，進(jìn)一步探究其潛在的致癌過程和機(jī)制。從檢測指標(biāo)來看，本研究主要聚焦于IQGAP1、AKT、Ezrin、P-Ezrin、PP2A、ERK、JNK、P-38等少數(shù)幾種腫瘤相關(guān)蛋白及PP2A酶活性。然而，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及眾多信號通路和蛋白相互作用的復(fù)雜過程，僅檢測這些指標(biāo)難以全面揭示MCLR和TBT的致癌機(jī)制。未來研究可擴(kuò)大檢測范圍，納入更多與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白和信號通路，如與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白（Cyclin、CDK等）、與凋亡相關(guān)的蛋白（Bcl-2家族、Caspase家族等）、與血管生成相關(guān)的蛋白（VEGF等），以及其他可能受MCLR和TBT影響的信號通路（如Wnt/β-catenin信號通路、NF-κB信號通路等），以更全面地了解污染物對腫瘤相關(guān)生物學(xué)過程的影響。在研究對象上，本研究僅選用了C57BL/6小鼠和人正常肝細(xì)胞HL7702。雖然小鼠和HL7702細(xì)胞在一定程度上能夠模擬人類對污染物的反應(yīng)，但它們與人體仍存在差異。不同物種對污染物的代謝、解毒能力以及對腫瘤發(fā)生的易感性各不相同，單一的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂赡軣o法完全反映MCLR和TBT對人類健康的真實(shí)風(fēng)險(xiǎn)。未來研究可采用多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，如其他品系的小鼠、大鼠、非人靈長類動物等，以及不同組織來源的細(xì)胞系，如腫瘤細(xì)胞系等，進(jìn)行對比研究，以更全面地評估污染物對不同生物系統(tǒng)和細(xì)胞類型的影響，增強(qiáng)研究結(jié)果的外推性和可靠性?；诒狙芯康木窒扌?，未來可從以下方向進(jìn)一步深入研究。一方面，深入探究MCLR和TBT對腫瘤相關(guān)信號通路的動態(tài)調(diào)控機(jī)制。利用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，全面分析污染物暴露后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和基因表達(dá)的動態(tài)變化，構(gòu)建完整的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示MCLR和TBT在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中不同階段的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制。另一方面，研究MCLR和TBT與其他環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)。在實(shí)際環(huán)境中，生物體往往同時(shí)暴露于多種污染物，這些污染物之間可能存在協(xié)同或拮抗作用，影響它們對腫瘤相關(guān)蛋白的調(diào)控和致癌風(fēng)險(xiǎn)。通過開展聯(lián)合染毒實(shí)驗(yàn)，研究不同污染物組合對小鼠肝臟和細(xì)胞中腫瘤相關(guān)蛋白的影響，有助于更真實(shí)地評估環(huán)境污染物對人類健康的綜合風(fēng)險(xiǎn)。此外，還可從體內(nèi)代謝動力學(xué)角度研究MCLR和TBT在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程，明確污染物在體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律，為解釋其毒性作用機(jī)制提供更深入的依據(jù)。五、結(jié)論5.1研究主要成果總結(jié)本研究通過體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)和體外HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)探究了微囊藻毒素LR和三丁基錫對部分腫瘤相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果表明，MCLR和TBT處理后，小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞中P-Ezrin水平均顯著升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性，而其他檢測蛋白如IQGAP1、AKT、ERK、JNK、P-38在小鼠肝臟中的表達(dá)水平以及PP2A酶活性在小鼠肝臟和HL7702細(xì)胞中均無明顯變化。在HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，僅對Ezrin和P-Ezrin的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示Ezrin表達(dá)水平無明顯變化，而P-Ezrin表達(dá)水平顯著升高。免疫熒光共定位結(jié)果顯示，MCLR和TBT作用下HL7702細(xì)胞內(nèi)P-Ezrin與PP2A-C亞基沒有明顯的共定位現(xiàn)象。這些結(jié)果提示，P-Ezrin可能是與MCLR和TBT作用密切相關(guān)的重要蛋白，為進(jìn)一步研究這兩種環(huán)境污染物的致毒方式和潛在致癌機(jī)制提供了新的靶點(diǎn)和方向。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與實(shí)踐意義本研究在環(huán)境污染物與腫瘤相關(guān)蛋白關(guān)系的研究領(lǐng)域展現(xiàn)出多方面創(chuàng)新。從研究視角來看，創(chuàng)新性地將微囊藻毒素LR和三丁基錫這兩種具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和污染來源的環(huán)境污染物結(jié)合起來，探究它們對同一組腫瘤相關(guān)蛋白的影響。以往研究多集中于單一污染物的毒性效應(yīng)，而本研究考慮到實(shí)際環(huán)境中生物體往往同時(shí)暴露于多種污染物的情況，為評估復(fù)合污染的健康風(fēng)險(xiǎn)提供了新的研究思路。在腫瘤相關(guān)蛋白的選擇上，聚焦于IQGAP1、AKT、Ezrin、P-Ezrin、PP2A、ERK、JNK、P-38等與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)但在這兩種污染物研究中較少涉及的蛋白，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這些蛋白與污染物關(guān)聯(lián)研究上的空白。在實(shí)驗(yàn)方法方面，采用體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)和體外HL7702細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，全面評估污染物對不同生物模型的影響。這種體內(nèi)外聯(lián)合的研究方法能夠充分發(fā)揮兩種模型的優(yōu)勢，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可反映污染物在整體生物體內(nèi)的綜合作用，體外實(shí)驗(yàn)則能精確控制實(shí)驗(yàn)條件，深入探究分子機(jī)制，為環(huán)境污染物毒性研究提供了更全面、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方法體系。同時(shí)，運(yùn)用多種先進(jìn)的檢測技術(shù)，如Westernblot、免疫組化、免疫熒光共定位和酶活性檢測等，從蛋白表達(dá)水平、蛋白定位以及酶活性等多個(gè)層面分析腫瘤相關(guān)蛋白的變化，為研究結(jié)果提供了多維度的證據(jù)支持。本研究的實(shí)踐意義十分顯著。在環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域，研究成果為深入理解微囊藻毒素LR和三丁基錫的毒性作用機(jī)制提供了關(guān)鍵信息，有助于完善這兩種污染物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估體系。通過明確它們對腫瘤相關(guān)蛋白的影響，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測污染物在環(huán)境中的潛在危害，為制定更嚴(yán)格的環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和污染管控措施提供科學(xué)依據(jù)。例如，基于本研究發(fā)現(xiàn)P-Ezrin水平升高與這兩種污染物暴露的關(guān)聯(lián)，可將P-Ezrin作為生物標(biāo)志物，用于監(jiān)測環(huán)境中微囊藻毒素LR和三丁基錫的污染程度及其對生物體的早期毒性效應(yīng)。在腫瘤防治領(lǐng)域，本研究為腫瘤的預(yù)防和治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。既然P-Ezrin被證明與這兩種污染物的致毒作用密切相關(guān)，且其水平升高與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)相關(guān)，那么針對P-Ezrin及其相關(guān)信號通路的干預(yù)措施可能成為預(yù)防和治療腫瘤的新方向。在腫瘤預(yù)防方面，可通過減少環(huán)境中微囊藻毒素LR和三丁基錫的排放，降低人群暴露風(fēng)險(xiǎn)，從而減少因環(huán)境污染物誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生。在腫瘤治療方面，研發(fā)能夠抑制P-Ezrin磷酸化或阻斷其相關(guān)信號通路的藥物，有望成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、提高腫瘤治療效果的新策略。此外，本研究對其他腫瘤相關(guān)蛋白及信號通路的探索，也為進(jìn)一步篩選和開發(fā)腫瘤治療的新靶點(diǎn)和新藥物提供了理論基礎(chǔ)。六、參考文獻(xiàn)[1]孟冠敏，徐立紅。蛋白磷酸酶2A與微囊藻毒素的毒性效應(yīng)[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2010,32(1):24-30.[2]王小寧，楊傳璽，宗萬松。微囊藻毒素生物毒性作用機(jī)制與調(diào)控策略的研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染與防治，2015,37(6):90-95.[3]秦偉，王婷。微囊藻毒素毒性的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2014,27(23):3121-3122.[4]傅文宇，李敏偉，陳加平，徐立紅。一種檢測微囊藻毒素LR誘導(dǎo)大鼠腎細(xì)胞凋亡的方法[J].水生生物學(xué)報(bào)，2004,28(1):101-102.[5]陳加平，翁登坡，傅文宇，徐立紅。微囊藻毒素LR對大鼠淋巴細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)[J].水生生物學(xué)報(bào)，2004,28(6):677-678.[6]SHIYG.Assemblyandstructureofproteinphosphatase2A[J].ScienceChinaLifeSciences,2009,52(2):135-146.[7]盛建武，何苗，施漢昌，錢易。微囊藻毒素-LR多克隆抗體的制備[J].環(huán)境科學(xué)，2006,27(4):783-786.[8]雷臘梅，甘南琴，張小明，宋立榮。三種檢測微囊藻毒素的ELISA方法比較研究[J].高技術(shù)通訊，2004,14(7):89-92.[9]盛建武，何苗，宋保棟，施漢昌，錢易。微囊藻毒素-LR完全抗原的設(shè)計(jì)及制備[J].環(huán)境科學(xué)，2005,26(3):33-37.[10]夏璐，丘冠英.DNA鏈斷裂檢測技術(shù)的進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1997,24(1):31-35.[11]VermesI,HannenC,Steffens-NakkenH,etal.Anovelassayforapoptosis.FlowcytometricdetectionofphosphatidylserineexpressiononearlyapoptoticcellsusingfluoresceinlabeledAnnexinV[J].JournalofImmunologicalMethods,1995,184(1):39-51.[12]SchindlA,KlosnerG.FlowcytometricquantificationofUV-inducedcelldeathinahumanaquamouscellcarcinoma-derivedcellline:doseandkineticstudies[J].JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology,1998,44(2):97-106.[13]IngridC,JamieB.ToxicCyanobacteriainWater[M].LondonandNewYork:E&FNSponPublisher,1999:416.[14]SivonenK.Cyanobacterialtoxinsandtoxinproduction[J].Phycologia,1996,35(Suppl6):12-24.[15]DahlmannJ,BudakowskiWesR,LuckasB.Liquidchromatography-electrosprayionisation-massspectrometrybasedmethodforthesimultaneousdeterminationofalgalandcyanobacterialtoxinsinphytoplanktonfrommarinewatersandlakesfollowedbytentativestructuralelucidationofmicrocystins[J].JournalofChromatographyA,2003,994(1-2):45-57.[16]RivasseauC,MartinsS,HennionMC,etal.Determinationofsomephysicochemicalparametersofmicrocystins(cyanobacterialtoxins)andtracelevelanalysisinenvironmentalsamplesusingliquidchromatography[J].JournalofChromatographyA,1998,799(1-2):155.[17]LawrenceJF,MenardC.Determinationofmicrocystinsinblue-greenalgae,fishandwaterusingliquidchromatographywithultravioletdetectionaftersampleclean-upemployingimmunoaffinitychromatography[J].JournalofChromatographyA,2001,922(1-2):111-117.[18]許川山，AlbertWingNangLeung,楊青.MPPa光動力作用對鼻咽癌細(xì)胞生長抑制的初步研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,28(14):1457-1460.[19]苗艷艷，孔心涓，田字彬。原發(fā)性肝癌危險(xiǎn)因素及其致癌機(jī)制的研究進(jìn)展[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012,48(1):91-92.[20]張亞莉，孫利軍。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