高中生物動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教案與試題一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教案（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.知識(shí)目標(biāo)：理解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的核心原理（細(xì)胞體外生存條件、原代與傳代培養(yǎng)的本質(zhì)區(qū)別），掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作流程。2.能力目標(biāo)：通過實(shí)操訓(xùn)練，提升無菌操作、顯微觀察及實(shí)驗(yàn)問題分析能力；學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)簡單實(shí)驗(yàn)優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件。3.情感目標(biāo)：體會(huì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥、細(xì)胞治療等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，培養(yǎng)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度。（二）實(shí)驗(yàn)原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、37℃恒溫、pH7.2~7.4、5%CO?維持酸堿平衡），使細(xì)胞在體外存活、增殖的技術(shù)。核心過程包括：原代培養(yǎng)：從動(dòng)物機(jī)體（如胚胎、幼齡組織）取出細(xì)胞后首次培養(yǎng)，細(xì)胞保留原有生物學(xué)特性（如分裂能力、分化潛能）。傳代培養(yǎng)：原代細(xì)胞增殖至“接觸抑制”（細(xì)胞貼壁生長成單層后，因相互接觸停止分裂）時(shí)，用胰蛋白酶分解細(xì)胞間蛋白質(zhì)，使細(xì)胞分散成單個(gè)，再轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)（部分細(xì)胞可能因“轉(zhuǎn)化”獲得無限增殖能力）。（三）材料與用具生物材料：幼齡小鼠胚胎（或肝臟、腎臟組織，細(xì)胞分裂能力強(qiáng)）、胎牛血清（提供生長因子、貼壁因子）。培養(yǎng)基：DMEM（或RPMI-1640）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含氨基酸、維生素、無機(jī)鹽），添加10%胎牛血清、雙抗（青霉素+鏈霉素，抑制細(xì)菌污染）。器械與設(shè)備：超凈工作臺(tái)（無菌操作）、CO?培養(yǎng)箱（控溫+控氣）、倒置顯微鏡（觀察細(xì)胞）、手術(shù)剪、鑷子、培養(yǎng)瓶、移液管、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液（清洗組織）。（四）實(shí)驗(yàn)步驟（原代培養(yǎng)+傳代培養(yǎng)）1.原代培養(yǎng)：組織處理與接種步驟1：組織獲取與處理無菌條件下取出胚胎（或幼齡組織），用PBS沖洗3次（去除血污）；將組織剪碎成1~2mm3的小塊，加入適量0.25%胰蛋白酶，37℃消化10~15分鐘（觀察細(xì)胞變圓、脫離組織塊時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶）。步驟2：細(xì)胞接種用移液管吹打消化后的組織/細(xì)胞懸液，使細(xì)胞分散成單個(gè)；將懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000rpm離心5分鐘，棄上清（去除雜質(zhì)）；加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10?個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶（每瓶5~10mL），標(biāo)記后放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱。2.傳代培養(yǎng)：細(xì)胞分散與擴(kuò)增步驟1：觀察與準(zhǔn)備培養(yǎng)2~3天后，顯微鏡下觀察細(xì)胞：若貼壁生長成單層（接觸抑制），需傳代。提前預(yù)熱胰蛋白酶、培養(yǎng)基，超凈臺(tái)紫外滅菌30分鐘。步驟2：細(xì)胞消化與傳代棄舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞（去除殘留血清）；加入適量胰蛋白酶，37℃消化3~5分鐘（細(xì)胞變圓、脫離瓶壁時(shí)，加入培養(yǎng)基終止）；吹打瓶壁使細(xì)胞完全分散，按1:2~1:4的比例轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。（五）注意事項(xiàng)（核心操作規(guī)范）1.無菌操作：所有器械、試劑需滅菌（移液管高壓滅菌，培養(yǎng)基過濾除菌）；操作時(shí)關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈，佩戴手套、口罩，避免交談。2.胰蛋白酶處理：時(shí)間過短→細(xì)胞未分散，過長→細(xì)胞膜蛋白被分解（細(xì)胞死亡）。可通過顯微鏡觀察“細(xì)胞變圓、懸浮”判斷終止時(shí)機(jī)，或用血清（含蛋白酶抑制劑）快速中和。3.環(huán)境控制：CO?培養(yǎng)箱需定期消毒（75%酒精擦拭），溫度、CO?濃度每日校準(zhǔn)；培養(yǎng)基需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融。4.污染防控：若培養(yǎng)基渾濁（細(xì)菌污染）或出現(xiàn)菌絲（真菌污染），立即丟棄污染瓶，徹底消毒操作臺(tái)；實(shí)驗(yàn)前用75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶、器械。（六）教學(xué)過程設(shè)計(jì)1.導(dǎo)入（5分鐘）展示“新冠疫苗生產(chǎn)（Vero細(xì)胞培養(yǎng)）”“單克隆抗體研發(fā)”的流程圖，提問：“如何在實(shí)驗(yàn)室‘復(fù)制’體內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要哪些條件？”引發(fā)學(xué)生興趣。2.原理講解（10分鐘）結(jié)合PPT動(dòng)畫，講解“細(xì)胞生存的體外環(huán)境（溫度、pH、氣體）”“原代vs傳代培養(yǎng)的本質(zhì)區(qū)別”“胰蛋白酶的作用機(jī)制”，用類比（如“細(xì)胞貼壁像種子扎根土壤”“接觸抑制像人群擁擠時(shí)停止移動(dòng)”）幫助理解。3.實(shí)操訓(xùn)練（25分鐘）分組：4人一組，明確“組織處理員”“接種員”“記錄員”職責(zé)。教師示范：無菌操作（超凈臺(tái)使用、器械滅菌）、胰蛋白酶消化的“時(shí)間-形態(tài)”判斷。學(xué)生實(shí)操：按步驟處理組織、接種細(xì)胞，教師巡視糾正（如“移液管避免觸碰瓶口”“胰蛋白酶處理后及時(shí)中和”）。4.總結(jié)與反思（5分鐘）提問：“原代培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟是什么？傳代時(shí)為何要‘分散細(xì)胞’？”引導(dǎo)學(xué)生回顧核心邏輯。反思：“若細(xì)胞貼壁率低，可能的原因有哪些？（如血清質(zhì)量差、胰蛋白酶過度消化、培養(yǎng)瓶未包被）”，培養(yǎng)問題分析能力。（七）教學(xué)反思學(xué)生常見問題：①無菌操作不規(guī)范（如超凈臺(tái)內(nèi)快速移動(dòng)、器械交叉污染）；②胰蛋白酶處理時(shí)間失控（導(dǎo)致細(xì)胞死亡或未分散）；③觀察記錄不及時(shí)（錯(cuò)過傳代最佳時(shí)機(jī)）。后續(xù)需強(qiáng)化“操作-觀察-記錄”的連貫性訓(xùn)練，增設(shè)“污染模擬”（如故意滴加菌液，觀察污染特征）提升防控意識(shí)。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)試題（分層考察）（一）選擇題（基礎(chǔ)應(yīng)用）1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，最適宜的組織材料是（）A.老年動(dòng)物的肌肉組織B.胚胎或幼齡動(dòng)物的肝臟組織C.癌變的腫瘤組織D.成年動(dòng)物的神經(jīng)組織*答案：B（胚胎/幼齡組織細(xì)胞分裂能力強(qiáng)，易培養(yǎng)；神經(jīng)組織高度分化，難增殖）*2.CO?培養(yǎng)箱的核心作用是（）A.提供O?供細(xì)胞呼吸B.提供CO?刺激細(xì)胞分裂C.維持溫度和pH穩(wěn)定D.營造無菌環(huán)境*答案：C（37℃模擬體溫，5%CO?使培養(yǎng)基中NaHCO?分解為H?CO?，維持pH7.2~7.4）*（二）簡答題（原理分析）1.簡述原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的區(qū)別（從細(xì)胞來源、生物學(xué)特性、應(yīng)用場(chǎng)景分析）。*參考答案：①來源：原代培養(yǎng)是“直接從機(jī)體取組織→培養(yǎng)”，傳代是“原代細(xì)胞增殖后→分瓶培養(yǎng)”；②特性：原代細(xì)胞保留原有分化潛能（如肝細(xì)胞仍能合成白蛋白），傳代細(xì)胞可能因“轉(zhuǎn)化”獲得無限增殖能力（如HeLa細(xì)胞）；③應(yīng)用：原代培養(yǎng)用于短期研究（如藥物毒性測(cè)試），傳代培養(yǎng)用于大規(guī)模擴(kuò)增（如疫苗生產(chǎn)）。*2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，胰蛋白酶的作用及處理注意事項(xiàng)是什么？*參考答案：作用：分解細(xì)胞間的膠原蛋白、黏連蛋白，使細(xì)胞分散成單個(gè)，便于接種或傳代。注意：①處理前用PBS沖洗（去除血清，避免中和酶）；②37℃消化（加速酶活性），但時(shí)間≤5分鐘（防止分解細(xì)胞膜蛋白）；③細(xì)胞變圓、懸浮時(shí)，立即加血清終止。*（三）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題（綜合創(chuàng)新）某小組發(fā)現(xiàn)“培養(yǎng)的細(xì)胞生長緩慢，增殖能力弱”，推測(cè)可能與血清濃度（或溫度、pH）有關(guān)。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究“血清濃度對(duì)細(xì)胞生長的影響”，寫出實(shí)驗(yàn)思路（自變量、因變量、無關(guān)變量控制）。*參考答案：①自變量：血清濃度（設(shè)梯度：0%、5%、10%、20%，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照）；②因變量：細(xì)胞密度（每日用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）、生長速率（繪制生長曲線）；③無關(guān)變量：接種密度（每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞）、溫度（37℃）、CO?濃度（5%）、培養(yǎng)瓶規(guī)格（一致）；④實(shí)驗(yàn)步驟：a.取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×10?個(gè)/mL；b.分組：將細(xì)胞懸液分為4組，分別加入含0%、5%、10%、20%血清的培養(yǎng)基，每組3個(gè)重復(fù)；c.接種后放入CO?培養(yǎng)箱，每日同一時(shí)間取樣，計(jì)數(shù)并記錄；d.繪制生長曲線，分析血清濃度與細(xì)胞生長的關(guān)系。*（四）案例分析題（問題解決）某同學(xué)的細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)“培養(yǎng)基渾濁，細(xì)胞形態(tài)異常（變圓、脫落）”，結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理，分析可能的污染類型及處理措施。*參考答案：①污染類型：細(xì)菌污染（培養(yǎng)基渾濁，鏡下可見大量短桿狀/球狀細(xì)菌）或真菌污染（培養(yǎng)基表面有菌絲，鏡下可見分支狀菌絲）。②處理措施：立即丟棄污染的培養(yǎng)瓶，避免交叉污染；用75%酒精擦拭超凈臺(tái)、