脂肪細胞脂質(zhì)代謝異常及其對肝細胞營養(yǎng)感應(yīng)信號的影響和機制一、立項依據(jù)（項目所面向的我國經(jīng)濟、社會、國家安全和科學(xué)技術(shù)自身發(fā)展的重大需求，項目研究的科學(xué)意義，對解決國家重大需求問題的預(yù)期貢獻等）近20年來我國高脂血癥或脂質(zhì)代謝異常發(fā)生率明顯升高，伴隨的人群心血管疾病發(fā)生率也顯著增加。高脂血癥主要是指膽固醇和(或)甘油三酯升高，脂質(zhì)代謝異常還包括高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)降低。高脂血癥發(fā)生的原因諸多，對機體所產(chǎn)生損害的作用機制也非常復(fù)雜。目前認為，脂肪和肝臟是高脂血癥和脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)生密切相關(guān)的組織。所以，脂肪細胞脂質(zhì)代謝異常及病理性脂肪因子分泌增多，必然會對肝細胞內(nèi)營養(yǎng)感應(yīng)信號產(chǎn)生重要的作用，這也是當(dāng)前研究的熱點。而脂肪細胞是如何影響肝臟的脂質(zhì)代謝，也將是未來幾年的研究方向和重點，這些研究可為探索高脂血癥的發(fā)病機制及防治措施提供新的思路。二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢（國際最新研究進展和發(fā)展趨勢，國內(nèi)研究現(xiàn)狀和水平，在相關(guān)研究領(lǐng)域取得突破的機遇等）目前認為，脂肪組織已不僅是能量儲存器官，還具有分泌瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等脂肪因子，調(diào)節(jié)糖、脂代謝等功能。但是，在肥胖狀態(tài)下，脂肪細胞可發(fā)生功能失調(diào)，主要表現(xiàn)為胰島素抵抗，分泌功能紊亂和病理性脂肪因子分泌增多[1,2]。然而，有關(guān)脂肪細胞功能失調(diào)的原因及其機制尚待深入探討。雖然，我們對脂肪細胞的能量代謝有較為深入地了解，但對脂肪細胞參與膽固醇的代謝過程及機制卻知之不多。有研究表明，膽固醇穩(wěn)態(tài)對于維持脂肪細胞正常的生理功能具有重要意義。脂肪細胞肥大，胰島素抵抗，分泌功能紊亂，膽固醇穩(wěn)態(tài)失衡可能是其中的關(guān)鍵機制[3]。脂肪細胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)失衡主要表現(xiàn)為胞內(nèi)膽固醇聚集，而細胞膜膽固醇含量降低。有研究表明，細胞內(nèi)膽固醇失穩(wěn)態(tài)可能是脂肪細胞功能異常的關(guān)鍵所在：用環(huán)糊精介導(dǎo)脂肪細胞膜膽固醇流出，模擬肥大脂肪細胞胞膜膽固醇相對減少狀態(tài)，可導(dǎo)致細胞表現(xiàn)出胰島素抵抗，分泌功能異常[4]；反之，糾正細胞膽固醇失衡，則可一定程度改善脂肪細胞的功能[5]。但是，目前，膽固醇失穩(wěn)態(tài)致細胞功能異常的機制尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一種重要的細胞應(yīng)激反應(yīng)，過強或過長時間的激活會影響細胞的代謝及功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)進行蛋白合成、修飾、折疊和亞基組合的重要場所，蛋白是否被折疊成正確構(gòu)像有賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。當(dāng)不利因素干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能時，未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，引起非折疊蛋白反應(yīng)（unfoldedproteinresponse,UPR），即促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。游離膽固醇具有顯著的細胞毒性，有研究發(fā)現(xiàn)，在膽固醇過度負荷的巨噬細胞，隨著膽固醇轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，巨噬細胞則出現(xiàn)明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[7]。近期已有研究證實肥胖小鼠脂肪細胞內(nèi)存在增強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并與其胰島素抵抗有關(guān)[8,9]。對其他類型細胞的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞及巨噬細胞表達分泌IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子；與此同時，在炎癥因子表達分泌的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的IKK/NF-κB通路在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時可被激活[10]。因此，基于以上證據(jù)，我們推測：脂肪細胞內(nèi)膽固醇過度負荷，過多的膽固醇轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，觸發(fā)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而導(dǎo)致細胞分泌功能異常，而其中IKK/NF-κB通路可能在其中起介導(dǎo)作用。脂肪因子的影響包括全身（內(nèi)分泌）和局部作用（旁分泌）。近來研究提示，內(nèi)臟周圍的脂肪積聚可對其臨近的器官產(chǎn)生損害，例如，心臟、血管及腎臟的周圍脂肪組織堆積能增加相應(yīng)器官的損害并增加心血管病的危險[11]，提示脂肪組織的作用與其旁分泌效應(yīng)密切相關(guān)。而肝臟緊鄰腹部脂肪，所以腹型肥胖對肝臟的影響可能與脂肪細胞旁分泌有關(guān)。臨床中也觀察到，腹型肥胖特別是合并脂肪肝的患者血清HDL-C水平降低及TG升高更突出，因此，肥胖時，脂肪細胞分泌功能紊亂，分泌增多的病理性脂肪因子對肝細胞HDL及TG代謝可產(chǎn)生影響。肝臟是HDL代謝的關(guān)鍵器官，其代謝過程包括兩大方面：首先，肝臟合成ApoAI并在ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）作用下使ApoAI脂化形成HDL，ABCA1介導(dǎo)的ApoAI向HDL轉(zhuǎn)化可發(fā)生在肝臟及肝臟外組織，但研究證實，選擇性敲除肝臟ABCA1可使HDL-C下降80%以上[12]，提示肝臟ABCA1（而不是肝外組織ABCA1）是決定體內(nèi)HDL-C水平的關(guān)鍵。另外，肝臟還通過高密度脂蛋白受體（B類I型清道夫受體)SR-BI攝取循環(huán)HDL中的膽固醇，促進HDL中的膽固醇向膽汁及腸道排泄。以上兩方面作用均有利于外周組織的膽固醇向體外排泄，即所謂的“膽固醇逆轉(zhuǎn)運”，這也是HDL抗動脈粥樣硬化的首要機制。最近，我們通過比較正常及飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注射荷載3H-標(biāo)記膽固醇的巨噬細胞后，與對照小鼠比較，肥胖小鼠血清及糞便3H-膽固醇放射活性在不同時間點均有降低，表示肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運下降。同時，48小時糞便3H-膽固醇放射活性在兩組的差異大于48小時血清3H-膽固醇放射活性在兩組的差異，說明肥胖小鼠從血清到糞便的膽固醇轉(zhuǎn)運受損更加嚴重，提示肥胖對肝臟參與的膽固醇逆轉(zhuǎn)運影響更突出。而肥胖狀態(tài)下，脂肪細胞是通過何種脂肪因子，如何影響肝臟HDL代謝尚不清楚。Wueest等人的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性敲除脂肪組織中的凋亡信號通路Ras基因，能減少高脂飲食誘導(dǎo)的細胞因子（如IL-6）升高，更重要的是顯著減輕脂肪肝和明顯增加肝臟對胰島素的敏感性[13]，提示高脂飲食導(dǎo)致的脂肪細胞凋亡通路激活是體內(nèi)炎癥反應(yīng)和肝臟胰島素抵抗的關(guān)鍵因素之一。無獨有偶，另外一項近期發(fā)表在Science的研究也證實，選擇性敲除脂肪組織中的應(yīng)激信號通路JNK1基因，能阻斷高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)（IL-6升高）和肝臟的胰島素抵抗[14]，提示肝臟是脂肪組織作用的主要靶點，支持脂肪細胞與肝細胞之間存在交互作用，而IL-6是重要的介導(dǎo)之一。綜上所述，我們推測：肥胖狀態(tài)下，脂肪細胞可通過旁分泌脂肪因子影響肝臟HDL代謝相關(guān)蛋白的表達和對HDL膽固醇的攝取，從而影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運。除HDL代謝外，肝臟也是TG代謝的主要場所之一。肥胖狀態(tài)下，過多的TG沉積在肝臟，致脂肪肝形成，但其分子機制尚不完全清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DNA斷裂因子相似蛋白(CIDE)家族是機體能量平衡及脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，與代謝綜合征、肥胖及脂肪肝等脂類代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)[15]。CIDE家族包括三個成員：CIDE-A、CIDE-B和CIDE-C。研究顯示，敲除了CIDE-A、CIDE-B、FSP27的動物都表現(xiàn)出了能量釋放增多，且能夠抵抗飲食導(dǎo)致的肥胖、IR及肝脂肪變性[16]。CIDE家族定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂滴和線粒體，參與甘油三酯的儲存、水解以及分泌等代謝過程。在生理情況下，肝臟主要表達CIDE-B，然而發(fā)生肝脂肪變性時，CIDE-A和CIDE-C的表達則上調(diào)。在肝細胞中，CIDE-B基因敲除后，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1c)的表達明顯下降，同時影響該蛋白下游的多種酶類的活性，從而增強線粒體β氧化，降低了脂肪的合成[16]。此外，CIDE-B敲除鼠分泌VLDL-TG水平減少[17]。同樣，CIDE-A或CIDE-C基因敲除可增強肝細胞的β氧化，增加胰島素的敏感性[16,18]。目前關(guān)于CIDE蛋白的上游調(diào)節(jié)因子的研究很有限。有研究表明，PPAR-γ可上調(diào)CIDE-A和CIDE-C的表達[19,20]，而正常的肝細胞僅表達低水平的PPAR-γ，當(dāng)其發(fā)生脂肪化時，PPAR-γ水平則顯著上調(diào)。因此，除影響HDL代謝外，脂肪因子作用于肝細胞后，使肝細胞的PPAR-γ表達上調(diào)，從而升高CIDE的表達，進而通過影響其下游的信號通路促進肝細胞脂質(zhì)合成、降低β氧化和胰島素敏感性，最終導(dǎo)致脂肪肝。參考文獻[1]GuilhermeA,VirbasiusJV,PuriV,CzechMP.Adipocytedysfunctionslinkingobesitytoinsulinresistanceandtype2diabetes.NatRevMolCellBiol，2008，9：367-77[2]HanauerSB.Obesityandvisceralfat:agrowinginflammatorydisease.NatClinPractGastroenterolHepatol，2005，2：245[3]YuBL,ZhaoSP,HuJR.Cholesterolimbalanceinadipocytes:apossiblemechanismofadipocytesdysfunctioninobesity.ObesRev，2010，11：560-7[4]LeLayS,KriefS,FarnierC,etal.Cholesterol,acellsize-dependentsignalthatregulatesglucosemetabolismandgeneexpressioninadipocytes.JBiolChem.2001;276(20):16904-10.[5]HorvathEM,TackettL,McCarthyAM,etal.Antidiabetogeniceffectsofchromiummitigatehyperinsulinemia-inducedcellularinsulinresistanceviacorrectionofplasmamembranecholesterolimbalance.MolEndocrinol.2008;22(4):937-50[6]HuP,HanZ,CouvillonAD,KaufmanRJ,ExtonJH.AutocrinetumornecrosisfactoralphalinksendoplasmicreticulumstresstothemembranedeathreceptorpathwaythroughIRE1alpha-mediatedNF-kappaBactivationanddown-regulationofTRAF2expression.\o"Molecularandcellularbiology."MolCellBiol.2006;26(8):3071-84.[7]Devries-SeimonT,LiY,YaoPM,StoneE,WangY,DavisRJ,FlavellR,TabasI.Cholesterol-inducedmacrophageapoptosisrequiresERstresspathwaysandengagementofthetypeAscavengerreceptor.\o"TheJournalofcellbiology."JCellBiol.2005;171(1):61-73.[8]OzcanU,CaoQ,YilmazE,LeeAH,IwakoshiNN,OzdelenE,TuncmanG,G?rgünC,GlimcherLH,HotamisligilGS.Endoplasmicreticulumstresslinksobesity,insulinaction,andtype2diabetes.\o"Science(NewYork,N.Y.)."Science.2004;306(5695):457-61.[9]GregorMF,HotamisligilGS.AdipocyteBiology.Adipocytestress:theendoplasmicreticulumandmetabolicdisease.\o"Journaloflipidresearch."JLipidRes.2007;48(9):1905-14.[10]LappasM,YeeK,PermezelM,RiceGE.SulfasalazineandBAY11-7082interferewiththenuclearfactor-kappaBandIkappaBkinasepathwaytoregulatethereleaseofproinflammatorycytokinesfromhumanadiposetissueandskeletalmuscleinvitro.\o"Endocrinology."Endocrinology.2005;146(3):1491-7.[11]GreifM,BeckerA,vonZieglerF,etal.PericardialadiposetissuedeterminedbydualsourceCTisariskfactorforcoronaryatherosclerosis.ArteriosclerThrombVascBiol.2009;29:781-786.[12]TimminsJM,LeeJY,BoudyguinaE,etal.TargetedinactivationofhepaticAbca1causesprofoundhypoalphalipoproteinemiaandkidneyhypercatabolismofapoA-I.JClinInvest.2005;115:1333–1342.[13]WueestS,RapoldRA,SchumannDM,etal.DeletionofFasinadipocytesrelievesadiposetissueinflammationandhepaticmanifestationsofobesityinmice.JClinInvest.2010;120:191-202.[14]SabioG,DasM,MoraA,etal.Astresssignalingpathwayinadiposetissueregulateshepaticinsulinresistance.Science.2008;322:1539-1543.[15]GongJ,SunZ,LiP.CIDEproteinsandmetabolicdisorders.CurrOpinLipidol.2009;20(2):121-6.[16]LiJZ,LiP.Cideproteinsandthedevelopmentofobesity.NovartisFoundSymp2007;286:155–159.[17]LiJZ,YeJ,XueBetal.cideb,aner-andlipiddropletassociatedprotein,mediatesVLDLlipidationandmaturationbyinteractingwithapolipoproteinB.CellMetab,2009;9(2):177-90.[18]NishinoN,TamoriY,TateyaS,etal.FSP27contributestoefficientenergystorageinmurinewhiteadipocytesbypromotingtheformationofunilocularlipiddroplets.JClinInvest2008;118:2808–2821.[19]KimYJ,ChoSY,YunCH,etal.TranscriptionalactivationofCidecbyPPARgamma2inadipocyte.BiochemBiophysResCommun2008;377:297–302.[20]ViswakarmaN,YuS,NaikS,etal.TranscriptionalregulationofCidea,mitochondrialcelldeath-inducingDNAfragmentationfactoralpha-likeeffectorA,inmouseliverbyperoxisomeproliferator-activatedreceptoralphaandgamma.JBiolChem2007;282:18613–18624.三、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和主要研究內(nèi)容（詳細闡述圍繞國家重大需求所要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題的內(nèi)涵。主要研究內(nèi)容要圍繞關(guān)鍵科學(xué)問題，系統(tǒng)、有機地形成一個整體來詳細闡述，重點要突出，避免分散或拼盤現(xiàn)象）脂肪細胞內(nèi)膽固醇失衡機制探討：培養(yǎng)成熟脂肪細胞和肥大脂肪細胞（3T3-L1細胞促分化至21天），檢測其對膽固醇的攝取和流出能力；與攝取和流出有關(guān)的蛋白表達。構(gòu)建腺病毒載體，分別沉默SREBP2和LXR，探討SREBP2在脂肪細胞膽固醇代謝失衡中的體制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)膽固醇負荷所致脂肪細胞分泌功能異常：培養(yǎng)成熟脂肪細胞，觀察膽固醇過負荷對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪因子表達分泌的影響，探討其機制；建立肥胖小鼠模型，在體觀察脂肪細胞膽固醇負荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂肪因子分泌變化之間的聯(lián)系。脂肪因子影響肝臟HDL代謝：用脂肪細胞與肝細胞共培養(yǎng)模型和基質(zhì)膠皮下種植/回收技術(shù)，分別觀察不同狀態(tài)的脂肪細胞及脂肪組織對肝細胞HDL代謝的影響及分子機制，并探討脂肪細胞因子及其調(diào)節(jié)通路在介導(dǎo)脂肪細胞和肝細胞相互作用中的價值。最后通過不同模型肥胖小鼠觀察肥胖對肝臟HDL代謝的影響并探索體內(nèi)注射脂肪細胞炎癥因子拮抗劑干預(yù)的作用。炎性脂肪因子影響肝臟TG代謝：觀察肝細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)對肝細胞脂質(zhì)蓄積的影響，探討脂肪細胞對肝細胞CIDE表達的影響及相關(guān)通路和分子機制。四、總體目標(biāo)、五年預(yù)期目標(biāo)（總體目標(biāo)和五年預(yù)期目標(biāo)應(yīng)從對解決國家重大需求的預(yù)期貢獻，在理論、方法、技術(shù)等方面預(yù)期取得的進展、突破及其科學(xué)價值，優(yōu)秀人才培養(yǎng)等方面分別論述。五年預(yù)期目標(biāo)要求有較為具體的量化考核指標(biāo)。）本課題為臨床基礎(chǔ)研究，其成果將進一步闡明肥胖狀態(tài)下脂肪細胞代謝失衡及分泌功能異常的機制，揭示肥胖時肝細胞HDL和TG代謝異常的分子機制，明確CIDE家族在調(diào)控肝細胞脂質(zhì)代謝中的作用，并證實其相關(guān)作用通路。為探討代謝綜合征及脂肪肝等疾病的發(fā)病機制及防治策略提供新的思路。同時，本項目的開展有利于學(xué)科的建設(shè)和人才的培養(yǎng)，預(yù)計可完成有價值的論文8篇，培養(yǎng)博士研究生5名，碩士研究生7名。五、總體研究方案（結(jié)合主要研究內(nèi)容闡述學(xué)術(shù)思路、技術(shù)途徑、與國內(nèi)外同類研究相比的創(chuàng)新點與特色、取得重大突破的可行性分析等。）本課題擬探討肥胖狀態(tài)下脂肪細胞分泌功能紊亂的機制，并以脂肪細胞和肝細胞相互作用為切入點，通過體外共培養(yǎng)及體內(nèi)基質(zhì)膠種植技術(shù)，研究肥胖時肝細胞HDL和TG代謝異常的分子機制。主要技術(shù)路線如下：第一部分肥大脂肪細胞膽固醇代謝失衡機制探討(1)肥大脂肪細胞膽固醇代謝率的改變①成熟脂肪細胞誘導(dǎo)分化：選擇小鼠3T3Ll前體脂肪細胞，采用經(jīng)典的激素雞尾酒方法誘導(dǎo)分化至成熟脂肪細胞。具體方法為：將3T3Ll置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細胞生長至完全融合后48h開始誘導(dǎo)分化。將原培養(yǎng)液換成含115ng/ml3-異丁基1-甲基黃磦呤（IBMX）、1μmol地塞米松和10μg/ml胰島素的完全培養(yǎng)液。細胞孵育48h后，撤去IBMX和地塞米松，使培養(yǎng)液中只含有胰島素10μg/ml。再孵育48h后，撤去胰島素，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，每48h換液一次，直到95%的細胞都為成熟的脂肪細胞。誘導(dǎo)分化時間約1周。②肥大脂肪細胞誘導(dǎo)分化：脂肪細胞促分化至第21天，即為肥大脂肪細胞。（方法參考：ArteriosclerThrombVascBiol.2005;25:2062-8.）③兩種脂肪細胞的膽固醇代謝率比較（膽固醇代謝實驗）：按（1）、（2）所述方法，將3T3Ll前體脂肪細胞分別誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞和肥大脂肪細胞。用含ac-LDL50mg/L的10%LPDS-DMEM誘導(dǎo)48h后，加入0.5μCi/ml[3H]標(biāo)記的膽固醇（[3H]-膽固醇）7.4×107Bq/L繼續(xù)孵育24h，收集培養(yǎng)液并離心，γ射線計數(shù)儀測定放射活性，即為培養(yǎng)液的[3H]-膽固醇放射活性，計算細胞膽固醇流出率，為培養(yǎng)液的[3H]-膽固醇放射活性占總放射活性的百分比。PBS漂洗細胞，0.1mol/LNaOH1ml反復(fù)凍融3次裂解細胞，收集溶解后的細胞用γ射線計數(shù)儀測定放射活性，即為細胞所攝取的膽固醇的量，該值所占總放射活性的百分比，為細胞膽固醇攝取率。比較兩組細胞的細胞膽固醇流出率和攝取率，可知兩種脂肪細胞的膽固醇代謝率差異。比較兩組細胞的膽固醇代謝相關(guān)因子表達差異：按照步驟3)裂解細胞，抽提細胞RNA及其蛋白，分別通過RT-PCR和WesternBlotting，測定細胞中膽固醇攝取相關(guān)因子（如LDLR1、LDL受體相關(guān)蛋白、小窩蛋白caveolin、PPARα、PPARγ）和膽固醇流出相關(guān)因子（如ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα）的基因和蛋白表達水平，以明確兩種脂肪細胞的膽固醇代謝差異的機制（圖1）。3T3Ll前體脂肪細胞3T3Ll前體脂肪細胞三周一周誘導(dǎo)分化三周一周誘導(dǎo)分化比較兩組細胞的膽固醇代謝相關(guān)信號表達差異比較兩組細胞的膽固醇代謝率差異比較兩組細胞的膽固醇代謝相關(guān)信號表達差異比較兩組細胞的膽固醇代謝率差異肥大脂肪細胞成熟脂肪細胞膽固醇代謝實驗圖1（2）肥大脂肪細胞膽固醇失衡的分子機制探討1）利用siRNA技術(shù)，分別構(gòu)建LXR和SREBP2的siRNA腺病毒載體，分別轉(zhuǎn)染人成熟脂肪細胞和肥大脂肪細胞中；不同時間點檢測LXR和SREBP2的表達，明確基因沉默效果；2）合適的時間點（根據(jù)上一步確定的時間點）檢測脂肪細胞內(nèi)膽固醇的代謝率以及膽固醇代謝相關(guān)因子表達，以明確LXR和SREBP2在脂肪細胞膽固醇代謝失衡中的作用。第二部分膽固醇負荷對脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)分泌功能的影響及機制探討膽固醇過負荷對脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及分泌功能的影響及其機制1）在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠3T3-L1前脂肪細胞；2）培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細胞，促分化為成熟的脂肪細胞；3）用Ac-LDL及ACAT抑制劑處理脂肪細胞，使之為膽固醇過負荷的脂肪細胞；4）在Ac-LDL及ACAT抑制劑的基礎(chǔ)上應(yīng)用U18666A，抑制膽固醇向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運；5）干預(yù)結(jié)束后用測定脂肪細胞膽固醇含量，分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇含量；WesternBlot法檢測脂肪細胞GRP78/Bip、XBP-1及磷酸化PERK與eIF2α的蛋白水平，評價是否誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；用定量RT-PCR法檢測各種脂肪因子的mRNA表達，用ELISA法測定上清液脂肪因子的分泌；檢測脂肪細胞IKK/NF-κB通路活性，包括用WesternBlot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NF-κB表達水平，并用EMSA法測定NF-κB活性（圖2）。6）構(gòu)建腺病毒載體，轉(zhuǎn)染入脂肪細胞，siRNA沉默NF-κBp65后，再次重復(fù)上述實驗。肥胖小鼠脂肪細胞膽固醇負荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂肪因子表達分泌情況及活性蛋白伴侶的作用探討1）建立兩種肥胖小鼠模型：遺傳性ob/ob肥胖小鼠及飲食誘導(dǎo)的C57BL/6營養(yǎng)性肥胖小鼠，并設(shè)正常C57BL/6小鼠為對照；2）將各組小鼠分別予以口服活性化學(xué)蛋白伴侶PBA和TUDCA共3周，并設(shè)立對照；3）測定血糖、血脂及血清脂肪因子濃度；4）麻醉處死動物，留取脂肪組織，分離成熟脂肪細胞并體外孵育培養(yǎng)24小時，檢測各組脂肪細胞體積大??；測定脂肪細胞膽固醇含量，分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇含量；檢測脂肪因子的mRNA表達并測定上清液脂肪因子的分泌水平；用WesternBlot法測定脂肪細胞GRP78/Bip、XBP-1及磷酸化PERK與eIF2α的蛋白水平；測定脂肪細胞IKK/NF-κB通路的活性（圖3）。小鼠3T3-L1前脂肪細胞，誘導(dǎo)分化8天成熟小鼠3T3-L1前脂肪細胞，誘導(dǎo)分化8天成熟Ac-LDL＋ACAT抑制劑Ac-LDL＋ACAT抑制劑Ac-LDL＋ACAT抑制劑＋U18666A對照組干預(yù)結(jié)束，收集細胞及上清液干預(yù)結(jié)束，收集細胞及上清液檢測脂肪因子mRNA表達及上清液脂肪因子濃度WesternBlot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白檢測脂肪因子mRNA表達及上清液脂肪因子濃度WesternBlot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NF-κB表達水平，用EMSA法測定NF-κB活性。測定細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膽固醇含量WesternBlot法檢測脂肪細胞GRP78/Bip、XBP-1及磷酸化PERK與eIF2α的蛋白水平圖2正常C57BL/6小鼠正常C57BL/6小鼠C57BL/6營養(yǎng)性肥胖小鼠ob/ob肥胖小鼠TUDCA干預(yù)PBA干預(yù)對照組TUDCA干預(yù)PBA干預(yù)對照組取脂肪組織，分離成熟脂肪細胞并體外孵育24小時測定血糖、血脂及血清脂肪因子濃度取脂肪組織，分離成熟脂肪細胞并體外孵育24小時測定血糖、血脂及血清脂肪因子濃度WesternBlot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NF-κBWesternBlot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NF-κB表達水平，用EMSA法測定NF-κB活性WesternBlot法檢測脂肪細胞GRP78/Bip、XBP-1及磷酸化PERK與eIF2α的蛋白水平檢測脂肪因子mRNA表達及上清液脂肪因子濃度測定各組脂肪細胞體積大小及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇含量圖3第三部分脂肪細胞因子影響肝臟HDL代謝（1）觀察體外脂肪細胞/肝細胞共培養(yǎng)對肝細胞HDL代謝相關(guān)蛋白的影響1)通過脂肪細胞與肝細胞共培養(yǎng)，比較不同分化程度（未分化、成熟和肥大）和應(yīng)激狀態(tài)（ox-LDL負荷和Fas配體刺激）的脂肪細胞對肝細胞LXR、ApoAI、ABCA1及SR-BI蛋白及mRNA表達的影響。同時觀察不同脂肪細胞對肝細胞攝取HDL中膽固醇的差異。2)比較不同脂肪細胞共培養(yǎng)下培養(yǎng)液介導(dǎo)巨噬細胞膽固醇流出能力的差異。（2）觀察體內(nèi)脂肪組織對基質(zhì)膠皮下種植肝細胞的HDL代謝相關(guān)蛋白的影響采用基質(zhì)膠注射和回收模型，將肝細胞懸浮于基質(zhì)膠中注射到腹部皮下脂肪周圍，比較肥胖與非肥胖小鼠對基質(zhì)膠種植的肝細胞LXRa、ApoAI、ABCA及SR-BI蛋白及mRNA表達的影響。（3）探討脂肪細胞對肝細胞HDL代謝影響的相關(guān)通路和分子機制1)通過siRNA沉默脂肪細胞JNK1及Fas基因后，觀察延長分化（誘導(dǎo)肥大脂肪細胞）、膽固醇負荷及FasL刺激的脂肪細胞共培養(yǎng)對肝細胞LXR、ApoAI、ABCA及SR-BI蛋白及mRNA表達的影響及肝細胞對HDL中膽固醇攝取的影響。2)在脂肪細胞肝細胞共培養(yǎng)時，加入不同脂肪因子中和抗體（如IL-6、TNF-及瘦素抗體），觀察其對肝細胞LXR、ApoAI、ABCA及SR-BI蛋白及mRNA表達的影響及其對肝細胞攝取HDL中膽固醇的影響。(3)在脂肪細胞/肝細胞共培養(yǎng)時，加入NF-b拮抗劑，阻斷肝細胞的NF-b通路，觀察其對肝細胞LXRa、ApoAI、ABCA及SR-BI蛋白及mRNA表達的影響及肝細胞對HDL中膽固醇攝取的影響。（4）體內(nèi)驗證脂肪細胞因子對肝細胞HDL代謝影響1)觀察對照與肥胖小鼠（基因敲除和飲食誘導(dǎo)）肝臟LXRa、ApoAI、ABCA及SR-BI蛋白及mRNA表達差異及血清ApoAI和HDL-C水平差異，同時觀察體內(nèi)注射不同脂肪因子中和抗體（如IL-6、TNF-及瘦素抗體）后肥胖小鼠肝臟LXRa、ApoAI、ABCA及SR-BI蛋白及mRNA表達及血清ApoAI和HDL-C水平變化。2)觀察體內(nèi)注射不同脂肪因子中和抗體（如IL-6、TNF-及瘦素抗體）對肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運各環(huán)節(jié)（從巨噬細胞到血清以及從血清到糞便）的影響。第四部分脂肪細胞因子影響肝臟TG代謝（1）肝細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)對肝細胞脂質(zhì)蓄積的影響1)建立脂肪細胞與肝細胞的共培養(yǎng)模型，檢測肝細胞內(nèi)TG含量2)肝細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)后，檢測肝細胞PPAR-γ以及脂肪細胞相關(guān)特異基因aP2、adiponectin等的表達（肝細胞發(fā)生脂肪化時，上述基因表達增加）。（2）探討脂肪細胞對肝細胞CIDE表達的影響及相關(guān)通路和分子機制1)肝細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)后，檢測肝細胞CIDE的基因及蛋白表達水平的變化。2)檢測共培養(yǎng)后肝細胞SREBP1c蛋白及其磷酸化水平的改變，以及其下游多種酶類的表達變化，包括蛋白乙酰輔酶A羧化酶2(acetyl-CoAcarboxylase2,ACC2)、脂肪酸合成酶(fattyacidsynthetase,FAS)和乙酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-coenzymeAdesaturase1,SCD1)。3)檢測共培養(yǎng)后肝細胞AMPK蛋白及其磷酸化水平的改變，檢測線粒體的氧化功能，包括NRF1、PGC1a、VLCAD、COX1和COXII線粒體相關(guān)基因的表達變化。4)檢測共培養(yǎng)后肝細胞對胰島素的敏感性，包括IRS-1、AKT-2蛋白及其磷酸化水平的變化等。5)siRNA分別沉默CIDE-A、-B、-C后，重復(fù)2-4的檢測，明確其關(guān)鍵作用的CIDE蛋白。六、年度計劃按年度提供研究內(nèi)容及預(yù)期目標(biāo)（5年）年度研究計劃2012.1至2012.12脂肪細胞膽固醇代謝失衡機制探討。前體脂肪細胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，并進行體外干預(yù)。2013.1至2013.12檢測脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并進行相關(guān)動物實驗，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與分泌功能異常的關(guān)系。2014.1至2014.6建立脂肪細胞/肝細胞共培養(yǎng)體系，探討脂肪細胞/肝細胞共培養(yǎng)對肝細胞表達HDL代謝相關(guān)蛋白及HDL-C攝取的影響。2014.7至2014.12建立基質(zhì)膠種植與回收模型，觀察體內(nèi)脂肪組織對種植肝細胞HDL代謝相關(guān)蛋白表達的影響。2015.1至2015.6探討JNK1、Ras信號通路、細胞因子及NF-B在介導(dǎo)脂肪細胞對肝細胞HDL代謝影響中的作用。2015.7至2.15.12體內(nèi)觀察不同肥胖小鼠對肝臟HDL代謝相關(guān)蛋白的影響，同時觀察脂肪因子中和抗體對肥胖相關(guān)HDL代謝異常及膽固醇逆轉(zhuǎn)運影響。2016.1至2016.6建立的脂肪細胞與肝細胞的共培養(yǎng)模型，檢測肝細胞內(nèi)TG含量和PPAR-γ以及脂肪細胞相關(guān)特異基因的表達。2016.7至2016.12探討脂肪細胞對肝細胞CIDE表達的影響及相關(guān)通路和分子機制。整理數(shù)據(jù)，發(fā)表論文。七、創(chuàng)新點與特色（1）探討脂肪細胞膽固醇代謝的機制，以膽固醇代謝失衡為靶點，研究脂肪細胞的功能異常，具有原始創(chuàng)新性，國內(nèi)外尚未見該類報道；（2）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面入手，探討肥大脂肪細胞內(nèi)膽固醇代謝失衡致功能異常的機制，這是脂肪細胞功能異常的全新機制探討，能為脂肪肝等疾病的防治提供新的干預(yù)策略。（3）以脂肪細胞與肝細胞共培養(yǎng)模型為切入點模擬體內(nèi)脂肪細胞旁分泌作用，基質(zhì)膠皮下種植和回收技術(shù)模擬體內(nèi)脂肪組織對種植肝細胞的作用，探討脂肪因子對肝細胞的作用尚屬首創(chuàng)。（4）利用共培養(yǎng)模型，探討CIDE家族對肝細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝及胰島素敏感性的影響并明確CIDE作用通路具有原創(chuàng)性。八、取得重大突破的可行性分析（1）在血脂代謝及脂肪細胞研究領(lǐng)域均具有良好的工作基礎(chǔ)：課題組從1989年開始致力于血脂與動脈粥樣硬化的研究，在脂質(zhì)代謝研究方面積累了豐富的經(jīng)驗。2004年和2007年分獲衛(wèi)生部重點項目資助（批準(zhǔn)號30470705，30770857），對高密度脂蛋白系列（包括apoAI、apoE及其模擬肽）展開了廣泛、深入的研究。多篇有價值的學(xué)術(shù)論文發(fā)表在Atherosclerosis、AmHeartJ、IntJCardiol.等國外SCI期刊上，引起國外同行關(guān)注；近5年來，課題組一直從事脂肪細胞脂質(zhì)代謝及內(nèi)分泌功能研究，熟練掌握脂肪細胞培養(yǎng)、膽固醇流出檢測、基因沉默等技術(shù)，已獲得多個有關(guān)脂肪細胞的國家自然科學(xué)基金課題（“脂肪細胞過氧化物酶增殖體激活受體調(diào)節(jié)脂蛋白代謝”（批準(zhǔn)號39970296）；“高密度脂蛋白和ApoAI模擬肽對脂肪細胞分泌功能調(diào)節(jié)和機制”（批準(zhǔn)號30470705）；“內(nèi)源性大麻系統(tǒng)對脂肪細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)及其機制”（批準(zhǔn)號30600498）），“載脂蛋白AV對細胞膽固醇轉(zhuǎn)運的影響及其機制探討”（批準(zhǔn)號30971266），及其省科技廳課題“女性內(nèi)源性雌激素變化對血管內(nèi)皮功能影響及其機制研究”、“雌激素對內(nèi)皮細胞衰老的作用及機制（項目編號03SSY3080）”，在脂肪細胞脂質(zhì)代謝及其調(diào)控領(lǐng)域的研究處于國內(nèi)外領(lǐng)先地位。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上制定，立題理論科學(xué)，依據(jù)充分，設(shè)計方案合理，理論上有可行性。（2）研究方法先進、可靠，且部分方法已建立：本課題的關(guān)鍵技術(shù)，包括脂肪細胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化、脂肪細胞與肝細胞共培養(yǎng)模型的建立、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激檢測、動物模型建立、膽固醇流出檢測、激光共聚焦檢測，基質(zhì)膠種植和回收技術(shù)等都已建立成熟，為課題的順利進行奠定基礎(chǔ)。（3）擁有成熟的實驗技術(shù)、先進的設(shè)備和優(yōu)秀的研究人員：申請人所在的研究所為衛(wèi)生部重點項目資助的實驗室，配備有齊全且先進的分子生物學(xué)設(shè)備及常規(guī)實驗設(shè)備，并有專門的分子生物學(xué)技術(shù)人員從事基礎(chǔ)實驗工作，具有完善的細胞培養(yǎng)及動物實驗的條件和技術(shù)，能獨立完成Western免疫印跡、同位素檢測、脂蛋白超速離心和激光共聚焦檢測等相關(guān)實驗；研究所具有一支研究經(jīng)驗豐富，創(chuàng)新能力強的研究團隊，且多數(shù)曾有海外研究經(jīng)歷。該課題的申請成員多人曾在國外知名實驗室從事博士后研究，積累了豐富的研究經(jīng)歷。（4）具有良好的支撐平臺：與美國遠泰生物技術(shù)有限公司建立了長期合作伙伴關(guān)系。能共享我校國家遺傳學(xué)重點實驗室、腫瘤研究所等重要資源。九、課題設(shè)置本課題旨在闡明肥胖狀態(tài)下脂肪細胞脂質(zhì)代謝失衡及內(nèi)分泌紊亂的機制，揭示肥胖時脂肪細胞炎性脂肪因子對肝細胞HDL代謝的影響，明確CIDE家族調(diào)控肝細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的分子機制。為研究代謝綜合征及脂肪肝等疾病的發(fā)病機制及防治策略提供依據(jù)。（1）研究脂肪細胞內(nèi)膽固醇失衡的機制：培養(yǎng)成熟脂肪細胞和肥大脂肪細胞（3T3-L1細胞促分化至21天），分別檢測其對膽固醇的攝取和流出能力以及與攝取和流出有關(guān)的蛋白表達；構(gòu)建腺病毒載體，分別沉默SREBP2和LXR，探討SREBP2在脂肪細胞膽固醇代謝失衡中的體制。（2）研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)膽固醇負荷所致脂肪細胞分泌功能異常：培養(yǎng)成熟脂肪細胞，觀察膽固醇過負荷對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪因子表達分泌的影響，探討其機制；建立肥胖小鼠模型，在體觀察脂肪細胞膽固醇負荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂肪因子分泌變化之間的聯(lián)系；（3）研究炎性脂肪因子影響肝臟HDL代謝：用脂肪細胞與肝細胞共培養(yǎng)模型和基質(zhì)膠皮下種植/回收技術(shù)，分別觀察不同狀態(tài)的脂肪細胞及脂肪組織對肝細胞HDL代謝的影響及分子機制，并探討脂肪細胞因子及其調(diào)節(jié)通路在介導(dǎo)脂肪細胞和肝細胞相互作用中的價值。最后通過不同模型肥胖小鼠觀察肥胖對肝臟HDL代謝的影響并探索體內(nèi)注射脂肪細胞因子拮抗劑干預(yù)的作用。（4）研究炎性脂肪因子影響肝臟TG代謝：觀察肝細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)對肝細胞脂質(zhì)蓄積的影響，探討脂肪細胞對肝細胞CIDE表達的影響及相關(guān)通路和分子機制，運用siRNA技術(shù)分別沉默CIDE-A、-B、-C后明確關(guān)鍵作用的CIDE蛋白。十、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)和條件（一）主要承擔(dān)單位的相關(guān)工作基礎(chǔ)和研究成果（含重點實驗室情況）1、工作基礎(chǔ)（1）課題組自2003年起開始關(guān)注脂肪細胞及其膽固醇轉(zhuǎn)運，成功培養(yǎng)原代和3T3-L1脂肪細胞，并建立了成熟的誘導(dǎo)分化技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)脂肪細胞可通過細胞表面的清道夫受體CD36攝取脂蛋白中的膽固醇（Atherosclerosis.2004;177:255–62,），并對脂肪細胞的膽固醇流出途徑、分泌功能等進行了深入探討（IntJCardiol.2008;128:42-7）。（2）本課題組初步觀察發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運受損，為本研究的立題打下了基礎(chǔ)。1）肥胖導(dǎo)致小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運受損：采用高脂肪飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠12周，使其體重超過同齡低脂肪飲食C57BL/6小鼠20%以上，然后進行了體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運檢測。結(jié)果提示：在注射荷載3H-標(biāo)記膽固醇的巨噬細胞后，與對照小鼠比較，肥胖小鼠血清及糞便3H-膽固醇放射活性在不同時間點均有降低，表示肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運下降。同時，48小時糞便3H-膽固醇放射活性在兩組的差異大于48小時血清3H-膽固醇放射活性在兩組的差異（圖-7），說明肥胖小鼠從血清到糞便的膽固醇轉(zhuǎn)運受損更加嚴重，提示肥胖對肝臟參與的膽固醇逆轉(zhuǎn)運影響更突出。2）初步觀察了基質(zhì)膠皮下種植與回收的可行性：基質(zhì)膠為細胞膜基質(zhì)蛋白，其特點是在4°時呈液態(tài)，在>22°時呈膠狀，因此，我們可將肝細胞懸浮于4°的液態(tài)基質(zhì)膠中，然后注射到皮下脂肪組織周圍，進入體內(nèi)后變?yōu)槟z狀，便于回收。3）證實基質(zhì)膠中的細胞可與外周組織進行正常物質(zhì)交換：盡管基質(zhì)膠遇熱變?yōu)槟z狀的特性有利于細胞種植和回收，但必須明確固態(tài)基質(zhì)膠中的細胞與周圍組織的物質(zhì)交換不會受阻。為證實這一關(guān)鍵點，我們通過將荷載3H-膽固醇的巨噬細胞懸浮于液態(tài)的基質(zhì)膠中，然后注入皮下，同時采用培養(yǎng)基懸浮的荷載3H-膽固醇的巨噬細胞作為對照，比較體內(nèi)3H-膽固醇逆轉(zhuǎn)運情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)膠中的巨噬細胞3H-膽固醇能正常進入血液和糞便，但在前24小時基質(zhì)膠中巨噬細胞的3H-膽固醇進入血清的速度稍慢，48小時后基質(zhì)膠注射組與培養(yǎng)基注射組無明顯差異。提示基質(zhì)膠中的細胞能與周圍組織進行正常的物質(zhì)交換。（3）本課題組致力于血脂與動脈粥樣硬化的研究，在脂蛋白研究方面積累了豐富的經(jīng)驗。對載脂蛋白E的調(diào)脂和抗動脈粥樣硬化作用進行了系列研究，曾獲湖南省科技成果獎和中華醫(yī)學(xué)獎。對血管內(nèi)皮細胞功能的研究結(jié)果，曾發(fā)表在著名的心血管雜志Circulation上（Circulation.2004;110(8):915-20.），引起國內(nèi)外同行關(guān)注。2004年在國家自然科學(xué)基金（30470705）的資助下，開展了“高密度脂蛋白和apoAI模擬肽對脂肪細胞分泌功能的調(diào)節(jié)和機制”的研究，發(fā)表相關(guān)研究論文14篇（其中5篇SCI文章），并已按時結(jié)題。2004年和2007年分獲衛(wèi)生部重點項目資助，對高密度脂蛋白系列（包括apoAI、apoE及其模擬肽）展開了廣泛、深入的研究，發(fā)表相關(guān)研究論文18篇（其中8篇SCI文章）。2007年再獲國家自然科學(xué)基金資助（30770857），開展“apoAI/E嵌合肽的優(yōu)選及其抗動脈粥樣硬化機制研究”。（4）課題組成員已熟練掌握放射性核素標(biāo)記和蛋白結(jié)合檢測、膽固醇流出測定以及各種脂蛋白成分的超速分離方法，為本課題的順利完成奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。2、工作條件（1）課題組所在研究所已有本項目所需大部分儀器設(shè)備，包括：二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、γ射線計數(shù)儀、實時定量PCR儀、酶標(biāo)儀、超速離心機、激光共聚焦顯微鏡、BIO-RAD電泳系統(tǒng)、BIO-RAD電轉(zhuǎn)膜裝置、流式細胞儀、分光光度計、高效液相色譜儀等，并具備專門的實驗動物室，擁有專業(yè)的分子生物學(xué)技術(shù)人員，已開展Western免疫印跡、實時定量PCR、脂蛋白超速離心等相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)。（2）內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、脂肪細胞、脂肪干細胞、人外周血單核細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞培養(yǎng)技術(shù)成熟，并成功構(gòu)建脂肪細胞與肝細胞共培養(yǎng)模型。（3）已建立細胞內(nèi)膽固醇的測定和膽固醇流出的檢測方法，并已建立在體膽固醇逆轉(zhuǎn)運動物模型及其檢測方法。（4）已具備完成本項目研究內(nèi)容的其他各項條件。（二）技術(shù)平臺本課題組與美國遠泰生物技術(shù)有限公司建立了長期合作伙伴關(guān)系。能共享我校國家遺傳學(xué)重點實驗室、腫瘤研究所等重要資源。（三）近五年承擔(dān)的與所申報項目直接相關(guān)的國家科技計劃重大、重點項目的完成情況序號獲基金資助項目基金名稱時間完成或進展情況1高密度脂蛋白的基礎(chǔ)與臨床研究衛(wèi)生部重點項目2004優(yōu)2“十一五”攻關(guān)ACS強化降脂干預(yù)研究科技部2007優(yōu)3HDL主要功能蛋白對心血管急性事件預(yù)警及危險分層評估的臨床研究衛(wèi)生部重點項目2007優(yōu)十一、研究隊伍（一）研究隊伍的規(guī)模和結(jié)構(gòu)提供課題負責(zé)人和學(xué)術(shù)骨干的人數(shù)、職稱、頭銜（杰青、長江特聘教授或其他）。（二）課題負責(zé)人介紹趙水平，男，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科主任，教授，博士后，主要從事血脂代謝與動脈粥樣硬化研究。1980－1988：進行了“血脂與冠心病”、“枳實抗休克動物實驗研究”、“高鹽攝入與高血壓”、“動脈粥樣硬化動物模型建立”等研究。1989-1994：重點研究血脂脂蛋白氧化與動脈粥樣硬化，其中有關(guān)載脂蛋白E基因變異、中間密度脂蛋白特性和氧化型低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化的實驗研究結(jié)果引起國際同行的關(guān)注。1995－1997：建立了心血管病研究室的細胞室和分子生物室。共獲各類科研基金23項，共計科研經(jīng)費數(shù)百萬，（其中國家自然科學(xué)基金4項，國家教育部科研基金2項，衛(wèi)生部科研基金4項，國外INCLEN基金1項）。獲部省級科研成果獎16項。主編專著19部,其中“臨床血脂學(xué)”于1997年出版，獲國家新聞出版基金資助，并獲衛(wèi)生部科技成果二等獎。享受國務(wù)院有突出貢獻專家待遇。長期從事血脂代謝異常與冠心病的研究和臨床工作。已發(fā)表科研論文470余篇，其中86篇發(fā)表在國外知名期刊（均屬SCI收錄）上。近五年發(fā)表的重要論文：HuangXS,ZhaoSP*,HuM,BaiL,ZhangQ,ZhaoW.DecreasedapolipoproteinA5isimplicatedininsulinresistance-relatedhypertriglyceridemiainobesity.Atherosclerosis.2010,210(2):563-8.XuDY,ZhaoSP*,HuangQX,DuW,LiuYH,LiuL,XieXM.EffectsofGlimepirideonmetabolicparametersandcardiovascularriskfactorsinpatientswithnewlydiagnosedtype2diabetesmellitus.DiabetesResClinPract.2010,88(1):71-5.WuZH,ZhaoSP*.NiacinpromotescholesteroleffluxthroughstimulationofthePPARgamma-LXRalpha-ABCA1pathwayin3T3-L1adipocytes.Pharmacology.2009,84(5):282-7..HuangXS,ZhaoSP*,BaiL,HuM,ZhaoW,ZhangQ.AtorvastatinandfenofibrateincreaseapolipoproteinAVanddecreasetriglyceridesbyup-regulatingperoxisomeproliferator-activatedreceptor-alpha.BrJPharmacol.2009,158(3):706-12.LiJQ,ZhaoSP*,CaiYC,WuLR,FangY,LiP.Atorvastatinreducestissuefactorexpressioninadiposetissueofatheroscleroticrabbits.IntJCardiol.2007,115(2):229-34.已獲重要的科研基金序號獲基金資助項目基金名稱金額時間任務(wù)1氧化型脂蛋白(a)對血小板的作用國家自然科學(xué)基金10萬1996主持2脂肪細胞過氧化物酶增殖體激活受體調(diào)節(jié)脂蛋白代謝國家自然科學(xué)基金12萬1999主持3家族性混合型高脂血癥國際臨床流行病學(xué)8.2萬1999主持4高血壓病和高脂血癥的藥物基因組學(xué)研究國家自然科學(xué)基金145萬2001第二參與者5高密度脂蛋白代謝研究教育部博士點基金5萬2003主持6高密度脂蛋白和apoAI模擬肽對脂肪細胞分泌功能的調(diào)節(jié)和機制國家自然科學(xué)基金22萬2004主持7高密度脂蛋白的基礎(chǔ)與臨床研究衛(wèi)生部重點項目105萬2004主持8載脂蛋白A5系列研究省自然科學(xué)基金4萬2005主持9ApoAI/E嵌合肽的優(yōu)選及其抗動脈粥樣硬化機制研究國家自然科學(xué)基金30萬2007主持10“十一五”攻關(guān)ACS強化降脂干預(yù)研究科技部111．26萬2007主持11HDL主要功能蛋白對心血管急性事件預(yù)警及危險分層評估的臨床研究衛(wèi)生部重點項目117萬2007主持12載脂蛋白AV對細胞膽固醇轉(zhuǎn)運的影響及其機制探討”國家自然科學(xué)基金30萬2009主持已獲與血脂研究相關(guān)的科研成果獎1.趙水平，彭道泉，王鐘林，朱鐵兵，游學(xué)科，李毅夫，李向平,.“載脂蛋白E與脂質(zhì)代謝及心腦血管病關(guān)系的系列研究”,1999年,湖南省科學(xué)技術(shù)進步獎二等獎（0013228）2.趙水平，許丹焰，李向平，黃全躍，徐騰達.“脂蛋白(a)與心血管疾病”,2002年，湖南省科學(xué)技術(shù)進步獎二等獎（2002-230-078）3.李向平，趙水平，高梅，張湘瑜，周啟昌.“無創(chuàng)性血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的檢測及其臨床意義”,2002年,中華醫(yī)學(xué)科技獎三等獎（200203048P0801）4.趙水平，彭道泉，王鐘林，朱鐵兵，游學(xué)科，向偉，李向平，聶賽.載脂蛋白E對血脂代謝及相關(guān)疾病的影響.2003年,中華醫(yī)學(xué)科技獎三等獎（200303199）5.趙水平，劉玲，李向平，李江，張湘瑜，程艷春，周勝華，周啟昌，李玉玲.“血脂紊亂對血管內(nèi)皮功能的損害及其干預(yù)的系列研究”,2005年,湖南省科學(xué)技術(shù)進步獎二等獎（2005-230-075）主編血脂專著：ZhaoSP.Abnormalitiesofserumlipoproteinsinfamilialdysbetalipoproteinemiaandfactorsaffectingtheparticlesizeoflowdensitylipoprotein.LeidenUniversity,TheNetherlands,1992,ISBN90-9004866-9；趙水平.臨床血脂學(xué)，湖南科技出版社，1997；向偉，趙水平.小兒血脂異常-基礎(chǔ)與臨床，人民衛(wèi)生出版社，2001；趙水平.臨床血脂100問，湖南科技出版社，2002；趙水平.臨床血脂100問(第二版)，湖南科技出版社，2003；趙水平、王鐘林.血脂奧秘100解，人民衛(wèi)生出版社，2003；陸宗良、趙水平、葉平.臨床血脂研究新進展，中華醫(yī)學(xué)電子音像出版社，2005；趙水平.他汀治療學(xué)，中南大學(xué)出版社，2005；趙水平.臨床血脂學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，2006；趙水平.他汀類降脂藥物不良反應(yīng)，中南大學(xué)出版社，2007。基于C8051F單片機直流電動機反饋控制系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機的嵌入式Web服務(wù)器的研究MOTOROLA單片機MC68HC（8）05PV8/A內(nèi)嵌EEPROM的工藝和制程方法及對良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機的通用控制模塊的研究基于單片機實現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調(diào)節(jié)器單片機控制的二級倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強型51系列單片機的TCP/IP協(xié)議棧的實現(xiàn)基于單片機的蓄電池自動監(jiān)測系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機系統(tǒng)的圖像采集與處理技術(shù)的研究基于單片機的作物營養(yǎng)診斷專家系統(tǒng)的研究基于單片機的交流伺服電機運動控制系統(tǒng)研究與開發(fā)基于單片機的泵管內(nèi)壁硬度測試儀的研制基于單片機的自動找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機的嵌入式系統(tǒng)開發(fā)基于單片機的液壓動力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測儀開發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機實現(xiàn)一種基于單片機的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機的噴油泵試驗臺控制器的研制基于單片機的軟起動器的研究和設(shè)計基于單片機控制的高速快走絲電火花線切割機床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機的機電產(chǎn)品控制系統(tǒng)開發(fā)基于PIC單片機的智能手機充電器基于單片機的實時內(nèi)核設(shè)計及其應(yīng)用研究基于單片機的遠程抄表系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機