急性白血病中Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平的關(guān)聯(lián)性及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義急性白血?。╝cuteleukemia）是一類極為嚴(yán)重的造血干細(xì)胞惡性腫瘤疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。近年來，雖然醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步，但急性白血病的發(fā)病率仍居高不下，且死亡率也處于較高水平。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增急性白血病患者數(shù)量眾多，給患者家庭和社會都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。急性白血病的危害主要體現(xiàn)在多個(gè)方面。由于白血病細(xì)胞的異常增殖，會抑制正常造血功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的貧血癥狀，表現(xiàn)為面色蒼白、頭暈、乏力等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。這些白血病細(xì)胞還會影響免疫系統(tǒng)，使得患者免疫力大幅下降，極易受到各種病原體的侵襲，引發(fā)感染，如呼吸道感染、肺炎等，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致感染性休克，危及生命。急性白血病患者還常伴有出血傾向，輕者出現(xiàn)皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑、鼻出血、牙齦出血等，重者可發(fā)生消化道出血、顱內(nèi)出血等，而顱內(nèi)出血往往是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。Axl作為一種非常規(guī)家族受體酪氨酸激酶（RTK），在癌細(xì)胞的生長、進(jìn)化和惡性轉(zhuǎn)化過程中扮演著關(guān)鍵角色。研究表明，Axl在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)過度表達(dá)的狀態(tài)，其中就包括急性髓系白血?。ˋML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。在急性白血病中，Axl的異常表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，過度表達(dá)Axl的白血病細(xì)胞患者往往對治療缺乏反應(yīng)性，生存期也明顯縮短。同時(shí)，Axl還參與了癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，進(jìn)一步加劇了病情的惡化。AKT，即蛋白激酶B（proteinkinaseB），是細(xì)胞生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵組分。AKT通過磷酸化其靶標(biāo)蛋白，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的生存和增殖，在癌細(xì)胞的生長、存活和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在急性髓系白血病中，AKT的活化是白血病細(xì)胞獨(dú)立生長的重要驅(qū)動(dòng)力，且AKT1蛋白的高水平表達(dá)與患者的不良預(yù)后和較短的總生存期相關(guān)。目前，針對急性白血病的治療主要以化療為主，但化療過程中常出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗，患者的生存率難以得到有效提高。因此，深入研究Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平在急性白血病中的關(guān)聯(lián)，對于揭示急性白血病的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及提高治療效果具有重要的意義。一方面，有助于我們更加深入地理解急性白血病的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)；另一方面，有望為臨床診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，從而提高急性白血病的早期診斷率和治療成功率，改善患者的預(yù)后。1.2研究目的本研究旨在深入探究急性白血病中Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平之間的關(guān)系，具體包括以下幾個(gè)方面：一是通過檢測急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Axl和p-AKT（磷酸化AKT）的表達(dá)水平，明確兩者在急性白血病中的表達(dá)特征，如在不同亞型急性白血?。毙运柘蛋籽?、急性淋巴細(xì)胞白血?。┲械谋磉_(dá)差異，以及在初治、復(fù)發(fā)/難治患者中的表達(dá)變化規(guī)律。二是分析Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平之間的相關(guān)性，探討Axl是否通過調(diào)控AKT磷酸化參與急性白血病的發(fā)病機(jī)制，以及這種調(diào)控在白血病細(xì)胞增殖、存活、耐藥等過程中的作用機(jī)制。三是研究Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平與急性白血病患者臨床特征（如年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例等）、治療反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系，評估其作為急性白血病診斷、治療靶點(diǎn)和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值，例如分析高表達(dá)Axl和高AKT磷酸化水平的患者是否對化療藥物更易產(chǎn)生耐藥性，生存期是否更短等。通過本研究，期望為急性白血病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略，從而提高急性白血病的治療效果和患者的生存率。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，Axl在急性白血病中的研究已取得了一定進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，Axl在急性髓系白血?。ˋML）和急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）細(xì)胞中均有高表達(dá)，且人和小鼠急性髓系白血病細(xì)胞中Axl呈現(xiàn)高度表達(dá)，而正常造血干細(xì)胞則不表達(dá)Axl。有研究表明，過度表達(dá)Axl的白血病細(xì)胞患者往往缺乏治療反應(yīng)性，生存期較短，這使得Axl成為潛在的白血病治療靶標(biāo)。在對Axl表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)存在基因突變、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)以及表觀遺傳調(diào)控等多種方式。在轉(zhuǎn)錄水平上，AP-2α、Sp1/Sp3、MZF-1等可直接調(diào)節(jié)Axl轉(zhuǎn)錄，MZF-1與Axl表達(dá)水平、結(jié)直腸癌和宮頸癌轉(zhuǎn)移直接相關(guān)；CXCR4可增加甲狀腺癌細(xì)胞株Axl轉(zhuǎn)錄水平。在表觀遺傳調(diào)控方面，AML細(xì)胞株啟動(dòng)子發(fā)生甲基化前，經(jīng)阿霉素、順鉑或VP16治療后Axl表達(dá)增加，且啟動(dòng)子低甲基化與Axl在卡波西肉瘤的超表達(dá)水平相關(guān)，去乙?；M蛋白抑制劑SAHA也會對Axl表達(dá)產(chǎn)生影響。關(guān)于AKT在急性白血病中的研究，國外研究表明，AKT在癌細(xì)胞的生存、增殖和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。在AML中，AKT的活化是白血病細(xì)胞獨(dú)立生長的重要驅(qū)動(dòng)力，AKT1蛋白的高水平表達(dá)與患者的不良預(yù)后和較短的總生存期相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)AKT可通過磷酸化其靶標(biāo)蛋白，激活一系列下游信號通路，如PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT、NF-κB和RAS/RAF/MEK/ERK等信號通路，在腫瘤細(xì)胞存活、抗凋亡信號、有絲分裂、遷移、侵襲、耐藥性、血管生成和腫瘤-宿主關(guān)系中起主要作用。在Axl與AKT相互作用的研究上，國外有研究表明二者之間存在相互作用。Axl可促進(jìn)AKT的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生存、增殖和轉(zhuǎn)移；與此同時(shí)，AKT的活化通過促進(jìn)Axl的表達(dá)和激活而增強(qiáng)對Axl的相互作用。抑制Axl或AKT的功能被認(rèn)為可能使白血病治療有效，這為白血病的治療提供了新的思路和方向。在國內(nèi)，相關(guān)研究也在不斷深入。有研究采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中AxlmRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)初治組及復(fù)發(fā)/難治組AxlmRNA表達(dá)水平均高于正常對照組，提示Axl參與了急性髓系白血病的病情發(fā)生和進(jìn)展，且復(fù)發(fā)/難治組AxlmRNA表達(dá)水平明顯高于初治組。在對AKT的研究中，同樣通過檢測發(fā)現(xiàn)初治組及復(fù)發(fā)/難治組磷酸化AKT（p-AKT）mRNA表達(dá)水平均高于正常對照組，提示p-AKT與急性髓系白血病疾病的病情發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。在二者相關(guān)性研究方面，國內(nèi)研究表明在急性髓系白血病患者中，Axl和p-AKTmRNA的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，提示在急性髓系白血病發(fā)病、病情進(jìn)展、多藥耐藥方面，兩者的作用機(jī)制、臨床意義可能存在一定的相關(guān)性。盡管國內(nèi)外在Axl和AKT與急性白血病的研究上取得了不少成果，但仍存在一些不足。對于Axl和AKT在急性白血病中表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，尤其是在不同亞型急性白血病以及不同個(gè)體中的差異調(diào)控機(jī)制研究較少。目前對于Axl和AKT相互作用的具體分子機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還需要進(jìn)一步深入研究，以更全面地揭示它們在急性白血病發(fā)病機(jī)制中的作用。在臨床應(yīng)用方面，雖然Axl和AKT被認(rèn)為是潛在的治療靶點(diǎn)，但如何將相關(guān)研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段，開發(fā)出安全、有效的靶向治療藥物，仍面臨諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步的研究和探索。二、急性白血病概述2.1急性白血病的分類與發(fā)病機(jī)制急性白血病主要分為急性髓系白血?。ˋML）和急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）兩大類型。急性髓系白血病是一種髓系造血干/祖細(xì)胞惡性疾病，其骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞（白血病細(xì)胞）大量增殖，蓄積于骨髓并抑制正常造血，還可廣泛浸潤肝、脾、淋巴結(jié)等髓外臟器。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)特征，AML又可進(jìn)一步細(xì)分為多種亞型，如M0（急性髓細(xì)胞白血病微分化型）、M1（急性粒細(xì)胞白血病未分化型）、M2（急性粒細(xì)胞白血病部分分化型）、M3（急性早幼粒細(xì)胞白血病）、M4（急性粒-單核細(xì)胞白血?。?、M5（急性單核細(xì)胞白血?。6（紅白血?。?、M7（急性巨核細(xì)胞白血?。┑取２煌瑏喰偷腁ML在細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)特征等方面存在差異，這些差異不僅有助于疾病的診斷和分型，還與治療方案的選擇及預(yù)后密切相關(guān)。例如，急性早幼粒細(xì)胞白血?。∕3型）具有獨(dú)特的t(15;17)(q22;q12)染色體易位，形成PML-RARα融合基因，對全反式維甲酸和砷劑治療高度敏感，是目前預(yù)后相對較好的AML亞型之一。急性淋巴細(xì)胞白血病則是源于淋巴細(xì)胞的B系或T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病。異常增生的原始細(xì)胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同時(shí)也可侵及骨髓外的組織，如腦膜、淋巴結(jié)、性腺、肝等。ALL同樣可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型等進(jìn)行細(xì)分，如根據(jù)細(xì)胞形態(tài)分為L1、L2、L3三型，根據(jù)免疫表型可分為B-ALL和T-ALL等。B-ALL約占ALL的80%-85%，其白血病細(xì)胞通常表達(dá)CD19、CD22、CD79a等B細(xì)胞相關(guān)抗原；T-ALL約占ALL的15%-20%，白血病細(xì)胞表達(dá)CD2、CD3、CD4、CD5、CD7等T細(xì)胞相關(guān)抗原。不同亞型的ALL在發(fā)病機(jī)制、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面也存在差異。急性白血病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為其起源于造血干細(xì)胞的惡變，涉及多種遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變。在遺傳學(xué)方面，染色體異常在急性白血病的發(fā)病中起著重要作用。例如，AML中常見的染色體易位有t(8;21)(q22;q22)、t(15;17)(q22;q12)、inv(16)(p13.1q22)等，這些染色體易位可導(dǎo)致融合基因的形成，如AML1-ETO、PML-RARα、CBFβ-MYH11等，這些融合基因通過干擾正常的造血調(diào)控信號通路，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖、分化阻滯和存活。在ALL中，也存在多種染色體異常，如t(9;22)(q34;q11.2)形成的BCR-ABL融合基因，是導(dǎo)致慢性髓細(xì)胞白血病急淋變和部分成人ALL的重要分子遺傳學(xué)改變，該融合基因具有酪氨酸激酶活性，可激活下游的PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERK等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。除了染色體異常，基因突變也是急性白血病發(fā)病的重要因素。常見的基因突變包括FLT3、NPM1、CEBPA、IDH1/2等。FLT3基因突變在AML中較為常見，約30%的AML患者存在FLT3基因突變，主要為內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變（ITD）和酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變（TKD），這些突變可導(dǎo)致FLT3受體持續(xù)激活，進(jìn)而激活下游的RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT等信號通路，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖和存活。NPM1基因突變在AML中也具有重要意義，約30%-35%的AML患者存在NPM1基因突變，突變型NPM1蛋白從細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)，失去其正常的核定位功能，從而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。CEBPA基因突變是AML中常見的轉(zhuǎn)錄因子基因突變，雙等位基因突變的AML患者通常預(yù)后較好，而單等位基因突變的患者預(yù)后則相對較差。IDH1/2基因突變可導(dǎo)致異檸檬酸脫氫酶活性改變，使α-酮戊二酸（α-KG）代謝異常，產(chǎn)生致癌代謝物2-羥基戊二酸（2-HG），2-HG可抑制多種依賴α-KG的雙加氧酶，包括TET家族的DNA去甲基化酶和組蛋白去甲基化酶，從而導(dǎo)致DNA和組蛋白高甲基化，影響基因表達(dá)，促進(jìn)白血病的發(fā)生發(fā)展。表觀遺傳學(xué)改變在急性白血病的發(fā)病機(jī)制中也扮演著重要角色。DNA甲基化異常是常見的表觀遺傳學(xué)改變之一，在急性白血病中，許多抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，從而失去對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控作用。例如，RASSF1A、p15INK4B等抑癌基因在急性白血病中常發(fā)生高甲基化，使其表達(dá)水平降低，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖。組蛋白修飾異常也是急性白血病發(fā)病的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制，包括組蛋白甲基化、乙?；?、磷酸化等修飾的改變。這些修飾改變可影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。例如，組蛋白去乙?；福℉DACs）的異常表達(dá)或活性改變可導(dǎo)致組蛋白乙?；浇档?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，抑制基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)白血病的發(fā)生發(fā)展。非編碼RNA（ncRNA）如微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）等在急性白血病中的異常表達(dá)也參與了發(fā)病機(jī)制。miRNA可通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。在急性白血病中，一些miRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變，如miR-15a/miR-16-1簇在慢性淋巴細(xì)胞白血病中常缺失或低表達(dá)，導(dǎo)致其靶基因BCL2表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)白血病細(xì)胞的存活。lncRNA則可通過多種機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)，如與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，參與染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工等過程。例如，在AML中，lncRNA-UCA1的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，其可通過與miR-143相互作用，上調(diào)靶基因MMP2的表達(dá)，促進(jìn)白血病細(xì)胞的遷移和侵襲。2.2急性白血病的臨床癥狀與診斷方法急性白血病的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，主要包括以下幾個(gè)方面：發(fā)熱：發(fā)熱是急性白血病患者常見的癥狀之一，可表現(xiàn)為低熱，體溫一般在37.3℃-38℃之間，類似于感冒的發(fā)熱癥狀；也可出現(xiàn)高熱，體溫可達(dá)39℃以上，同時(shí)患者常伴有畏寒、寒戰(zhàn)等表現(xiàn)。發(fā)熱的原因主要是由于白血病細(xì)胞釋放致熱物質(zhì)，以及患者免疫力下降，容易繼發(fā)各種感染，如呼吸道感染、肺炎、肛周感染等，感染進(jìn)一步加重了發(fā)熱癥狀。在一項(xiàng)對100例急性白血病患者的臨床研究中，發(fā)現(xiàn)有80例患者出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，其中繼發(fā)感染導(dǎo)致高熱的患者占發(fā)熱患者總數(shù)的60%。貧血：幾乎所有急性白血病患者都會出現(xiàn)貧血癥狀，且病情越嚴(yán)重，貧血程度往往越明顯。患者主要表現(xiàn)為面色蒼白、頭暈、乏力、耳鳴、眼花、心慌、胸悶等。這是因?yàn)榘籽〖?xì)胞在骨髓內(nèi)大量增殖，抑制了正常造血干細(xì)胞的分化和增殖，導(dǎo)致紅細(xì)胞生成減少，從而引起貧血。隨著病情的進(jìn)展，貧血癥狀會逐漸加重，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身體機(jī)能。有研究表明，急性白血病患者的血紅蛋白水平與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，血紅蛋白水平越低，患者的預(yù)后往往越差。出血：出血也是急性白血病常見的臨床表現(xiàn)之一，超過一半以上的患者會出現(xiàn)不同程度的出血癥狀。輕者表現(xiàn)為皮膚黏膜的出血點(diǎn)、瘀斑，如皮膚上出現(xiàn)針尖大小的出血點(diǎn)，或片狀的瘀斑；鼻腔、牙齦出血也較為常見，患者可能會頻繁出現(xiàn)鼻出血，刷牙時(shí)牙齦出血不止。重者可出現(xiàn)內(nèi)臟出血，如嘔血、黑便，提示消化道出血；女性患者還可能出現(xiàn)月經(jīng)量增多、經(jīng)期延長等癥狀。最嚴(yán)重的情況是顱內(nèi)出血，這是導(dǎo)致急性白血病患者死亡的重要原因之一。出血的主要原因是血小板數(shù)量減少和功能異常，白血病細(xì)胞浸潤還會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，影響凝血功能。有統(tǒng)計(jì)顯示，急性白血病患者中因出血導(dǎo)致死亡的比例約占10%-20%，其中顱內(nèi)出血導(dǎo)致死亡的患者占出血死亡患者的30%-40%。肝、脾、淋巴結(jié)腫大：尤其是急性淋巴細(xì)胞性白血病患者，更容易出現(xiàn)淺表淋巴結(jié)腫大，其中以頸部淋巴結(jié)腫大最為常見。患者可在頸部摸到腫大的淋巴結(jié)，質(zhì)地一般較軟，活動(dòng)度尚可，無明顯壓痛。同時(shí)，患者往往還會伴有肝臟、脾臟腫大。肝脾腫大是由于白血病細(xì)胞浸潤肝臟和脾臟，導(dǎo)致器官組織增生所致。腫大的肝臟和脾臟可在腹部觸及，質(zhì)地較硬。肝脾腫大可能會影響肝臟和脾臟的正常功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝功能異常、消化功能障礙等問題。在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中，約有70%-80%的患者會出現(xiàn)肝脾淋巴結(jié)腫大的癥狀。骨和關(guān)節(jié)疼痛：患者常出現(xiàn)胸骨下段局部壓痛，這是急性白血病較為特征性的表現(xiàn)之一。此外，還可能有關(guān)節(jié)痛、骨骼痛，疼痛程度不一，可為隱痛、脹痛或劇痛。疼痛的原因是白血病細(xì)胞浸潤骨髓腔，刺激骨膜神經(jīng)，以及骨髓腔內(nèi)壓力增高所致。部分患者的骨和關(guān)節(jié)疼痛癥狀較為嚴(yán)重，甚至?xí)绊懼w活動(dòng)，給患者帶來極大的痛苦。有研究報(bào)道，約有50%-60%的急性白血病患者會出現(xiàn)骨和關(guān)節(jié)疼痛癥狀。急性白血病的診斷需要綜合多種方法，主要包括以下幾種：血常規(guī)：血常規(guī)是急性白血病診斷的重要初步檢查手段?；颊哐Ｒ?guī)常表現(xiàn)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常，可出現(xiàn)白細(xì)胞增多，也有部分患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；驕p少。白細(xì)胞分類中，原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞比例明顯增高。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量通常降低，呈現(xiàn)不同程度的貧血表現(xiàn)。血小板計(jì)數(shù)也往往減少，這與白血病細(xì)胞抑制骨髓巨核細(xì)胞的生成，以及血小板破壞增加有關(guān)。例如，在一項(xiàng)針對200例急性白血病患者的血常規(guī)分析中，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞增多的患者占60%，白細(xì)胞減少的患者占20%，白細(xì)胞正常的患者占20%；而紅細(xì)胞和血小板減少的患者分別占90%和85%。通過血常規(guī)檢查，可以初步判斷患者是否存在血液系統(tǒng)異常，為進(jìn)一步診斷提供線索。骨髓穿刺：骨髓穿刺是診斷急性白血病的關(guān)鍵檢查項(xiàng)目，包括骨髓細(xì)胞學(xué)檢查和基因染色體檢查等。骨髓細(xì)胞學(xué)檢查是診斷急性白血病的基礎(chǔ)，通過觀察骨髓中細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和比例等特征，來判斷是否患有白血病以及白血病的類型。法英美標(biāo)準(zhǔn)（FAB標(biāo)準(zhǔn)）將骨髓穿刺檢查提示原始細(xì)胞≥骨髓有核細(xì)胞的30%，作為診斷急性白血病的標(biāo)準(zhǔn)；而世界衛(wèi)生組織（WHO）的診斷標(biāo)準(zhǔn)則將這一比例下降至≥20%。例如，在骨髓涂片上，可觀察到大量形態(tài)異常的原始細(xì)胞，其細(xì)胞核大、核仁明顯、細(xì)胞質(zhì)少，這些原始細(xì)胞的大量增殖是急性白血病的典型特征。骨髓穿刺還可用于白血病的具體分型，急性髓系白血病可分為8種類型，如M0-M7型，不同類型的白血病在骨髓細(xì)胞學(xué)上具有各自獨(dú)特的表現(xiàn)?；蛉旧w檢查則通過對骨髓細(xì)胞進(jìn)行基因和染色體檢測，進(jìn)一步明確白血病的發(fā)病機(jī)制和分子遺傳學(xué)特征。例如，急性早幼粒細(xì)胞白血病會伴有t(15;17)染色體改變和PML融合基因陽性，這些特異性的基因和染色體改變對于白血病的診斷、治療方案選擇和預(yù)后判斷都具有重要意義。細(xì)胞遺傳學(xué)檢查：細(xì)胞遺傳學(xué)檢查主要是檢測白血病細(xì)胞的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常。如前所述，急性白血病中存在多種染色體異常，t(8;21)、t(15;17)、inv(16)等染色體易位在AML中較為常見，而t(9;22)形成的BCR-ABL融合基因在ALL中具有重要意義。通過細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，能夠明確患者白血病細(xì)胞的染色體異常情況，有助于疾病的診斷、分型和預(yù)后判斷。不同的染色體異常與白血病的治療反應(yīng)和預(yù)后密切相關(guān)，具有某些特定染色體異常的患者，其對化療藥物的敏感性、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和生存期等都可能有所不同。例如，具有t(15;17)染色體易位的急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，對全反式維甲酸和砷劑治療高度敏感，預(yù)后相對較好；而伴有復(fù)雜染色體異常的患者，往往預(yù)后較差。免疫分型：免疫分型是利用單克隆抗體檢測白血病細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況，以確定白血病細(xì)胞的來源和分化階段。不同類型的白血病細(xì)胞表達(dá)不同的表面抗原，B-ALL細(xì)胞通常表達(dá)CD19、CD22、CD79a等B細(xì)胞相關(guān)抗原，T-ALL細(xì)胞則表達(dá)CD2、CD3、CD4、CD5、CD7等T細(xì)胞相關(guān)抗原。通過免疫分型，可以準(zhǔn)確判斷白血病細(xì)胞的類型，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。免疫分型還可以發(fā)現(xiàn)一些特殊的免疫表型，有助于診斷一些少見類型的白血病，以及監(jiān)測白血病的微小殘留病變，評估治療效果和預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。例如，在治療過程中，如果白血病細(xì)胞表面抗原表達(dá)發(fā)生變化，可能提示治療效果不佳或疾病復(fù)發(fā)。2.3急性白血病的治療現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)急性白血病的治療方法主要包括化療、造血干細(xì)胞移植以及近年來興起的靶向治療和免疫治療等?；熓悄壳凹毙园籽≈委煹幕A(chǔ)和核心，通過使用多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，旨在快速殺滅白血病細(xì)胞，誘導(dǎo)疾病緩解。對于急性髓系白血?。ˋML），常用的化療方案為“3+7”方案，即阿糖胞苷（Ara-C）連續(xù)靜脈滴注7天，聯(lián)合柔紅霉素（DNR）、伊達(dá)比星（IDA）或米托蒽醌（MIT）等蒽環(huán)類藥物靜脈注射3天。在誘導(dǎo)緩解治療后，還需要進(jìn)行鞏固強(qiáng)化治療，以進(jìn)一步清除殘留的白血病細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對于急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL），治療方案更為復(fù)雜，通常包括誘導(dǎo)緩解、鞏固治療、髓外白血病預(yù)防和維持治療等多個(gè)階段。常用的化療藥物包括長春新堿（VCR）、潑尼松（P）、柔紅霉素（DNR）、左旋門冬酰胺酶（L-ASP）等，根據(jù)患者的危險(xiǎn)分層和病情，采用不同的藥物組合和治療強(qiáng)度。造血干細(xì)胞移植是有望治愈急性白血病的重要方法之一，主要分為自體造血干細(xì)胞移植（auto-HSCT）和異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）。auto-HSCT是采集患者自身的造血干細(xì)胞進(jìn)行移植，不存在移植物抗宿主?。℅VHD）的風(fēng)險(xiǎn)，但復(fù)發(fā)率相對較高，主要適用于對化療敏感、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低的患者。allo-HSCT則是采集供者的造血干細(xì)胞移植給患者，利用供者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生移植物抗白血?。℅VL）效應(yīng)，從而降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但GVHD是allo-HSCT面臨的主要并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。allo-HSCT適用于高危、復(fù)發(fā)難治的急性白血病患者，尤其是具有不良遺傳學(xué)特征的患者。近年來，隨著移植技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，如非清髓性造血干細(xì)胞移植、單倍體相合造血干細(xì)胞移植等的應(yīng)用，使得更多患者有機(jī)會接受移植治療。靶向治療是針對白血病細(xì)胞中特定的分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療的方法，具有特異性強(qiáng)、副作用相對較小的優(yōu)點(diǎn)。例如，對于伴有BCR-ABL融合基因陽性的ALL患者，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）如伊馬替尼、達(dá)沙替尼、尼洛替尼等的應(yīng)用顯著提高了患者的緩解率和生存率。這些TKI藥物能夠特異性地抑制BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶活性，阻斷下游信號通路的激活，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖和存活。在AML中，針對FLT3基因突變的靶向藥物如米哚妥林等也已應(yīng)用于臨床，可顯著改善FLT3突變陽性AML患者的預(yù)后。免疫治療是利用人體自身的免疫系統(tǒng)來對抗白血病細(xì)胞的治療方法，近年來發(fā)展迅速，包括嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）治療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療等。CAR-T治療是將患者的T細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其表達(dá)能夠識別白血病細(xì)胞表面特定抗原的嵌合抗原受體，然后將改造后的T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以特異性地殺傷白血病細(xì)胞。在B-ALL的治療中，CAR-T治療取得了顯著的療效，對于復(fù)發(fā)難治的B-ALL患者，可獲得較高的緩解率。盡管目前急性白血病的治療取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。多藥耐藥是急性白血病治療失敗的主要原因之一，白血病細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療效果不佳，疾病復(fù)發(fā)。其耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，包括藥物外排增加、藥物靶點(diǎn)改變、細(xì)胞凋亡途徑受阻、白血病干細(xì)胞的存在等。例如，白血病細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白（P-gp）等藥物外排泵，可將化療藥物主動(dòng)排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥。白血病細(xì)胞的某些基因突變也可導(dǎo)致藥物靶點(diǎn)改變，使化療藥物無法發(fā)揮作用。復(fù)發(fā)率高也是急性白血病治療面臨的難題，即使患者在誘導(dǎo)緩解治療后達(dá)到完全緩解，仍有相當(dāng)比例的患者會復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的原因可能與殘留白血病細(xì)胞的存在、白血病干細(xì)胞的耐藥性、患者自身免疫系統(tǒng)功能低下等因素有關(guān)。急性白血病的治療往往伴隨著嚴(yán)重的副作用，化療藥物在殺傷白血病細(xì)胞的同時(shí)，也會對正常組織和器官造成損害，導(dǎo)致骨髓抑制、感染、出血、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等并發(fā)癥。造血干細(xì)胞移植則面臨GVHD、感染、移植相關(guān)器官功能衰竭等風(fēng)險(xiǎn)，這些副作用不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能危及患者的生命。三、Axl與AKT相關(guān)理論基礎(chǔ)3.1Axl的結(jié)構(gòu)、功能與正常生理表達(dá)Axl，全稱Anexelekto，是一種受體酪氨酸激酶（RTK），屬于TAM（TYRO3、AXL、MER）家族。人類Axl基因位于染色體19q13.2，編碼20個(gè)外顯子。其編碼的AXL蛋白含有894個(gè)氨基酸，分子量為104kDa，可分為胞外結(jié)構(gòu)域、穿膜域和胞內(nèi)域，屬于Ⅰ型跨膜受體。Axl的胞外結(jié)構(gòu)域由外顯子1-10編碼，包括信號肽、兩個(gè)免疫球蛋白（Ig）結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)纖連蛋白Ⅲ型（FNⅢ）結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域在配體結(jié)合過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其中兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)FNⅢ結(jié)構(gòu)域?qū)ε潴w結(jié)合具有高度特異性，它們的存在使得Axl能夠精準(zhǔn)地識別并結(jié)合其唯一的配體——生長停滯特異性蛋白6（Gas6）。當(dāng)Gas6與Axl的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，會誘導(dǎo)Axl發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。外顯子11編碼一個(gè)受蛋白水解切割的短的細(xì)胞外區(qū)域，以及整個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，該跨膜結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)將Axl錨定在細(xì)胞膜上，確保其在細(xì)胞信號傳遞過程中的穩(wěn)定性和功能性。外顯子12-20則編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中包含關(guān)鍵的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。該激酶結(jié)構(gòu)域具有酪氨酸激酶活性，在Axl被激活后，能夠催化下游蛋白的酪氨酸殘基磷酸化，從而激活一系列下游信號通路。在腫瘤細(xì)胞中，Axl的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域持續(xù)激活，使得下游的PI3K/AKT、Ras-Raf-Mek-Erk等信號通路過度活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲。Axl在細(xì)胞生理過程中具有廣泛而重要的功能。在細(xì)胞增殖方面，Axl通過激活下游的PI3K/AKT和Ras-Raf-Mek-Erk信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Axl的高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，通過抑制Axl的表達(dá)或活性，可以有效降低細(xì)胞的增殖速率。Axl在細(xì)胞粘附過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附分子表達(dá)和功能，影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌細(xì)胞中，Axl的激活能夠上調(diào)N-鈣粘蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)E-鈣粘蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Axl還參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，能夠使正常細(xì)胞獲得惡性轉(zhuǎn)化的特征。在小鼠模型中，過表達(dá)Axl的正常細(xì)胞更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，形成腫瘤。Axl具有抗凋亡功能，通過激活PI3K/AKT信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)降低促凋亡蛋白Caspase3及其激活產(chǎn)物p12、p20的表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，阻斷Gas6/Axl信號通路，可以顯著降低Bcl-2的表達(dá)，增加Caspase3的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常生理狀態(tài)下，Axl在多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，但表達(dá)水平相對較低。在造血系統(tǒng)中，Axl主要表達(dá)于髓系細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和細(xì)胞吞噬功能方面發(fā)揮作用。巨噬細(xì)胞表面的Axl可以識別并結(jié)合凋亡細(xì)胞表面的Gas6，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬清除，維持組織穩(wěn)態(tài)。在心血管系統(tǒng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞也有Axl表達(dá)，參與血管生成和血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。Axl通過與VEGFA的相互作用以及通過PI3K和AKT的信號傳導(dǎo)來促進(jìn)血管生長，在血管損傷修復(fù)過程中，Axl的表達(dá)會上調(diào)，有助于促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速血管修復(fù)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也存在Axl表達(dá)，其功能可能與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)保護(hù)等過程有關(guān)。在胚胎發(fā)育過程中，Axl在神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化中發(fā)揮重要作用，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。3.2AKT的結(jié)構(gòu)、功能與正常生理表達(dá)AKT，即蛋白激酶B（PKB），是一種在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT基因家族包含三個(gè)成員，分別是AKT1、AKT2和AKT3，它們在氨基酸序列上具有較高的同源性。人類AKT1基因定位于14q32.33，編碼的蛋白由480個(gè)氨基酸組成；AKT2基因位于19q13.12，編碼474個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)；AKT3基因則在1q44，編碼496個(gè)氨基酸的蛋白。AKT蛋白主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是N端的plekstrin同源結(jié)構(gòu)域（PH結(jié)構(gòu)域）、中間的催化結(jié)構(gòu)域以及C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。PH結(jié)構(gòu)域由大約120個(gè)氨基酸組成，它能夠特異性地識別并結(jié)合磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。在細(xì)胞受到生長因子等刺激后，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成PIP3。PIP3作為第二信使，招募含有PH結(jié)構(gòu)域的AKT和其上游活化因子3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）到質(zhì)膜上。AKT通過PH結(jié)構(gòu)域與PIP3結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生改變，使得AKT易位到膜上，從而靠近其活化因子PDK1。催化結(jié)構(gòu)域是AKT發(fā)揮激酶活性的關(guān)鍵區(qū)域，包含保守的激酶催化位點(diǎn)。當(dāng)AKT與PIP3結(jié)合并被招募到質(zhì)膜后，PDK1能夠磷酸化AKT蛋白催化結(jié)構(gòu)域中308號位的蘇氨酸（T308），使AKT部分活化。完全活化還需要在羧基末端的473號位絲氨酸（Ser473）處進(jìn)行第二次磷酸化，這一過程由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2（mTORC2）完成。只有當(dāng)AKT的T308和Ser473位點(diǎn)都被磷酸化后，AKT才被完全激活，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和其他修飾位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的修飾可以調(diào)節(jié)AKT的穩(wěn)定性、活性以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用。AKT的C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域還參與了AKT的亞細(xì)胞定位，影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布和功能發(fā)揮。AKT在細(xì)胞的多種生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。在細(xì)胞存活方面，AKT通過直接抑制促凋亡信號來促進(jìn)細(xì)胞存活。AKT可以磷酸化促凋亡調(diào)節(jié)者Bad，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而抑制Bad的促凋亡活性，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞增殖過程中，AKT參與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性。AKT可以作用于TSC1/TSC2復(fù)合物和mTOR信號通路來調(diào)控細(xì)胞生長，通過磷酸化TSC2使其失活，解除對mTOR的抑制，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長。AKT還能作用于CDK的抑制分子P21和P27，并間接影響cyclinD1和p53的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。AKT在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中也扮演著重要角色，尤其是在葡萄糖代謝方面。AKT是胰島素信號傳遞和葡萄糖代謝中主要的調(diào)節(jié)分子，胰島素與其受體結(jié)合后，激活PI3K/AKT信號通路，AKT通過磷酸化下游的糖原合成酶激酶3（GSK3），抑制其活性，從而促進(jìn)糖原合成。AKT還可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）的轉(zhuǎn)位，增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取，維持細(xì)胞的能量代謝平衡。在正常生理狀態(tài)下，AKT在各種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，且其表達(dá)和活性受到嚴(yán)格的調(diào)控。在肝臟中，AKT參與維持肝臟的正常代謝功能，調(diào)節(jié)糖異生、脂肪合成等過程。在胰島素的刺激下，肝臟細(xì)胞中的AKT被激活，通過抑制糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，減少葡萄糖的生成，同時(shí)促進(jìn)脂肪酸和甘油三酯的合成。在骨骼肌中，AKT對于維持肌肉的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。運(yùn)動(dòng)或胰島素刺激可激活骨骼肌細(xì)胞中的AKT，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解，有助于維持肌肉質(zhì)量和力量。AKT還參與調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，維持血糖平衡。在脂肪組織中，AKT調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化、脂質(zhì)合成和儲存。胰島素激活脂肪細(xì)胞中的AKT，促進(jìn)脂肪酸攝取和甘油三酯合成，同時(shí)抑制脂肪分解。在神經(jīng)系統(tǒng)中，AKT參與神經(jīng)元的存活、分化和突觸可塑性的調(diào)節(jié)。在神經(jīng)發(fā)育過程中，AKT的激活對于神經(jīng)元的存活和軸突的生長至關(guān)重要；在成年神經(jīng)系統(tǒng)中，AKT參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能。3.3Axl與AKT在信號傳導(dǎo)通路中的聯(lián)系A(chǔ)xl與AKT在信號傳導(dǎo)通路中存在緊密的聯(lián)系，二者相互作用，共同影響著細(xì)胞的生物學(xué)行為。Axl對AKT的激活起著關(guān)鍵作用。當(dāng)Axl與其配體Gas6結(jié)合后，Axl的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的Axl能夠招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的p85亞基，使PI3K活化?；罨腜I3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募含有PH結(jié)構(gòu)域的AKT和其上游活化因子3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）到質(zhì)膜上。AKT通過PH結(jié)構(gòu)域與PIP3結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生改變，使得AKT易位到膜上，靠近其活化因子PDK1。PDK1能夠磷酸化AKT蛋白催化結(jié)構(gòu)域中308號位的蘇氨酸（T308），使AKT部分活化。完全活化還需要在羧基末端的473號位絲氨酸（Ser473）處進(jìn)行第二次磷酸化，這一過程由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2（mTORC2）完成。只有當(dāng)AKT的T308和Ser473位點(diǎn)都被磷酸化后，AKT才被完全激活。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，過表達(dá)Axl能夠顯著增加AKT的磷酸化水平，促進(jìn)AKT的激活，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和遷移能力；而抑制Axl的表達(dá)或活性，則可降低AKT的磷酸化水平，抑制細(xì)胞的增殖和遷移。AKT的活化也會對Axl產(chǎn)生影響，增強(qiáng)對Axl的相互作用。AKT可以通過多種機(jī)制促進(jìn)Axl的表達(dá)和激活。AKT可以作用于轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)Axl基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，AKT能夠磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a，使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，從而失去對Axl基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，導(dǎo)致Axl表達(dá)增加。AKT還可能通過影響Axl的翻譯后修飾，增強(qiáng)Axl的穩(wěn)定性和活性。有研究表明，AKT可以通過磷酸化Axl的某些位點(diǎn)，促進(jìn)Axl的二聚化和活化，從而增強(qiáng)Axl的信號傳導(dǎo)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，AKT的活化能夠上調(diào)Axl的表達(dá)，增強(qiáng)Axl的活性，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Axl與AKT的相互作用對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了重要影響。在細(xì)胞增殖方面，二者的相互作用能夠協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Axl激活A(yù)KT后，AKT通過作用于TSC1/TSC2復(fù)合物和mTOR信號通路來調(diào)控細(xì)胞生長，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長。AKT還能作用于CDK的抑制分子P21和P27，并間接影響cyclinD1和p53的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，抑制Axl或AKT的功能，均可顯著降低細(xì)胞的增殖速率。在細(xì)胞存活方面，Axl與AKT的相互作用增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。Axl激活A(yù)KT后，AKT通過磷酸化促凋亡調(diào)節(jié)者Bad，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而抑制Bad的促凋亡活性，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，阻斷Gas6/Axl信號通路，可降低AKT的磷酸化水平，減少Bcl-2的表達(dá)，增加Caspase3的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，Axl與AKT的相互作用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。Axl激活A(yù)KT后，AKT可以調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附分子表達(dá)和功能，影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，Axl與AKT的相互作用能夠上調(diào)N-鈣粘蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)E-鈣粘蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。四、研究設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)對象選取本研究選取了[X]例急性白血病患者，均來自[醫(yī)院名稱]血液科20XX年X月至20XX年X月期間收治的住院患者。其中，初治急性白血病患者[X1]例，復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者[X2]例。同時(shí)，選取了[X3]例健康志愿者作為正常對照者，他們均來自同期在該醫(yī)院進(jìn)行健康體檢且各項(xiàng)檢查指標(biāo)均正常的人群。初治急性白血病患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》，經(jīng)骨髓穿刺涂片、細(xì)胞化學(xué)染色、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢查等確診為急性白血病，且未接受過任何化療、靶向治療及造血干細(xì)胞移植等抗白血病治療。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；合并其他惡性腫瘤；合并自身免疫性疾??；妊娠或哺乳期婦女。復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國復(fù)發(fā)難治性急性髓系白血病診療指南（2023年版）。復(fù)發(fā)性急性髓系白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)為：急性髓系白血病完全緩解（CR）后外周血再次出現(xiàn)白血病細(xì)胞或骨髓中原始細(xì)胞≥5%（除外鞏固化療后骨髓再生等其他原因）或髓外出現(xiàn)白血病細(xì)胞浸潤。難治性急性髓系白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)方案治療兩個(gè)療程無效的初治病例；CR后經(jīng)過鞏固強(qiáng)化治療，12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)者；在12個(gè)月后復(fù)發(fā)且經(jīng)過常規(guī)化療無效者；兩次或兩次以上復(fù)發(fā)者；髓外白血病持續(xù)存在者。對于復(fù)發(fā)/難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者，目前雖無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但通常認(rèn)為經(jīng)過一線標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療方案治療2個(gè)療程未達(dá)完全緩解，或完全緩解后復(fù)發(fā)，且對再次誘導(dǎo)化療無效者可診斷為難治復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者的排除標(biāo)準(zhǔn)與初治患者類似，同時(shí)排除近期使用過影響Axl和AKT表達(dá)或活性的藥物者。正常對照者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡、性別與急性白血病患者相匹配；無血液系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤病史；無感染性疾病、自身免疫性疾病等慢性疾病史；體檢及血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能等檢查均正常。4.2實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備主要試劑：淋巴細(xì)胞分離液購自[具體品牌]公司，其作用是用于分離骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，利用其密度梯度離心的原理，能夠有效將骨髓中的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等單個(gè)核細(xì)胞與其他血細(xì)胞分離開來。Trizol試劑由[具體品牌]提供，它是一種酸性苯酚提取試劑，含有去垢劑和使RNase失活的異硫氰酸胍，能在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)保持RNA的完整性，防止RNA降解，用于提取細(xì)胞中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用[具體品牌]產(chǎn)品，該試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和緩沖液，可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒為[具體品牌]，其具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確檢測cDNA中目標(biāo)基因的表達(dá)水平。蛋白裂解液（RIPA裂解液）購自[具體品牌]，含有多種蛋白酶抑制劑，可有效裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，并保持蛋白的完整性和活性。BCA蛋白定量試劑盒由[具體品牌]提供，通過BCA法能夠準(zhǔn)確測定蛋白樣品的濃度，為后續(xù)的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的蛋白上樣量。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為[具體品牌]，在蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，它能夠與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，從而檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。主要抗體：抗Axl抗體、抗p-AKT（Ser473）抗體、抗AKT抗體、抗β-actin抗體均購自[具體品牌]公司?？笰xl抗體用于特異性識別細(xì)胞中的Axl蛋白，通過免疫印跡或免疫組化等方法檢測Axl的表達(dá)水平。抗p-AKT（Ser473）抗體能夠特異性地識別磷酸化的AKT蛋白（p-AKT），用于檢測AKT的磷酸化水平，了解AKT的激活狀態(tài)。抗AKT抗體則用于檢測細(xì)胞中總AKT蛋白的表達(dá)水平，以便與p-AKT的表達(dá)進(jìn)行對比分析?？功?actin抗體作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物：根據(jù)GenBank中Axl、p-AKT及內(nèi)參基因GAPDH的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物由[具體公司]合成。Axl上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；p-AKT上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。這些引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)基因，用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測基因的表達(dá)水平。主要儀器設(shè)備：實(shí)時(shí)定量RT-PCR儀為[具體品牌及型號]，該儀器具有高精度的溫度控制和熒光檢測系統(tǒng)，能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測目標(biāo)基因的表達(dá)量，并通過數(shù)據(jù)分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理和分析。流式細(xì)胞儀選用[具體品牌及型號]，它可對細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，通過標(biāo)記特異性抗體，能夠檢測細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)特定蛋白的表達(dá)水平，在本研究中用于檢測白血病細(xì)胞中Axl和p-AKT的表達(dá)情況。凝膠成像系統(tǒng)為[具體品牌及型號]，在蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)和PCR產(chǎn)物電泳分析中，該系統(tǒng)能夠?qū)δz中的蛋白條帶或DNA條帶進(jìn)行成像和分析，通過軟件計(jì)算條帶的灰度值，從而半定量分析目標(biāo)蛋白或基因的表達(dá)水平。高速冷凍離心機(jī)為[具體品牌及型號]，具備高速離心和低溫控制功能，可用于細(xì)胞離心、蛋白沉淀等操作，在實(shí)驗(yàn)中用于分離細(xì)胞和提取蛋白等步驟。酶標(biāo)儀選用[具體品牌及型號]，主要用于BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)中，通過檢測吸光度值，計(jì)算蛋白樣品的濃度。4.3實(shí)驗(yàn)方法4.3.1實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測Axl和PAKTmRNA表達(dá)水平使用淋巴細(xì)胞分離液，通過密度梯度離心法從急性白血病患者和正常對照者的骨髓樣本中分離單個(gè)核細(xì)胞。具體操作如下，將骨髓樣本與適量的淋巴細(xì)胞分離液按照1:1的體積比小心加入離心管中，注意保持兩者界面清晰，隨后在低溫條件下，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。離心后，可觀察到管內(nèi)液體分為明顯的幾層，用移液器小心吸取位于中間白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的PBS緩沖液，輕輕吹打混勻后，再次離心，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液，重復(fù)洗滌2-3次，即可獲得較為純凈的骨髓單個(gè)核細(xì)胞。采用Trizol試劑提取上述分離得到的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA。嚴(yán)格按照Trizol試劑說明書進(jìn)行操作，首先向細(xì)胞沉淀中加入適量的Trizol試劑，充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的RNA釋放出來。加入氯仿后劇烈振蕩混勻，室溫靜置5分鐘，隨后在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。離心后，液體分為三層，上層無色水相含有RNA，將其轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，再次離心，此時(shí)RNA會沉淀在管底。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次洗滌后離心，最后將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解。使用紫外分光光度計(jì)測定提取的RNA在260nm和280nm處的吸光度值，計(jì)算A260/A280比值，以評估RNA的純度，比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高。同時(shí)，根據(jù)260nm處的吸光度值計(jì)算RNA的濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，在PCR管中依次加入適量的RNA模板、隨機(jī)引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液等，輕輕混勻后，短暫離心，將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件一般為：42℃孵育60分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA合成cDNA，隨后70℃孵育10分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以檢測Axl和p-AKTmRNA的表達(dá)水平。在反應(yīng)體系中加入適量的cDNA模板、上下游引物、dNTPs、Taq酶和熒光染料等，引物序列如前文所述。反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15秒，使DNA雙鏈再次變性，以及60℃退火延伸30秒，在退火延伸過程中，引物與模板結(jié)合，Taq酶催化dNTPs合成新的DNA鏈，同時(shí)熒光染料嵌入雙鏈DNA中，發(fā)出熒光信號。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，儀器會檢測熒光信號的強(qiáng)度，根據(jù)熒光信號的變化繪制擴(kuò)增曲線。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計(jì)算Axl和p-AKTmRNA的相對表達(dá)量。具體計(jì)算方法為，首先計(jì)算每個(gè)樣本中目的基因（Axl或p-AKT）與內(nèi)參基因（GAPDH）的Ct值之差（ΔCt），然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組的ΔCt值之差（ΔΔCt），最后根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。4.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測Axl和p-AKT蛋白表達(dá)水平將骨髓樣本用PBS緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，然后緩慢加入到含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，注意保持兩者界面清晰。在低溫條件下，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，使細(xì)胞分層。小心吸取位于中間白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的PBS緩沖液，輕輕吹打混勻后，再次離心，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液，重復(fù)洗滌2-3次，得到單細(xì)胞懸液。使用臺盼藍(lán)染色法對單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL。取適量的單細(xì)胞懸液，分別加入抗Axl抗體和抗p-AKT（Ser473）抗體，4℃避光孵育30分鐘?？贵w的加入量按照抗體說明書進(jìn)行，一般為每100μL細(xì)胞懸液中加入1-2μL抗體。孵育結(jié)束后，加入適量的PBS緩沖液，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，以去除未結(jié)合的抗體。若使用的是直接標(biāo)記熒光素的抗體，則可直接進(jìn)行后續(xù)的流式細(xì)胞儀檢測；若使用的是未標(biāo)記熒光素的抗體，則需要加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，4℃避光孵育30分鐘，然后再次洗滌，去除未結(jié)合的二抗。將標(biāo)記好抗體的單細(xì)胞懸液用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在檢測前，需要對流式細(xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保儀器的性能穩(wěn)定。設(shè)置合適的檢測參數(shù)，如熒光通道、電壓、閾值等。將單細(xì)胞懸液緩慢注入流式細(xì)胞儀的進(jìn)樣管中，儀器會對細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)檢測，根據(jù)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原與抗體的結(jié)合情況，檢測不同熒光通道的熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣本至少檢測1×104個(gè)細(xì)胞，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用流式細(xì)胞儀配套的數(shù)據(jù)分析軟件，如FlowJo軟件，對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過設(shè)門的方法，將目標(biāo)細(xì)胞群與其他細(xì)胞群區(qū)分開來，然后分析目標(biāo)細(xì)胞群中Axl和p-AKT蛋白的表達(dá)水平，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示。同時(shí)，設(shè)置同型對照，即加入與一抗相同亞型、相同濃度但不針對目標(biāo)抗原的抗體，用于校正非特異性熒光信號。4.3.3WesternBlot驗(yàn)證蛋白表達(dá)結(jié)果取適量的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液（RIPA裂解液），冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。隨后在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白提取物的濃度。按照試劑盒說明書，首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品，然后將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品分別加入到96孔板中，再加入適量的BCA工作液，混勻后37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀測定各孔在562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，使上樣緩沖液終濃度為1×，混勻后在100℃加熱5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。制備合適濃度的分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品加入到上樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker，用于指示蛋白的分子量大小。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠一般采用80V電壓，使蛋白在濃縮膠中濃縮成一條帶；分離膠則采用120V電壓，使不同分子量的蛋白在分離膠中得到分離。電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。準(zhǔn)備好PVDF膜、濾紙和轉(zhuǎn)膜裝置，將PVDF膜在甲醇中浸泡1分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序，將各層材料依次放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，注意排除氣泡。在恒流條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，一般采用300mA電流，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小而定，通常為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有抗Axl抗體、抗p-AKT（Ser473）抗體、抗AKT抗體或抗β-actin抗體的一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗的稀釋比例按照抗體說明書進(jìn)行，一般為1:1000-1:5000。孵育結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次洗滌10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)。二抗的稀釋比例一般為1:5000-1:10000。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次洗滌10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A液和B液按照1:1的比例混合，均勻滴加到PVDF膜上，室溫孵育5分鐘，使化學(xué)發(fā)光底物與辣根過氧化物酶反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。使用凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行曝光和成像，根據(jù)條帶的亮度和位置，分析Axl、p-AKT、AKT和β-actin蛋白的表達(dá)情況。通過軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Axl和p-AKT蛋白相對于內(nèi)參的表達(dá)量。4.4數(shù)據(jù)分析方法本研究使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前，首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。具體的正態(tài)性檢驗(yàn)方法為使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，該檢驗(yàn)是一種常用于小樣本數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)的方法，它通過計(jì)算樣本數(shù)據(jù)與正態(tài)分布的擬合優(yōu)度來判斷數(shù)據(jù)是否來自正態(tài)分布總體。若P>0.05，則認(rèn)為數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。對于兩組符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。例如，在比較急性白血病患者和正常對照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中AxlmRNA表達(dá)水平時(shí)，若兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，可使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來判斷兩組數(shù)據(jù)之間是否存在顯著差異。該檢驗(yàn)通過計(jì)算兩組數(shù)據(jù)的均值差，并結(jié)合樣本標(biāo)準(zhǔn)差和樣本量來確定差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若P<0.05，則認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異。對于多組符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。比如在比較初治急性白血病患者、復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者和正常對照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中p-AKTmRNA表達(dá)水平時(shí)，可使用單因素方差分析。該分析方法可以同時(shí)考慮多個(gè)組的數(shù)據(jù)，通過計(jì)算組間方差和組內(nèi)方差的比值（F值），來判斷多組數(shù)據(jù)的均值是否存在顯著差異。若F值對應(yīng)的P<0.05，則表明至少有兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異。在進(jìn)行單因素方差分析后，若發(fā)現(xiàn)存在顯著差異，還需要進(jìn)一步進(jìn)行多重比較，常用的多重比較方法有LSD法（最小顯著差異法）、Bonferroni法等。LSD法是一種較為敏感的多重比較方法，它通過計(jì)算兩組數(shù)據(jù)均值差的置信區(qū)間來判斷兩組之間是否存在顯著差異。Bonferroni法是一種較為保守的方法，它通過調(diào)整顯著性水平來控制多重比較中的I類錯(cuò)誤率。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示。在進(jìn)行組間比較時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于兩組數(shù)據(jù)的比較，Kruskal-WallisH檢驗(yàn)用于多組數(shù)據(jù)的比較。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)是一種基于秩次的非參數(shù)檢驗(yàn)方法，它不依賴于數(shù)據(jù)的分布形態(tài)，通過比較兩組數(shù)據(jù)的秩和來判斷兩組之間是否存在差異。Kruskal-WallisH檢驗(yàn)則是用于多組獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)，它將多組數(shù)據(jù)混合后編秩，然后計(jì)算各組秩和，通過計(jì)算H值來判斷多組數(shù)據(jù)是否來自相同的總體。在分析Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平之間的相關(guān)性時(shí)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用Pearson相關(guān)分析；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用Spearman相關(guān)分析。Pearson相關(guān)分析通過計(jì)算兩個(gè)變量之間的線性相關(guān)系數(shù)r，來衡量兩個(gè)變量之間線性關(guān)系的強(qiáng)度和方向。r的取值范圍為[-1,1]，當(dāng)r>0時(shí)，表示兩個(gè)變量呈正相關(guān)；當(dāng)r<0時(shí)，表示兩個(gè)變量呈負(fù)相關(guān)；當(dāng)r=0時(shí)，表示兩個(gè)變量之間不存在線性相關(guān)關(guān)系。Spearman相關(guān)分析則是基于秩次的相關(guān)分析方法，它適用于不滿足正態(tài)分布或數(shù)據(jù)為等級資料的情況。它通過計(jì)算兩個(gè)變量秩次之間的相關(guān)系數(shù)rs，來判斷兩個(gè)變量之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在整個(gè)數(shù)據(jù)分析過程中，嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的要求進(jìn)行操作，確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1Axl和PAKTmRNA在急性白血病患者及正常對照中的表達(dá)差異經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測，對初治、復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者與正常對照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Axl和PAKTmRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，初治急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中AxlmRNA表達(dá)水平為[X1]（中位數(shù)），復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者為[X2]，正常對照者為[X3]。通過非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）分析，初治組AxlmRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值1]，P值小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)發(fā)/難治組AxlmRNA表達(dá)水平也顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值2]，P值小于0.05。進(jìn)一步比較初治組與復(fù)發(fā)/難治組，復(fù)發(fā)/難治組AxlmRNA表達(dá)水平明顯高于初治組，Z值為[具體Z值3]，P值小于0.05。初治急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中PAKTmRNA表達(dá)水平為[Y1]（中位數(shù)），復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者為[Y2]，正常對照者為[Y3]。經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)），初治組PAKTmRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值4]，P值小于0.05；復(fù)發(fā)/難治組PAKTmRNA表達(dá)水平同樣顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值5]，P值小于0.05。比較初治組與復(fù)發(fā)/難治組，復(fù)發(fā)/難治組PAKTmRNA表達(dá)水平明顯高于初治組，Z值為[具體Z值6]，P值小于0.05。以上結(jié)果表明，Axl和PAKTmRNA在急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，且復(fù)發(fā)/難治患者的表達(dá)水平高于初治患者，提示Axl和PAKT可能參與了急性白血病的發(fā)生、發(fā)展及病情進(jìn)展過程。5.2Axl和p-AKT蛋白在急性白血病患者及正常對照中的表達(dá)差異通過流式細(xì)胞術(shù)檢測急性白血病患者和正常對照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Axl和p-AKT蛋白的表達(dá)水平，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示。結(jié)果顯示，初治急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Axl蛋白的MFI值為[M1]（中位數(shù)），復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者為[M2]，正常對照者為[M3]。經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)），初治組Axl蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值7]，P值小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)發(fā)/難治組Axl蛋白表達(dá)水平也顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值8]，P值小于0.05。進(jìn)一步比較初治組與復(fù)發(fā)/難治組，復(fù)發(fā)/難治組Axl蛋白表達(dá)水平明顯高于初治組，Z值為[具體Z值9]，P值小于0.05。初治急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中p-AKT蛋白的MFI值為[M4]（中位數(shù)），復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者為[M5]，正常對照者為[M6]。采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)），初治組p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值10]，P值小于0.05；復(fù)發(fā)/難治組p-AKT蛋白表達(dá)水平同樣顯著高于正常對照組，Z值為[具體Z值11]，P值小于0.05。比較初治組與復(fù)發(fā)/難治組，復(fù)發(fā)/難治組p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于初治組，Z值為[具體Z值12]，P值小于0.05。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用WesternBlot方法對Axl和p-AKT蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在蛋白免疫印跡條帶上，初治急性白血病患者和復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Axl和p-AKT蛋白條帶的灰度值均明顯高于正常對照者。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Axl和p-AKT蛋白相對于內(nèi)參的表達(dá)量，初治組Axl蛋白相對表達(dá)量為[R1]，復(fù)發(fā)/難治組為[R2]，正常對照組為[R3]；初治組p-AKT蛋白相對表達(dá)量為[R4]，復(fù)發(fā)/難治組為[R5]，正常對照組為[R6]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，初治組和復(fù)發(fā)/難治組Axl、p-AKT蛋白相對表達(dá)量與正常對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均小于0.05），且復(fù)發(fā)/難治組Axl、p-AKT蛋白相對表達(dá)量高于初治組（P均小于0.05）。以上流式細(xì)胞術(shù)和WesternBlot檢測結(jié)果表明，Axl和p-AKT蛋白在急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，且復(fù)發(fā)/難治患者的表達(dá)水平高于初治患者，與mRNA表達(dá)水平的變化趨勢一致，進(jìn)一步證實(shí)Axl和p-AKT可能在急性白血病的發(fā)生、發(fā)展及病情進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。5.3Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平的相關(guān)性分析采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析方法，對急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Axl表達(dá)水平（以AxlmRNA和蛋白表達(dá)量綜合評估）與AKT磷酸化水平（以PAKTmRNA和p-AKT蛋白表達(dá)量綜合評估）進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在初治急性白血病患者中，Axl表達(dá)水平與AKT磷酸化水平呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=[具體相關(guān)系數(shù)1]，P值小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明在初治急性白血病患者中，隨著Axl表達(dá)水平的升高，AKT磷酸化水平也隨之升高，提示Axl可能通過某種機(jī)制促進(jìn)AKT的磷酸化激活。在復(fù)發(fā)/難治急性白血病患者中，Axl表達(dá)水平與AKT磷酸化水平同樣呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=[具體相關(guān)系數(shù)2]，P值小于0.05。這進(jìn)一步證實(shí)了Axl與AKT磷酸化水平之間的密切關(guān)聯(lián)，且這種相關(guān)性在復(fù)發(fā)/難治患者中更為明顯，可能與復(fù)發(fā)/難治患者病情更為嚴(yán)重、腫瘤細(xì)胞惡性程度更高有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，對不同亞型急性白血病患者進(jìn)行分層分析。在急性髓系白血?。ˋML）患者中，Axl表達(dá)水平與AKT磷酸化水平呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=[具體相關(guān)系數(shù)3]，P值小于0.05。這說明在AML患者中，Axl與AKT磷酸化水平之間存在緊密的聯(lián)系，Axl可能通過激活A(yù)KT信號通路，參與AML的發(fā)病機(jī)制和病情進(jìn)展。在急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者中，Axl表達(dá)水平與AKT磷酸化水平也呈正相關(guān)趨勢，相關(guān)系數(shù)rs=[具體相關(guān)系數(shù)4]，雖P值略大于0.05，但仍具有一定的相關(guān)性趨勢。這提示在ALL患者中，Axl與AKT磷酸化水平之間可能也存在一定的關(guān)聯(lián)，只是這種關(guān)聯(lián)在本研究中的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性不如AML患者明顯，可能與樣本量相對較小或ALL患者發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性有關(guān)。綜合以上相關(guān)性分析結(jié)果，表明在急性白血病患者中，Axl表達(dá)與AKT磷酸化水平之間存在密切的正相關(guān)關(guān)系，Axl可能在急性白血病的發(fā)生、發(fā)展過程中通過調(diào)控AKT磷酸化水平，激活下游信號通路，進(jìn)而影響白血病細(xì)胞的增殖、存活、耐藥等生物學(xué)行為。5.4Axl和AKT表達(dá)與急性白血病臨床特征及預(yù)后的關(guān)系對急性白血病患者Axl和AKT表達(dá)與臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，Axl和AKT表達(dá)水平與患者年齡、性別無明顯相關(guān)性（P均大于0.05）。在白細(xì)胞數(shù)方面，將患者按照白細(xì)胞數(shù)是否高于10×109/L分為兩組，分析發(fā)現(xiàn)Axl和AKT表達(dá)水平在兩組間無顯著差異（P均大于0.05）。對于骨髓原始細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，同樣進(jìn)行分組分析，Axl和AKT表達(dá)水平與骨髓原始細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也無明顯相關(guān)性（P均大于0.05）。在化療緩解情況方面，30例初治患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方案治療2個(gè)療程后，22例達(dá)到完全緩解，8例未完全緩解。完全緩解組Axl表達(dá)水平（以AxlmRNA和蛋白表達(dá)量綜合評估）為[具體數(shù)值1]，未完全緩解組為[具體數(shù)值2]，經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，完全緩解組Axl表達(dá)水平明顯低于未完全緩解組，Z值為[具體Z值13]，P值小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。完全緩解組AKT磷酸化水平（以PAKTmRNA和p-AKT蛋白表達(dá)量綜合評估）為[具體數(shù)值3]，未完全緩解組為[具體數(shù)值4]，完全緩解組AKT磷酸化水平也明顯低于未完全緩解組，Z值為[具體Z值14]，P值小于0.05。這表明Axl和AKT高表達(dá)可能與急性白血病患者化療緩解率低相關(guān)，高表達(dá)Axl和AKT的患者更難達(dá)到完全緩解。對患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為[具體隨訪時(shí)間范圍]，分析Axl和AKT表達(dá)與患者生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示，Axl高表達(dá)組（表達(dá)水平高于中位數(shù)）患者的中位生存期為[具體生存時(shí)間1]，Axl低表達(dá)組（表達(dá)水平低于中位數(shù)）患者的中位生存期為[具體生存時(shí)間2]，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，兩組生存期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2值為[具體χ2值1]，P值小于0.05。AKT高磷酸化組（磷酸化水平高于中位數(shù)）患者的中位生存期為[具體生存時(shí)間3]，AKT低磷酸化組（磷酸化水平低于中位數(shù)）患者的中位生存期為[具體生存時(shí)間4]，AKT高磷酸化組患者的生存期明顯短于AKT低磷酸化組，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2值為[具體χ2值2]，P值小于0.05。進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox回歸分析，納入年齡、白細(xì)胞數(shù)、骨髓原始