2025年微生物檢驗實踐考核試題及答案一、操作技能題（共40分）1.革蘭染色法操作（15分）要求：使用金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和大腸埃希菌（ATCC25922）混合菌液完成涂片、染色及鏡檢，記錄操作步驟及注意事項，并描述鏡下結果。2.血瓊脂平板制備（10分）要求：按標準流程配制500ml血瓊脂培養(yǎng)基（基礎成分為牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂15g，需添加5%脫纖維羊血），寫出具體操作步驟（包括成分稱量、溶解、調pH、滅菌、加血、傾注平板）及質量控制要點。3.細菌藥敏試驗（K-B法）操作（15分）要求：使用大腸埃希菌（ATCC25922）標準菌株，對頭孢他啶（CAZ30μg）、環(huán)丙沙星（CIP5μg）、阿米卡星（AMK30μg）三種藥物進行藥敏試驗，寫出菌液濃度調整（麥氏比濁法）、涂布方法、藥敏紙片放置、培養(yǎng)條件（溫度、時間）及結果判讀標準。二、簡答題（共30分）1.簡述腸道致病菌分離培養(yǎng)中SS瓊脂的作用原理及使用注意事項（8分）。2.解釋“衛(wèi)星現象”的形成機制及其在流感嗜血桿菌鑒定中的意義（7分）。3.列舉三種細菌耐藥性檢測的特殊方法（如超廣譜β-內酰胺酶、耐甲氧西林葡萄球菌、萬古霉素中介/耐藥腸球菌），并說明其檢測原理（15分）。三、案例分析題（共30分）患者資料：男性，58歲，因“發(fā)熱伴咳嗽、咳膿痰3天”入院。既往有糖尿病史10年，血糖控制不佳。查體：T38.9℃，雙肺可聞及濕啰音；血常規(guī)：WBC18.2×10?/L，中性粒細胞89%；胸部CT提示右肺下葉大片實變影。臨床懷疑“社區(qū)獲得性肺炎”，留取合格痰標本送微生物實驗室檢測。檢驗過程：-痰涂片鏡檢：革蘭染色見大量中性粒細胞（＞25個/低倍鏡視野），少量鱗狀上皮細胞（＜10個/低倍鏡視野），可見革蘭陽性雙球菌（矛頭狀，成雙排列）。-分離培養(yǎng)：接種血平板和巧克力平板，35℃、5%CO?環(huán)境培養(yǎng)18小時。血平板可見圓形、灰白色、α溶血小菌落；巧克力平板菌落形態(tài)相似。-初步鑒定：Optochin敏感試驗（紙片法）陽性，膽汁溶菌試驗陽性。問題：1.該患者痰標本是否符合合格標本要求？依據是什么？（5分）2.推測可能的病原體及依據（需結合涂片、培養(yǎng)及鑒定試驗結果）（10分）。3.若需進一步進行藥敏試驗，應選擇哪些關鍵藥物？簡述其判讀標準（參考CLSI2024版）（15分）。微生物檢驗實踐考核答案（2025年）一、操作技能題1.革蘭染色法操作答案操作步驟：（1）涂片：取1滴生理鹽水于載玻片，用接種環(huán)取混合菌液涂片，形成直徑約1cm的均勻薄膜；（2）固定：涂片自然干燥后，通過火焰3次（手背距玻片約2cm，感覺微熱即可）；（3）初染：滴加結晶紫染液覆蓋涂片，作用1分鐘后水洗；（4）媒染：滴加盧戈碘液覆蓋涂片，作用1分鐘后水洗；（5）脫色：滴加95%乙醇，輕輕晃動玻片至無紫色脫落（約20-30秒），立即水洗；（6）復染：滴加沙黃染液，作用30秒后水洗，吸水紙吸干。注意事項：-涂片厚度適宜，過厚易脫色不完全；-固定溫度不可過高，避免細菌變形；-脫色時間是關鍵，革蘭陰性菌脫色過度會被誤染為陽性，反之陽性菌可能被誤判為陰性。鏡下結果：-金黃色葡萄球菌為革蘭陽性球菌（紫色，葡萄串狀排列）；-大腸埃希菌為革蘭陰性桿菌（紅色，短桿狀排列）。2.血瓊脂平板制備答案操作步驟：（1）成分稱量：按比例稱取牛肉膏1.5g（3g/1000ml×500ml）、蛋白胨5g、NaCl2.5g、瓊脂7.5g，加入500ml蒸餾水；（2）溶解：加熱攪拌至完全溶解，用1mol/LNaOH調pH至7.2-7.4（用pH試紙或pH計校正）；（3）滅菌：分裝至三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘；（4）加血：待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右（手感不燙），無菌操作加入25ml脫纖維羊血（5%比例），輕輕搖勻；（5）傾注平板：無菌條件下將培養(yǎng)基倒入無菌平皿（約15-20ml/平板），待凝固后倒置備用。質量控制要點：-無菌試驗：隨機抽取2-3塊平板，35℃培養(yǎng)24小時，應無任何菌落生長；-性能測試：接種金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和流感嗜血桿菌（ATCC49247），觀察前者是否溶血（β溶血）、后者是否生長（需X/V因子，血平板含V因子但不含X因子，故流感嗜血桿菌在血平板上生長受限，僅巧克力平板可生長）；-外觀檢查：培養(yǎng)基應透明、無沉淀，凝固后表面光滑無氣泡。3.細菌藥敏試驗（K-B法）操作答案操作步驟：（1）菌液制備：挑取大腸埃希菌（ATCC25922）純菌落，接種于4-5ml生理鹽水中，調整濁度至0.5麥氏單位（相當于1×10?CFU/ml）；（2）涂布：用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁擠壓去除多余液體，均勻涂布MH瓊脂平板（3個方向旋轉涂布，最后沿平板邊緣涂抹一圈）；（3）貼紙片：涂布后15分鐘內，用藥敏紙片分配器貼頭孢他啶（CAZ）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿米卡星（AMK）紙片，紙片間距≥24mm，距平板邊緣≥15mm；（4）培養(yǎng)：平板倒置，35℃培養(yǎng)16-18小時（苛養(yǎng)菌需24小時，大腸埃希菌為非苛養(yǎng)菌）；（5）判讀：用游標卡尺測量抑菌圈直徑，對照CLSI2024版標準：-頭孢他啶（CAZ）：敏感（≥21mm）、中介（18-20mm）、耐藥（≤17mm）；-環(huán)丙沙星（CIP）：敏感（≥21mm）、中介（16-20mm）、耐藥（≤15mm）；-阿米卡星（AMK）：敏感（≥17mm）、耐藥（≤16mm）（無中介標準）。二、簡答題1.SS瓊脂作用原理及注意事項原理：SS瓊脂為強選擇性培養(yǎng)基，含膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠，可抑制革蘭陽性菌及部分大腸埃希菌等非致病菌生長；乳糖為碳源，中性紅為指示劑，致病菌（如志賀菌、沙門菌）不發(fā)酵乳糖，形成無色透明菌落；非致病菌（如大腸埃希菌）發(fā)酵乳糖產酸，菌落呈紅色。注意事項：-培養(yǎng)基pH需嚴格控制在7.0-7.2，偏堿會降低選擇性；-煌綠濃度過高會抑制沙門菌生長，需按配方精確添加；-標本接種后需及時培養(yǎng)（≤2小時），避免志賀菌因延遲培養(yǎng)死亡；-部分沙門菌（如傷寒沙門菌）可能發(fā)酵乳糖（遲緩發(fā)酵），需結合生化試驗確認。2.“衛(wèi)星現象”機制及意義機制：流感嗜血桿菌生長需要X因子（血紅素）和V因子（NAD）。當金黃色葡萄球菌與流感嗜血桿菌共培養(yǎng)時，葡萄球菌能合成并釋放V因子（NAD），促進流感嗜血桿菌在其周圍生長，形成“衛(wèi)星現象”（流感嗜血桿菌菌落圍繞葡萄球菌菌落生長）。意義：衛(wèi)星現象是流感嗜血桿菌的初步鑒定依據之一。若在血平板上觀察到葡萄球菌菌落周圍有小菌落生長，可提示可能為流感嗜血桿菌，需進一步通過X/V因子需求試驗確認（如使用含X、V因子的巧克力平板，或專用鑒定條）。3.三種細菌耐藥性特殊檢測方法及原理（1）超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）檢測：采用雙紙片協同試驗（D試驗）。原理：ESBLs可水解三代頭孢（如頭孢他啶、頭孢噻肟），但可被克拉維酸抑制。將頭孢他啶（CAZ）、頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CLA）紙片相距30mm貼于MH平板，若CAZ/CLA的抑菌圈直徑比CAZ大≥5mm，提示ESBLs陽性。（2）耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA/MRCNS）檢測：采用苯唑西林紙片法或mecA基因檢測。原理：MRSA攜帶mecA基因，編碼青霉素結合蛋白PBP2a，對β-內酰胺類抗生素低親和力。苯唑西林（1μg紙片）在35℃培養(yǎng)24小時，抑菌圈≤10mm（或≥11mm但需結合mecA檢測）提示耐藥；或直接PCR檢測mecA基因。（3）萬古霉素中介/耐藥腸球菌（VISA/VRSA）檢測：采用萬古霉素E-test法或肉湯稀釋法。原理：VISA/VRSA通過細胞壁增厚減少藥物滲透，需精確測定MIC值。CLSI標準：腸球菌萬古霉素MIC≤4μg/ml為敏感，8-16μg/ml為中介（VISA），≥32μg/ml為耐藥（VRSA）；E-test法可直接讀取MIC值，結合瓊脂稀釋法確認。三、案例分析題1.標本合格性判斷符合合格標本要求。依據：痰涂片鏡檢中中性粒細胞＞25個/低倍鏡視野，鱗狀上皮細胞＜10個/低倍鏡視野（符合美國臨床實驗室標準化協會CLSI標準：中性粒細胞≥25個且鱗狀上皮細胞≤10個/低倍鏡視野為合格痰標本），提示標本來自下呼吸道，污染少。2.病原體推測及依據可能病原體：肺炎鏈球菌。依據：（1）臨床表現：老年男性，糖尿病史（免疫低下），發(fā)熱、咳膿痰，胸部CT提示肺實變，符合肺炎鏈球菌肺炎典型癥狀（鐵銹色痰為經典表現，但實際中可能不典型）；（2）涂片結果：革蘭陽性雙球菌（矛頭狀，成雙排列），為肺炎鏈球菌典型形態(tài)；（3）培養(yǎng)特性：血平板α溶血（草綠色溶血），與肺炎鏈球菌一致（金黃色葡萄球菌為β溶血，腸球菌為γ或α溶血，但形態(tài)不符）；（4）鑒定試驗：Optochin敏感試驗陽性（98%肺炎鏈球菌對Optochin敏感，其他α溶血鏈球菌如草綠色鏈球菌耐藥），膽汁溶菌試驗陽性（肺炎鏈球菌可被膽汁溶解，其他鏈球菌不溶解）。3.藥敏試驗藥物選擇及判讀標準（CLSI2024）關鍵藥物：青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、萬古霉素（備選）。判讀標準：（1）青霉素：-非腦膜炎患者：敏感（MIC≤2μg/ml）、中介（MIC4μg/ml）、耐藥（MIC≥8μg/ml）；-腦膜炎患者：敏感（MIC≤0.06μg/ml）、中介（MIC0.12-1μg/ml）、耐藥（MIC≥2μg/ml）（因血腦屏障穿透性要求更高）。（2）頭孢曲松：-非腦膜炎：敏感（MIC≤1μg/ml）、中介（MIC2μg/ml）、耐藥（MIC≥4μg/ml）；-腦膜炎：敏感（MIC≤0