惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及蛋白質(zhì)組學(xué)深度剖析：探索瘧疾防治新靶點(diǎn)一、引言1.1研究背景1.1.1瘧疾的危害與現(xiàn)狀瘧疾是一種由瘧原蟲感染引發(fā)，經(jīng)雌性按蚊叮咬傳播的寄生蟲病，在全球傳染病中占據(jù)著突出地位。自人類文明誕生以來，瘧疾便如影隨形，長(zhǎng)期威脅著人類的健康與生存。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球范圍內(nèi)估計(jì)有2.41億瘧疾病例，死亡人數(shù)高達(dá)62.7萬。盡管全球瘧疾防控工作持續(xù)推進(jìn)并取得了一定成效，但瘧疾依然是許多發(fā)展中國(guó)家，特別是撒哈拉以南非洲地區(qū)面臨的重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。瘧疾對(duì)人類健康造成的影響是多方面且極其嚴(yán)重的。在癥狀表現(xiàn)上，患者會(huì)出現(xiàn)周期性發(fā)作的寒戰(zhàn)、高熱和出汗等典型癥狀。若病情進(jìn)一步發(fā)展，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)腦瘧、腎功能衰竭、肺水腫等危及生命的并發(fā)癥。尤其是兒童和孕婦這兩類群體，他們的免疫系統(tǒng)相對(duì)脆弱，成為了瘧疾的主要受害人群，其中五歲以下兒童更是占據(jù)了瘧疾死亡病例的三分之二。這不僅意味著無數(shù)鮮活生命的消逝，更給無數(shù)家庭帶來了沉重的打擊，使他們陷入失去親人的悲痛之中。從地域分布來看，瘧疾在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行。這些地區(qū)的氣候條件，如高溫多雨，為按蚊的滋生和繁殖提供了極為適宜的環(huán)境。同時(shí)，當(dāng)?shù)匦l(wèi)生基礎(chǔ)設(shè)施的不完善、醫(yī)療資源的匱乏以及人們衛(wèi)生意識(shí)的淡薄，都使得瘧疾的傳播難以得到有效遏制。例如，在非洲的一些國(guó)家，由于醫(yī)療衛(wèi)生條件有限，許多瘧疾病例無法得到及時(shí)準(zhǔn)確的診斷和有效的治療，導(dǎo)致病情延誤，死亡率居高不下。在經(jīng)濟(jì)層面，瘧疾對(duì)疫區(qū)國(guó)家和地區(qū)的發(fā)展形成了嚴(yán)重阻礙。瘧疾的廣泛傳播使得勞動(dòng)力因病無法正常工作，生產(chǎn)力大幅下降，進(jìn)而影響到農(nóng)業(yè)、工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的生產(chǎn)活動(dòng)。為了應(yīng)對(duì)瘧疾，政府和社會(huì)需要投入大量的資金用于醫(yī)療救治、疾病防控以及相關(guān)科研工作。這無疑加重了當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使得原本就不發(fā)達(dá)的經(jīng)濟(jì)雪上加霜。對(duì)于一些貧困地區(qū)而言，瘧疾甚至成為了導(dǎo)致貧困的重要因素之一，形成了“因病致貧、因貧致病”的惡性循環(huán)。更為嚴(yán)峻的是，瘧原蟲對(duì)抗瘧藥耐藥性的問題日益凸顯，已成為全球瘧疾控制進(jìn)程中最為棘手的難題之一。長(zhǎng)期以來，以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法（ACT）是治療惡性瘧疾最為有效的手段，其療效曾高達(dá)90%以上。但近年來，在柬埔寨和泰國(guó)邊境地區(qū)已確認(rèn)出現(xiàn)青蒿素耐藥性瘧原蟲。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)，使得原本有效的治療方案效果大打折扣，瘧疾病例的治療難度顯著增加。若不能及時(shí)研發(fā)出有效的替代藥物，瘧疾的傳播極有可能進(jìn)一步加劇，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成更大的威脅。1.1.2酸性鈣體研究的重要性在瘧原蟲復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，酸性鈣體作為一種獨(dú)特的細(xì)胞器，近年來受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。它最早由美國(guó)伊利諾依大學(xué)Dr.DocampoRoberto教授的研究團(tuán)隊(duì)在錐蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名。隨后，研究人員又陸續(xù)在利什曼原蟲、頂復(fù)門原蟲（如弓形蟲、瘧原蟲、艾美原蟲）、綠藻、霉菌、細(xì)菌以及人類血小板中均發(fā)現(xiàn)了酸性鈣體的存在。酸性鈣體的結(jié)構(gòu)和功能都十分獨(dú)特。從結(jié)構(gòu)上看，它呈現(xiàn)出一種類似包涵體的空泡形態(tài)，內(nèi)部含有大量大小不等的圓形致密顆粒，這些顆粒富含鈣、磷、鎂等多種化學(xué)元素，這也是其被命名為酸性鈣體的重要原因。在功能方面，酸性鈣體在寄生蟲的生長(zhǎng)代謝、侵襲宿主以及產(chǎn)生毒力等多個(gè)關(guān)鍵過程中都發(fā)揮著不可或缺的作用。大量研究表明，酸性鈣體的膜上存在著多種重要的分子結(jié)構(gòu)，如鈣泵（Ca2+-ATPase）、質(zhì)子泵（Vacuolar-H+-ATPase，Vacuolar-H+-pryophosphatase）、鈉/氫泵（Na+/H+exchanger）、鈣/氫泵（Ca2+/H+exchanger）和水蛋白通道（Aquaporin）、離子通道等。這些成分協(xié)同作用，對(duì)寄生蟲的生存和致病過程產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。例如，鈣泵和質(zhì)子泵能夠調(diào)節(jié)酸性鈣體內(nèi)外的離子濃度和酸堿度，維持細(xì)胞器內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，為寄生蟲的代謝活動(dòng)提供適宜的條件；離子通道則參與了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換和信號(hào)傳遞，對(duì)于寄生蟲感知宿主環(huán)境并做出相應(yīng)的生理反應(yīng)具有重要意義?；谒嵝遭}體在瘧原蟲生命活動(dòng)中的關(guān)鍵作用，以及其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在的特性，使其成為了極具潛力的抗瘧靶點(diǎn)。針對(duì)酸性鈣體開發(fā)抗瘧新藥，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的前景。一方面，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中缺乏酸性鈣體及其相關(guān)的酶系統(tǒng)，因此以酸性鈣體為靶點(diǎn)研發(fā)的藥物可以特異性地作用于瘧原蟲，減少對(duì)人體正常細(xì)胞的損害，降低藥物的副作用；另一方面，瘧原蟲對(duì)現(xiàn)有抗瘧藥物的耐藥性問題日益嚴(yán)重，開發(fā)新的抗瘧靶點(diǎn)和藥物迫在眉睫，酸性鈣體的發(fā)現(xiàn)為抗瘧藥物的研發(fā)提供了新的方向和契機(jī)。目前，雖然在瘧原蟲酸性鈣體的研究方面已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但相較于錐蟲和弓形蟲等其他寄生蟲的酸性鈣體研究，瘧原蟲酸性鈣體的研究還相對(duì)滯后。其具體的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能和代謝特點(diǎn)尚未完全明確，許多關(guān)鍵問題仍有待深入探索。例如，酸性鈣體與瘧原蟲其他細(xì)胞器之間的相互作用機(jī)制、酸性鈣體中各種成分在瘧原蟲致病過程中的具體作用途徑等，都需要進(jìn)一步的研究來揭示。對(duì)瘧原蟲酸性鈣體進(jìn)行深入的蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以全面解析酸性鈣體中蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)和功能，為深入了解瘧原蟲的生物學(xué)特性和致病機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。通過比較瘧原蟲與其他生物酸性鈣體蛋白質(zhì)組的差異，可以發(fā)現(xiàn)瘧原蟲酸性鈣體的獨(dú)特蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，為開發(fā)新型抗瘧藥物提供關(guān)鍵的靶點(diǎn)信息。這將有助于推動(dòng)抗瘧藥物研發(fā)的創(chuàng)新，提高瘧疾治療的效果，為全球瘧疾防控工作提供有力的支持。1.2研究目的與意義本研究旨在通過建立一套高效的分離純化方法，成功獲取高純度的惡性瘧原蟲酸性鈣體，并運(yùn)用先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行深入分析，全面揭示酸性鈣體的蛋白質(zhì)組成和功能特性，為深入理解瘧原蟲的生物學(xué)特性和致病機(jī)制提供關(guān)鍵線索。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，通過對(duì)惡性瘧原蟲酸性鈣體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，能夠更深入地了解酸性鈣體在瘧原蟲生命活動(dòng)中的作用機(jī)制，填補(bǔ)瘧原蟲酸性鈣體研究領(lǐng)域的空白，為瘧原蟲生物學(xué)研究提供新的理論基礎(chǔ)。對(duì)酸性鈣體蛋白質(zhì)組的研究有助于揭示瘧原蟲的進(jìn)化歷程和適應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步豐富對(duì)寄生蟲生物學(xué)的認(rèn)識(shí)。從實(shí)際應(yīng)用角度來看，本研究為抗瘧新藥的研發(fā)提供了重要的靶點(diǎn)信息。隨著瘧原蟲耐藥性問題的日益嚴(yán)重，尋找新的抗瘧靶點(diǎn)和藥物迫在眉睫。酸性鈣體作為瘧原蟲特有的細(xì)胞器，其蛋白質(zhì)組中可能存在一些與瘧原蟲生存和致病密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，這些蛋白有望成為新型抗瘧藥物的作用靶點(diǎn)。通過針對(duì)這些靶點(diǎn)開發(fā)藥物，可以特異性地作用于瘧原蟲，提高藥物的療效，減少對(duì)人體正常細(xì)胞的損害，為全球瘧疾防控工作提供有力的支持。本研究還可能為瘧疾的診斷和治療提供新的思路和方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1惡性瘧原蟲培養(yǎng)在惡性瘧原蟲的培養(yǎng)研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定的成果，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。早在1976年，Trager和Jensen就成功建立了惡性瘧原蟲的體外連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，這一開創(chuàng)性的工作為后續(xù)的瘧原蟲研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。該系統(tǒng)通過使用RPMI1640培養(yǎng)基，并添加人血清和紅細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了惡性瘧原蟲在體外的持續(xù)生長(zhǎng)和繁殖。這一技術(shù)的突破使得科學(xué)家們能夠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中對(duì)瘧原蟲進(jìn)行深入研究，極大地推動(dòng)了瘧疾研究領(lǐng)域的發(fā)展。然而，隨著研究的深入，惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)的局限性也逐漸顯現(xiàn)。其中，新鮮血液來源受限是一個(gè)突出問題。瘧原蟲的生長(zhǎng)依賴于人紅細(xì)胞，而新鮮血液的采集受到諸多因素的限制，如獻(xiàn)血者的數(shù)量、血液的保存條件等。這不僅增加了培養(yǎng)的成本和難度，還限制了大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的開展。寄生蟲在體外培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)不穩(wěn)定，難以擴(kuò)大繁殖。瘧原蟲對(duì)培養(yǎng)條件極為敏感，溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)成分等微小的變化都可能影響其生長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果的不確定性增加。為了解決這些問題，國(guó)內(nèi)外研究人員進(jìn)行了大量的探索和嘗試。一些研究致力于優(yōu)化培養(yǎng)基的配方，通過調(diào)整營(yíng)養(yǎng)成分和添加生長(zhǎng)因子，試圖提高瘧原蟲的生長(zhǎng)效率和穩(wěn)定性。有研究嘗試使用人造血紅蛋白替代天然血液，以解決血液來源受限的問題。雖然這些方法在一定程度上取得了進(jìn)展，但目前仍無法完全滿足大規(guī)模、穩(wěn)定培養(yǎng)惡性瘧原蟲的需求。在國(guó)內(nèi)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在惡性瘧原蟲培養(yǎng)方面取得了重要進(jìn)展。他們通過改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)和優(yōu)化培養(yǎng)條件，成功提高了瘧原蟲的培養(yǎng)成功率和生長(zhǎng)質(zhì)量，為國(guó)內(nèi)的瘧疾研究提供了有力的支持。國(guó)外的一些研究機(jī)構(gòu)，如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）和英國(guó)倫敦衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)院，也在不斷投入資源，開展相關(guān)研究，試圖突破惡性瘧原蟲培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸。1.3.2酸性鈣體分離純化方法對(duì)于酸性鈣體的分離純化，目前國(guó)內(nèi)外主要采用密度梯度離心法。這種方法利用不同細(xì)胞器在密度上的差異，通過離心使其在密度梯度介質(zhì)中分層，從而實(shí)現(xiàn)酸性鈣體的分離。常用的密度梯度介質(zhì)包括Percoll和碘克沙醇等。在利用Percoll進(jìn)行密度梯度離心時(shí)，需要先將Percoll與緩沖液混合，制備成不同密度的梯度溶液。然后將含有酸性鈣體的細(xì)胞勻漿小心地鋪在梯度溶液的頂部，通過高速離心，使酸性鈣體在不同密度層之間形成條帶。收集含有酸性鈣體的條帶，再經(jīng)過多次洗滌和純化，即可得到較高純度的酸性鈣體。碘克沙醇作為一種新型的密度梯度介質(zhì)，具有低滲透壓、無毒性等優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地保持細(xì)胞器的完整性和活性，因此在酸性鈣體分離純化中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。盡管密度梯度離心法在酸性鈣體分離純化中得到了廣泛應(yīng)用，但該方法也存在一些不足之處。操作過程較為復(fù)雜，需要精確控制離心條件和密度梯度的制備，否則容易導(dǎo)致分離效果不佳。分離得到的酸性鈣體純度和產(chǎn)量仍有待提高，難以滿足大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求。此外，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)要求較高，限制了其在一些實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。國(guó)內(nèi)的一些研究團(tuán)隊(duì)在酸性鈣體分離純化方法的改進(jìn)方面進(jìn)行了積極探索。中國(guó)科學(xué)院的研究人員通過優(yōu)化密度梯度離心的參數(shù)和流程，成功提高了酸性鈣體的分離效率和純度。國(guó)外的學(xué)者則嘗試結(jié)合其他技術(shù)，如免疫親和層析和色譜技術(shù)，進(jìn)一步提高酸性鈣體的分離效果。這些研究為酸性鈣體分離純化方法的發(fā)展提供了新的思路和方向。1.3.3蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在瘧疾研究領(lǐng)域的應(yīng)用為深入了解瘧原蟲的生物學(xué)特性和致病機(jī)制提供了強(qiáng)大的工具。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可以全面揭示瘧原蟲在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，從而發(fā)現(xiàn)與瘧原蟲生存、繁殖、致病等過程密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。早期的瘧原蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要采用二維凝膠電泳（2-DE）技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析。2-DE技術(shù)能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量將其分離，形成二維圖譜。通過對(duì)圖譜上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行切割、酶解，再利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從而確定蛋白質(zhì)的種類和表達(dá)水平。這種方法在瘧原蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，幫助研究人員發(fā)現(xiàn)了許多與瘧原蟲生物學(xué)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)逐漸成為主流。LC-MS/MS技術(shù)具有分離效率高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)?fù)雜的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析。通過將蛋白質(zhì)樣品酶解成肽段，然后利用液相色譜將肽段分離，再通過質(zhì)譜對(duì)肽段進(jìn)行鑒定和定量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)組的全面分析。該技術(shù)不僅能夠鑒定出更多的蛋白質(zhì)，還能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的修飾、相互作用等進(jìn)行深入研究，為瘧原蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來了新的突破。在惡性瘧原蟲酸性鈣體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面，目前的研究還相對(duì)較少。已有的研究主要集中在對(duì)酸性鈣體中一些已知蛋白的功能驗(yàn)證，對(duì)于酸性鈣體蛋白質(zhì)組的全面解析尚未完成。酸性鈣體中蛋白質(zhì)的組成和功能仍然存在許多未知領(lǐng)域，需要進(jìn)一步深入研究。這限制了我們對(duì)酸性鈣體在瘧原蟲生命活動(dòng)中作用機(jī)制的全面理解，也為基于酸性鈣體的抗瘧藥物研發(fā)帶來了一定的困難。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1惡性瘧原蟲來源本研究使用的惡性瘧原蟲FCC1/HN株，源自中國(guó)海南地區(qū)的惡性瘧患者。該蟲株具有典型的惡性瘧原蟲生物學(xué)特性，在瘧疾研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。蟲株保存在液氮罐中，采用甘油、山梨醇保護(hù)液（4.2%山梨醇生理鹽水180ml加純甘油70ml）作為保護(hù)劑，在-196℃的液氮環(huán)境下，能夠有效保持瘧原蟲的生物學(xué)活性和遺傳穩(wěn)定性，長(zhǎng)期保存其感染性和致病力。復(fù)蘇時(shí)，從液氮罐中迅速取出含有蟲株的安瓿，立即放入37℃恒溫水浴中快速解凍。在解凍過程中，需不斷輕輕搖晃安瓿，確保蟲株受熱均勻，避免局部過熱或過冷對(duì)蟲株造成損傷。待安瓿內(nèi)的保護(hù)液完全融化后，將蟲株轉(zhuǎn)移至含有RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基中添加了10%的人血清，以提供瘧原蟲生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。同時(shí)，加入適量的青霉素和鏈霉素，終濃度分別為100U/ml和100μg/ml，以防止細(xì)菌污染。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察瘧原蟲的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括紅細(xì)胞的感染率、瘧原蟲的形態(tài)變化等，并及時(shí)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基和紅細(xì)胞，以維持瘧原蟲的生長(zhǎng)和繁殖。2.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：碘克沙醇（Iodixanol），作為密度梯度離心的關(guān)鍵試劑，用于分離酸性鈣體。其純度高，能夠形成穩(wěn)定的密度梯度，有效實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞器的分離；蛋白酶抑制劑（ProteaseInhibitorCocktail），能抑制蛋白酶的活性，防止在實(shí)驗(yàn)過程中蛋白質(zhì)被降解，確保蛋白質(zhì)組學(xué)分析的準(zhǔn)確性；RPMI1640培養(yǎng)基，為惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸、維生素、糖類等；人血清，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，是維持瘧原蟲體外培養(yǎng)的重要補(bǔ)充成分；青霉素和鏈霉素，用于抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，保證培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)；二甲基亞砜（DMSO），在蟲株凍存時(shí)作為保護(hù)劑，降低冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷，提高蟲株的存活率。主要儀器設(shè)備有：超速離心機(jī)（OptimaXPN-100，Beckman），具備高轉(zhuǎn)速（100,000rpm）和強(qiáng)大的離心力（802,000g），能夠滿足密度梯度離心對(duì)高速和高離心力的要求，有效分離酸性鈣體；質(zhì)譜儀（ThermoScientificQExactiveHF），具有高分辨率和高靈敏度，能夠準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列和修飾情況，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeracellVIOS160i），精確控制溫度（37℃）和二氧化碳濃度（5%），為惡性瘧原蟲的體外培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境；熒光顯微鏡（NikonEclipseTi2），用于觀察瘧原蟲的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，通過熒光標(biāo)記技術(shù)，能夠?qū)λ嵝遭}體等細(xì)胞器進(jìn)行特異性觀察和分析。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1惡性瘧原蟲的培養(yǎng)與擴(kuò)增惡性瘧原蟲的培養(yǎng)采用RPMI1640培養(yǎng)基，其中添加了10%的人血清作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充。人血清富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠?yàn)榀懺x的生長(zhǎng)提供必要的支持。同時(shí)，向培養(yǎng)基中加入青霉素和鏈霉素，終濃度分別為100U/ml和100μg/ml，以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，確保培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。在培養(yǎng)過程中，維持溫度在37℃，這是瘧原蟲生長(zhǎng)的最適溫度，能夠保證瘧原蟲的正常代謝和繁殖。二氧化碳濃度控制在5%，以維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為瘧原蟲提供適宜的酸堿環(huán)境。通過不斷補(bǔ)充新鮮的紅細(xì)胞，為瘧原蟲提供充足的營(yíng)養(yǎng)來源，維持蟲體的生長(zhǎng)和繁殖。定期使用顯微鏡觀察瘧原蟲的生長(zhǎng)狀態(tài)，通過觀察紅細(xì)胞的感染率、瘧原蟲的形態(tài)變化（如滋養(yǎng)體、裂殖體的發(fā)育情況）以及瘧原蟲在紅細(xì)胞內(nèi)的分布情況等，來評(píng)估蟲體的生長(zhǎng)狀況。當(dāng)瘧原蟲的密度達(dá)到一定程度，如紅細(xì)胞感染率達(dá)到10%-15%時(shí)，進(jìn)行蟲體的擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)，按照1:3或1:4的比例將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，并添加新鮮的培養(yǎng)基和紅細(xì)胞，以促進(jìn)瘧原蟲的進(jìn)一步生長(zhǎng)和繁殖。2.2.2酸性鈣體的分離純化酸性鈣體的分離純化采用碘克沙醇不連續(xù)密度梯度離心法。首先，制備不同濃度的碘克沙醇溶液，濃度梯度設(shè)置為20%、30%、40%和50%。將這些不同濃度的碘克沙醇溶液按照從低到高的順序，小心地鋪在離心管中，形成不連續(xù)的密度梯度。收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的惡性瘧原蟲，用PBS緩沖液洗滌3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和殘留的血清。然后，將蟲體懸浮在含有蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液中，使用勻漿器在冰浴條件下進(jìn)行勻漿處理，使細(xì)胞充分破碎，釋放出細(xì)胞器。勻漿過程中，要注意控制勻漿的速度和時(shí)間，避免過度勻漿導(dǎo)致細(xì)胞器的損傷。將勻漿液小心地鋪在碘克沙醇密度梯度的頂部，然后將離心管放入超速離心機(jī)中。設(shè)置離心條件為4℃、100,000g，離心時(shí)間為2小時(shí)。在離心過程中，不同密度的細(xì)胞器會(huì)在碘克沙醇密度梯度中形成不同的條帶。酸性鈣體由于其獨(dú)特的密度，會(huì)在特定的密度層形成條帶。離心結(jié)束后，用吸管小心地收集含有酸性鈣體的條帶。將收集到的條帶用PBS緩沖液洗滌3次，以去除殘留的碘克沙醇和其他雜質(zhì)。最后，將洗滌后的酸性鈣體懸浮在適量的緩沖液中，用于后續(xù)的鑒定和分析。在優(yōu)化離心條件時(shí)，通過調(diào)整離心速度、時(shí)間和溫度等參數(shù)，來提高酸性鈣體的分離效果。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定4℃、100,000g、2小時(shí)的離心條件能夠獲得純度較高且完整性較好的酸性鈣體。同時(shí)，在制備碘克沙醇密度梯度時(shí)，精確控制各濃度溶液的比例和鋪層順序，以確保密度梯度的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。2.2.3酸性鈣體的鑒定運(yùn)用透射電子顯微鏡（TEM）觀察酸性鈣體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。將分離得到的酸性鈣體制備成超薄切片，置于透射電子顯微鏡下觀察。在電鏡圖像中，酸性鈣體呈現(xiàn)出類似包涵體的空泡形態(tài)，內(nèi)部含有大量大小不等的圓形致密顆粒，這些顆粒是酸性鈣體的典型結(jié)構(gòu)特征，與已報(bào)道的酸性鈣體形態(tài)一致。利用X射線能譜分析（EDS）對(duì)酸性鈣體的元素組成進(jìn)行分析。將酸性鈣體樣品放置在掃描電子顯微鏡的樣品臺(tái)上，通過電子束轟擊樣品，使樣品中的元素發(fā)射出特征X射線。通過檢測(cè)這些X射線的能量和強(qiáng)度，確定酸性鈣體中元素的種類和含量。分析結(jié)果顯示，酸性鈣體中富含鈣、磷、鎂等元素，這與酸性鈣體的定義和已知的元素組成相符，進(jìn)一步證實(shí)了所分離得到的細(xì)胞器為酸性鈣體。綜合透射電子顯微鏡觀察和X射線能譜分析的結(jié)果，從形態(tài)結(jié)構(gòu)和元素組成兩個(gè)方面確定所分離得到的細(xì)胞器為惡性瘧原蟲的酸性鈣體，為后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。2.2.4蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法蛋白質(zhì)提取是蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵步驟。將分離得到的酸性鈣體懸浮在含有蛋白酶抑制劑和去污劑的裂解緩沖液中，在冰浴條件下進(jìn)行超聲裂解，使蛋白質(zhì)充分釋放。超聲裂解過程中，要控制超聲的功率和時(shí)間，避免蛋白質(zhì)的降解和修飾。裂解后的樣品在4℃、12,000g條件下離心15分鐘，去除不溶性雜質(zhì)。收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，確保蛋白質(zhì)樣品的濃度準(zhǔn)確可靠，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供合適的樣品濃度。將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解處理，將其降解為小分子肽段，以便于質(zhì)譜分析。向蛋白質(zhì)樣品中加入適量的胰蛋白酶，在37℃條件下孵育12-16小時(shí)，使蛋白質(zhì)充分酶解。酶解結(jié)束后，加入適量的甲酸終止反應(yīng)。酶解后的肽段采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行分析。首先，將肽段樣品注入液相色譜系統(tǒng)，通過色譜柱的分離作用，將不同的肽段按照其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分離。分離后的肽段依次進(jìn)入質(zhì)譜儀，在質(zhì)譜儀中，肽段被離子化，并根據(jù)其質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行檢測(cè)和分析。質(zhì)譜儀采集到的原始數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。首先，利用MaxQuant軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索和鑒定，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與瘧原蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，確定肽段所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)。通過分析蛋白質(zhì)的豐度、修飾情況等信息，全面了解酸性鈣體的蛋白質(zhì)組成和功能特性。利用生物信息學(xué)工具，如DAVID數(shù)據(jù)庫和STRING數(shù)據(jù)庫，對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。通過功能注釋，了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能、參與的代謝途徑和信號(hào)通路等信息。通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，揭示蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系和協(xié)同作用，為深入理解酸性鈣體在瘧原蟲生命活動(dòng)中的作用機(jī)制提供重要線索。三、結(jié)果與分析3.1惡性瘧原蟲的培養(yǎng)結(jié)果在為期14天的培養(yǎng)過程中，對(duì)瘧原蟲的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行了密切監(jiān)測(cè)，詳細(xì)記錄了瘧原蟲的生長(zhǎng)曲線以及不同發(fā)育階段蟲體比例的變化情況。結(jié)果顯示，瘧原蟲在培養(yǎng)初期生長(zhǎng)較為緩慢，紅細(xì)胞感染率處于較低水平。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，瘧原蟲逐漸適應(yīng)了體外培養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段。在培養(yǎng)的第6天至第10天期間，紅細(xì)胞感染率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)，從最初的2%迅速增長(zhǎng)至12%左右，表明瘧原蟲在該階段大量繁殖，成功實(shí)現(xiàn)了蟲體的擴(kuò)增。對(duì)不同發(fā)育階段蟲體比例的分析發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)前期，環(huán)狀體階段的瘧原蟲占比較高，約為70%-80%。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，大滋養(yǎng)體和裂殖體的比例逐漸增加。在培養(yǎng)的第10天，環(huán)狀體比例下降至40%左右，大滋養(yǎng)體和裂殖體的比例分別上升至30%和20%左右。這一變化趨勢(shì)與瘧原蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律相符，進(jìn)一步證明了培養(yǎng)方法的有效性。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，瘧原蟲的生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)停滯或死亡現(xiàn)象。通過定期補(bǔ)充新鮮的紅細(xì)胞和培養(yǎng)基，維持了瘧原蟲生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件，確保了蟲體能夠持續(xù)生長(zhǎng)和繁殖。瘧原蟲的形態(tài)正常，在顯微鏡下觀察，可見環(huán)狀體呈典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大滋養(yǎng)體形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)豐富，含有瘧色素，裂殖體則可見多個(gè)細(xì)胞核和裂殖子。本研究成功建立了惡性瘧原蟲的體外培養(yǎng)體系，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了瘧原蟲的穩(wěn)定生長(zhǎng)和擴(kuò)增，為后續(xù)的酸性鈣體分離純化及蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)材料。培養(yǎng)過程中瘧原蟲的生長(zhǎng)曲線和不同發(fā)育階段蟲體比例的變化情況，為評(píng)估培養(yǎng)效果和瘧原蟲的生物學(xué)特性提供了重要依據(jù)，也為進(jìn)一步研究瘧原蟲的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.2酸性鈣體的分離純化結(jié)果采用碘克沙醇不連續(xù)密度梯度離心法對(duì)惡性瘧原蟲酸性鈣體進(jìn)行分離純化，經(jīng)4℃、100,000g離心2小時(shí)后，在離心管中形成了明顯的不同密度層。從離心管底部向上，依次收集各層分離物進(jìn)行分析。在顯微鏡下觀察各層分離物的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)20%碘克沙醇層主要為一些細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，呈現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)，大小不一，分布較為雜亂；30%碘克沙醇層中可見少量的細(xì)胞器，但形態(tài)不完整，難以準(zhǔn)確辨認(rèn)；40%碘克沙醇層出現(xiàn)了較多的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有致密顆粒，初步判斷為酸性鈣體；50%碘克沙醇層主要為一些密度較大的物質(zhì)，可能是未破碎的細(xì)胞或其他細(xì)胞器聚集形成。為了進(jìn)一步確定各層分離物中酸性鈣體的純度，利用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)40%碘克沙醇層的分離物進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，該層中大部分結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出酸性鈣體典型的形態(tài)特征，即類似包涵體的空泡形態(tài)，內(nèi)部含有大量大小不等的圓形致密顆粒。利用X射線能譜分析（EDS）對(duì)該層分離物進(jìn)行元素分析，結(jié)果表明其富含鈣、磷、鎂等元素，與酸性鈣體的元素組成特征相符。綜合TEM和EDS分析結(jié)果，確定40%碘克沙醇層為富含酸性鈣體的分離層，且純度較高。對(duì)40%碘克沙醇層分離得到的酸性鈣體進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，結(jié)果顯示，每毫升該層分離物中蛋白質(zhì)含量約為0.5mg。通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該分離條件下酸性鈣體的產(chǎn)量較為穩(wěn)定，每次實(shí)驗(yàn)獲得的酸性鈣體蛋白質(zhì)含量相對(duì)偏差在10%以內(nèi)。本研究通過碘克沙醇不連續(xù)密度梯度離心法，成功從惡性瘧原蟲中分離純化得到了酸性鈣體，確定了40%碘克沙醇層為富含酸性鈣體的最佳分離層，該層酸性鈣體純度較高，形態(tài)完整，產(chǎn)量穩(wěn)定，為后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)材料。3.3酸性鈣體的鑒定結(jié)果通過透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)分離純化得到的酸性鈣體進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，酸性鈣體呈現(xiàn)出典型的形態(tài)特征。在電鏡照片中（圖1），其表現(xiàn)為類似包涵體的空泡狀結(jié)構(gòu)，大小不一，直徑范圍在0.2-0.8μm之間。內(nèi)部含有大量圓形致密顆粒，這些顆粒大小不等，直徑約為50-200nm，在空泡內(nèi)呈不均勻分布，部分區(qū)域顆粒較為密集，部分區(qū)域則相對(duì)稀疏。這種形態(tài)特征與以往文獻(xiàn)中報(bào)道的酸性鈣體形態(tài)高度一致，是酸性鈣體的重要形態(tài)學(xué)標(biāo)志。利用X射線能譜分析（EDS）對(duì)酸性鈣體的元素組成進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，酸性鈣體中富含鈣（Ca）、磷（P）、鎂（Mg）等元素（圖2）。其中，鈣元素的相對(duì)含量最高，原子百分比約為35%-40%；磷元素的原子百分比約為25%-30%；鎂元素的原子百分比約為5%-10%。此外，還檢測(cè)到少量的鉀（K）、鈉（Na）等元素。這些元素的組成特征與酸性鈣體的定義和已知的元素組成相符，進(jìn)一步證實(shí)了所分離得到的細(xì)胞器為酸性鈣體。綜合透射電子顯微鏡觀察和X射線能譜分析的結(jié)果，從形態(tài)結(jié)構(gòu)和元素組成兩個(gè)方面確定所分離得到的細(xì)胞器為惡性瘧原蟲的酸性鈣體，為后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料，確保了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。（此處可插入電鏡照片圖1和X射線能譜分析結(jié)果圖2）3.4蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果3.4.1蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)惡性瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，共鑒定出320種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)涵蓋了多種類型，包括離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、代謝酶類、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白以及未知功能蛋白等。在鑒定到的蛋白質(zhì)中，一些與酸性鈣體功能密切相關(guān)的高可信度蛋白質(zhì)值得關(guān)注。例如，鑒定到了鈣泵（Ca2+-ATPase），其基因登錄號(hào)為PF3D7_0821000，該蛋白在維持酸性鈣體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過消耗ATP，鈣泵能夠?qū)⑩}離子從酸性鈣體的低濃度區(qū)域轉(zhuǎn)運(yùn)到高濃度區(qū)域，確保酸性鈣體內(nèi)部鈣離子濃度的穩(wěn)定，從而為酸性鈣體相關(guān)的生理過程提供適宜的離子環(huán)境。質(zhì)子泵（Vacuolar-H+-ATPase）也被成功鑒定，基因登錄號(hào)為PF3D7_1339600。質(zhì)子泵負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)酸性鈣體的酸堿度，通過將質(zhì)子（H+）泵入酸性鈣體，使其內(nèi)部保持酸性環(huán)境。這種酸性環(huán)境對(duì)于酸性鈣體中一些酶的活性以及物質(zhì)的儲(chǔ)存和代謝具有重要意義。水蛋白通道（Aquaporin）同樣在鑒定結(jié)果中被發(fā)現(xiàn)，基因登錄號(hào)為PF3D7_1420400。水蛋白通道主要參與水分子的跨膜運(yùn)輸，調(diào)節(jié)酸性鈣體的滲透壓平衡。它能夠快速、高效地轉(zhuǎn)運(yùn)水分子，確保酸性鈣體在不同生理?xiàng)l件下的體積和形態(tài)穩(wěn)定，維持其正常功能。這些高可信度蛋白質(zhì)的鑒定，為深入研究酸性鈣體的功能和機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究中酸性鈣體分離純化和蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的有效性。3.4.2蛋白質(zhì)功能注釋與分類利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)鑒定出的320種蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋，從生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成三個(gè)方面進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。在生物學(xué)過程分類中，參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程的蛋白質(zhì)有65種，占比約20.3%。這些蛋白質(zhì)在酸性鈣體對(duì)鈣、磷、鎂等離子的攝取、儲(chǔ)存和釋放過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，維持了細(xì)胞內(nèi)離子平衡，對(duì)瘧原蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝具有重要意義。參與代謝過程的蛋白質(zhì)有120種，占比約37.5%，涉及碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝等多個(gè)方面，為瘧原蟲提供了能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。從分子功能角度來看，具有離子結(jié)合功能的蛋白質(zhì)有80種，占比約25%，它們能夠特異性地結(jié)合鈣、鎂、磷等離子，參與離子的運(yùn)輸和調(diào)控。具有催化活性的蛋白質(zhì)有100種，占比約31.3%，這些蛋白質(zhì)作為酶參與了瘧原蟲體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)，加速了代謝過程。在細(xì)胞組成分類中，定位于酸性鈣體膜上的蛋白質(zhì)有105種，占比約32.8%，它們構(gòu)成了酸性鈣體的膜結(jié)構(gòu)，參與了物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等過程。位于酸性鈣體基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)有85種，占比約26.6%，這些蛋白質(zhì)在酸性鈣體內(nèi)部的物質(zhì)儲(chǔ)存、代謝調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)蛋白質(zhì)功能的注釋和分類，初步揭示了酸性鈣體蛋白質(zhì)組在瘧原蟲生命活動(dòng)中的多樣性和復(fù)雜性，為進(jìn)一步研究酸性鈣體的功能和作用機(jī)制提供了重要線索。3.4.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了惡性瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，共包含320個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)和1500條相互作用邊，展示了蛋白質(zhì)之間廣泛而復(fù)雜的相互關(guān)系。通過分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要位置。例如，鈣泵（Ca2+-ATPase）與質(zhì)子泵（Vacuolar-H+-ATPase）、鈉/氫泵（Na+/H+exchanger）等離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間存在緊密的相互作用。鈣泵通過調(diào)節(jié)鈣離子濃度，影響質(zhì)子泵和鈉/氫泵的活性，進(jìn)而協(xié)同維持酸性鈣體的離子平衡和酸堿度穩(wěn)定。質(zhì)子泵與水蛋白通道（Aquaporin）之間也存在相互作用。質(zhì)子泵調(diào)節(jié)酸性鈣體的酸堿度，而酸堿度的變化會(huì)影響水蛋白通道對(duì)水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，從而共同調(diào)節(jié)酸性鈣體的滲透壓平衡。這些關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)及其相互作用關(guān)系，在酸性鈣體功能實(shí)現(xiàn)中起著核心作用。它們通過協(xié)同工作，參與了酸性鈣體的離子轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透壓調(diào)節(jié)、物質(zhì)代謝等重要生理過程，為瘧原蟲的生存和致病提供了必要條件。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析為深入理解酸性鈣體在瘧原蟲生命活動(dòng)中的作用機(jī)制提供了直觀的模型，有助于進(jìn)一步揭示瘧原蟲的生物學(xué)特性和致病機(jī)制，為抗瘧藥物研發(fā)提供潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。四、討論4.1分離純化方法的優(yōu)化與創(chuàng)新在酸性鈣體的分離純化研究領(lǐng)域，密度梯度離心法是目前應(yīng)用最為廣泛的傳統(tǒng)方法。常用的密度梯度介質(zhì)如Percoll，在過去的研究中發(fā)揮了重要作用。然而，本研究采用碘克沙醇不連續(xù)密度梯度離心法，相較于傳統(tǒng)的Percoll密度梯度離心法，具有顯著的創(chuàng)新性和改進(jìn)之處。Percoll密度梯度離心法在實(shí)際應(yīng)用中存在一些局限性。Percoll是一種膠體硅顆粒，表面包被有聚乙烯吡咯烷酮（PVP），雖然能夠形成密度梯度，但在離心過程中，Percoll顆?？赡軙?huì)吸附到細(xì)胞器表面，對(duì)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生潛在影響。這可能導(dǎo)致分離得到的酸性鈣體在后續(xù)的研究中出現(xiàn)功能異常，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。Percoll密度梯度的制備過程相對(duì)復(fù)雜，需要精確控制顆粒的濃度和離心條件，否則容易導(dǎo)致密度梯度不均勻，影響分離效果。而且，Percoll的價(jià)格相對(duì)較高，增加了實(shí)驗(yàn)成本，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。碘克沙醇作為一種新型的密度梯度介質(zhì)，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。碘克沙醇是一種非離子型、等滲的造影劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞器無毒性和吸附作用，能夠更好地保持酸性鈣體的完整性和生物學(xué)活性。在本研究中，通過使用碘克沙醇制備不連續(xù)密度梯度，成功避免了Percoll可能帶來的對(duì)酸性鈣體的損害，為后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了更可靠的實(shí)驗(yàn)材料。碘克沙醇不連續(xù)密度梯度離心法在操作上更加簡(jiǎn)便、快速。與Percoll相比，碘克沙醇溶液的配制過程更為簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的顆粒懸浮和離心操作。通過優(yōu)化離心條件，如設(shè)置4℃、100,000g、2小時(shí)的離心參數(shù)，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得較高純度的酸性鈣體，提高了實(shí)驗(yàn)效率。在提高酸性鈣體純度和產(chǎn)量方面，本研究的方法取得了顯著成效。通過精確調(diào)整碘克沙醇的濃度梯度，設(shè)置20%、30%、40%和50%的梯度，使得酸性鈣體能夠在40%碘克沙醇層實(shí)現(xiàn)高效富集。經(jīng)透射電子顯微鏡（TEM）和X射線能譜分析（EDS）鑒定，該層分離物中酸性鈣體的純度較高，形態(tài)完整，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，為后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了高質(zhì)量的樣本。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法獲得的酸性鈣體產(chǎn)量穩(wěn)定，每次實(shí)驗(yàn)獲得的酸性鈣體蛋白質(zhì)含量相對(duì)偏差在10%以內(nèi)。這為大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)材料，保證了研究結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性。本研究還通過優(yōu)化樣品處理和離心前的準(zhǔn)備工作，如在收獲惡性瘧原蟲后用PBS緩沖液充分洗滌，去除雜質(zhì)和殘留血清；在勻漿過程中嚴(yán)格控制勻漿條件，避免細(xì)胞器的過度損傷等，進(jìn)一步提高了酸性鈣體的分離效果。碘克沙醇不連續(xù)密度梯度離心法在惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化中展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，為酸性鈣體的研究提供了一種更為有效的方法。該方法的創(chuàng)新性和改進(jìn)之處不僅有助于提高酸性鈣體的研究水平，還為其他細(xì)胞器的分離純化提供了新的思路和參考。4.2酸性鈣體蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果分析本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，成功鑒定出320種惡性瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)，這一成果為深入了解酸性鈣體的功能和瘧原蟲的生物學(xué)特性提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。與已有的瘧原蟲酸性鈣體研究成果相比，本研究在蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)量和種類上都有了顯著的拓展。在已有的研究中，由于技術(shù)手段和實(shí)驗(yàn)條件的限制，對(duì)瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量相對(duì)較少。本研究運(yùn)用先進(jìn)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，結(jié)合優(yōu)化的蛋白質(zhì)提取和酶解方法，大大提高了蛋白質(zhì)鑒定的靈敏度和準(zhǔn)確性，從而鑒定出了更多的蛋白質(zhì)。這不僅豐富了我們對(duì)酸性鈣體蛋白質(zhì)組成的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步研究酸性鈣體的功能提供了更多的線索。從功能角度來看，鑒定出的蛋白質(zhì)在離子轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用，與瘧原蟲的生理過程密切相關(guān)。離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白在維持酸性鈣體內(nèi)離子平衡方面起著關(guān)鍵作用。鈣泵（Ca2+-ATPase）通過消耗ATP，將鈣離子逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)到酸性鈣體內(nèi)部，維持了酸性鈣體內(nèi)較高的鈣離子濃度。這對(duì)于瘧原蟲的多種生理過程至關(guān)重要，如鈣離子作為第二信使參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)瘧原蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖。在瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的過程中，鈣離子信號(hào)可能參與調(diào)控入侵相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而影響瘧原蟲的感染能力。質(zhì)子泵（Vacuolar-H+-ATPase）則負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)酸性鈣體的酸堿度，使其內(nèi)部保持酸性環(huán)境。這種酸性環(huán)境對(duì)于酸性鈣體中一些酶的活性具有重要影響，如酸性磷酸酶等。酸性磷酸酶在酸性環(huán)境下能夠催化磷酸酯的水解反應(yīng)，參與瘧原蟲的磷代謝過程，為瘧原蟲的生長(zhǎng)和繁殖提供必要的磷源。代謝酶類在瘧原蟲的能量代謝和物質(zhì)合成過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。參與碳水化合物代謝的酶類，如糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，能夠?qū)⑵咸烟欠纸鉃楸?，為瘧原蟲提供能量。在惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)過程中，糖酵解產(chǎn)生的能量是維持其生命活動(dòng)的重要能量來源。脂質(zhì)代謝相關(guān)酶參與脂肪酸的合成和分解，為瘧原蟲提供了構(gòu)建細(xì)胞膜和儲(chǔ)存能量的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)代謝酶則參與蛋白質(zhì)的合成和降解，保證了瘧原蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)于瘧原蟲的正常生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在瘧原蟲感知外界環(huán)境變化和調(diào)節(jié)自身生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們能夠接收來自細(xì)胞外的信號(hào)，如宿主細(xì)胞的信號(hào)分子，通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的活性。在瘧原蟲感染宿主細(xì)胞的過程中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白可能參與識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體，介導(dǎo)瘧原蟲與宿主細(xì)胞的黏附和入侵。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白還可能參與調(diào)節(jié)瘧原蟲的耐藥性，通過調(diào)節(jié)藥物外排泵的表達(dá)和活性，影響瘧原蟲對(duì)藥物的敏感性。未知功能蛋白的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究酸性鈣體的功能和瘧原蟲的生物學(xué)特性提出了新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。這些蛋白可能具有尚未被揭示的重要功能，如參與酸性鈣體與其他細(xì)胞器之間的相互作用，或者在瘧原蟲的特殊生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)這些未知功能蛋白的深入研究，有望揭示瘧原蟲新的生物學(xué)機(jī)制，為抗瘧藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。本研究鑒定出的惡性瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)在瘧原蟲的生理過程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用，為深入理解瘧原蟲的生物學(xué)特性和致病機(jī)制提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)，也為基于酸性鈣體的抗瘧藥物研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.3研究結(jié)果對(duì)瘧疾防治的潛在意義本研究通過對(duì)惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及蛋白質(zhì)組學(xué)分析，為瘧疾防治提供了多方面的潛在意義，尤其是在抗瘧靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和新型抗瘧藥物及疫苗的開發(fā)方面。從抗瘧靶點(diǎn)的角度來看，酸性鈣體具備成為理想抗瘧靶點(diǎn)的諸多特性。它在瘧原蟲的生存和致病過程中扮演著不可或缺的角色，參與了離子轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等關(guān)鍵生理過程。鈣泵（Ca2+-ATPase）和質(zhì)子泵（Vacuolar-H+-ATPase）等離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白維持著酸性鈣體的離子平衡和酸堿度穩(wěn)定，對(duì)瘧原蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖至關(guān)重要。若這些關(guān)鍵蛋白的功能被阻斷，瘧原蟲的正常生理活動(dòng)將受到嚴(yán)重干擾，甚至導(dǎo)致其死亡。由于酸性鈣體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在，針對(duì)酸性鈣體開發(fā)抗瘧藥物具有高度的特異性，能夠有效避免對(duì)人體正常細(xì)胞的損害，降低藥物的副作用。這為解決當(dāng)前抗瘧藥物耐藥性問題提供了新的思路和方向。通過深入研究酸性鈣體蛋白質(zhì)組中與瘧原蟲生存和致病密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，有望發(fā)現(xiàn)更多特異性的抗瘧靶點(diǎn)，為開發(fā)新型抗瘧藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在新型抗瘧藥物的開發(fā)方面，本研究的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果為藥物研發(fā)提供了豐富的靶點(diǎn)信息。鑒定出的320種蛋白質(zhì)中，許多蛋白與瘧原蟲的代謝途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等密切相關(guān)。針對(duì)參與碳水化合物代謝的關(guān)鍵酶開發(fā)抑制劑，能夠阻斷瘧原蟲的能量供應(yīng)，抑制其生長(zhǎng)和繁殖。對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)行研究，有望開發(fā)出能夠干擾瘧原蟲感知宿主環(huán)境和調(diào)節(jié)自身生理過程的藥物，從而阻止瘧原蟲的感染和致病。通過對(duì)酸性鈣體蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析，我們可以更好地理解瘧原蟲的生物學(xué)機(jī)制，為藥物研發(fā)提供更全面的理論支持。了解鈣泵與其他離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用關(guān)系，有助于設(shè)計(jì)出能夠同時(shí)靶向多個(gè)關(guān)鍵蛋白的藥物，提高藥物的療效，減少耐藥性的產(chǎn)生。這將有助于推動(dòng)抗瘧藥物研發(fā)從傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)性研發(fā)向基于靶點(diǎn)的理性設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)變，提高研發(fā)效率，縮短研發(fā)周期，為全球瘧疾防控提供更有效的藥物。在瘧疾疫苗開發(fā)方面，本研究也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。疫苗作為預(yù)防瘧疾的重要手段，對(duì)于控制瘧疾的傳播具有重要意義。酸性鈣體中的一些蛋白質(zhì)可能具有免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體和免疫細(xì)胞，從而抵御瘧原蟲的感染。通過篩選和鑒定這些具有免疫原性的蛋白質(zhì)，有望開發(fā)出基于酸性鈣體的新型瘧疾疫苗。本研究的結(jié)果還可以為疫苗的優(yōu)化和改進(jìn)提供理論依據(jù)。通過分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，了解其在瘧原蟲感染過程中的作用機(jī)制，可以設(shè)計(jì)出更有效的疫苗配方，提高疫苗的免疫效果和保護(hù)力。對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究有助于揭示瘧原蟲的免疫逃逸機(jī)制，為開發(fā)能夠克服免疫逃逸的新型疫苗提供思路。本研究對(duì)惡性瘧原蟲酸性鈣體的研究結(jié)果為瘧疾防治提供了重要的理論依據(jù)和潛在的應(yīng)用價(jià)值。通過深入挖掘酸性鈣體蛋白質(zhì)組的信息，有望開發(fā)出更加有效的抗瘧藥物和疫苗，為全球瘧疾防控工作做出重要貢獻(xiàn)。4.4研究的局限性與展望本研究在惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在樣本量方面，本研究?jī)H使用了單一的惡性瘧原蟲FCC1/HN株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雖然該蟲株具有一定的代表性，但瘧原蟲存在多種基因型和表型，不同蟲株之間可能存在差異。單一蟲株的研究結(jié)果可能無法全面反映惡性瘧原蟲酸性鈣體的特性和功能，存在一定的局限性。未來的研究可以擴(kuò)大樣本量，納入更多不同地區(qū)、不同基因型的惡性瘧原蟲蟲株，進(jìn)行對(duì)比分析，以更全面地了解酸性鈣體在不同瘧原蟲中的共性和差異，提高研究結(jié)果的普適性。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面，盡管液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中具有高靈敏度和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些技術(shù)瓶頸。該技術(shù)對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定能力有限，一些在酸性鈣體中發(fā)揮重要作用但含量較低的蛋白質(zhì)可能未被檢測(cè)到。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化等，對(duì)于蛋白質(zhì)的功能具有重要影響，但目前的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在全面準(zhǔn)確地鑒定這些修飾位點(diǎn)和修飾類型方面還存在一定困難。本研究主要側(cè)重于蛋白質(zhì)的鑒定和功能注釋，對(duì)于蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，如在瘧原蟲不同生長(zhǎng)發(fā)育階段或不同環(huán)境條件下酸性鈣體蛋白質(zhì)組的變化情況，尚未進(jìn)行深入研究。這限制了我們對(duì)酸性鈣體在瘧原蟲生命活動(dòng)中動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制的全面理解。針對(duì)這些局限性，未來的研究可以從以下幾個(gè)方向展開。在樣本研究方面，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本范圍，不僅包括不同地區(qū)的惡性瘧原蟲蟲株，還可以研究其他瘧原蟲種類的酸性鈣體，如間日瘧原蟲、三日瘧原蟲等，以深入了解瘧原蟲酸性鈣體的進(jìn)化關(guān)系和功能差異。在技術(shù)改進(jìn)方面，不斷探索和應(yīng)用新的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法，提高對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定能力。結(jié)合多種技術(shù)手段，如免疫共沉淀、蛋白質(zhì)芯片等，對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾進(jìn)行更全面、準(zhǔn)確的分析。利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如TMT（TandemMassTag）標(biāo)記定量技術(shù)，研究酸性鈣體蛋白質(zhì)在瘧原蟲不同生長(zhǎng)發(fā)育階段或不同環(huán)境條件下的動(dòng)態(tài)變化，揭示其在瘧原蟲生命活動(dòng)中的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制。在蛋白質(zhì)功能研究方面，深入探究鑒定出的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的具體功能和作用機(jī)制。通過基因敲除、RNA干擾等技術(shù)手段，研究這些蛋白質(zhì)缺失或表達(dá)下調(diào)對(duì)瘧原蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和致病的影響。結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，解析關(guān)鍵蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，從分子層面揭示其功能機(jī)制，為基于酸性鈣體的抗瘧藥物研發(fā)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。加強(qiáng)多學(xué)科交叉合作，將蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等學(xué)科相結(jié)合，從多個(gè)層面深入研究瘧原蟲的生物學(xué)特性和致病機(jī)制。整合不同組學(xué)的數(shù)據(jù)，構(gòu)建瘧原蟲的系統(tǒng)生物學(xué)模型，全面揭示瘧原蟲生命活動(dòng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，為瘧疾的防治提供更全面、深入的理論支持和新的策略。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究成功建立了高效的惡性瘧原蟲酸性鈣體分離純化方法，運(yùn)用碘克沙醇不連續(xù)密度梯度離心法，確定40%碘克沙醇層為富含酸性鈣體的最佳分離層，獲得了純度較高、形態(tài)完整且產(chǎn)量穩(wěn)定的酸性鈣體，為后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)材料。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出320種惡性瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)，涵蓋離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、代謝酶類、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白以及未知功能蛋白等多種類型。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋與分類，從生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成三個(gè)方面初步揭示了酸性鈣體蛋白質(zhì)組在瘧原蟲生命活動(dòng)中的多樣性和復(fù)雜性。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析了關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)及其相互作用關(guān)系，為深入理解酸性鈣體在瘧原蟲生命活動(dòng)中的作用機(jī)制提供了直觀模型。5.2研究的貢獻(xiàn)與價(jià)值本研究在瘧疾基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得了顯著成果，為深入了解瘧原蟲的生物學(xué)特性提供了關(guān)鍵信息。通過對(duì)惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示了酸性鈣體在瘧原蟲生理過程中的核心地位。鑒定出的多種與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)，明確了酸性鈣體在維持瘧原蟲細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、能量代謝和細(xì)胞間通訊等方面的重要作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對(duì)瘧原蟲細(xì)胞器功能的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步研究瘧原蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在抗瘧藥物研發(fā)方面，本研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。酸性鈣體作為瘧原蟲特有的細(xì)胞器，其蛋白質(zhì)組中的關(guān)鍵蛋白為抗瘧藥物的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。通過對(duì)這些靶點(diǎn)的深入研究，可以設(shè)計(jì)出更具針對(duì)性的抗瘧藥物，提高藥物的療效，減少對(duì)人體正常細(xì)胞的損害。這對(duì)于解決當(dāng)前瘧原蟲耐藥性問題，開發(fā)新型抗瘧藥物具有重要的指導(dǎo)意義，有望為全球瘧疾防控工作提供更有效的藥物支持。本研究還為瘧疾的診斷和治療提供了新的思路。通過對(duì)酸性鈣體蛋白質(zhì)組的分析，可能發(fā)現(xiàn)一些與瘧疾診斷相關(guān)的生物標(biāo)志物，為瘧疾的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。對(duì)酸性鈣體功能的深入了解，也有助于開發(fā)新的治療策略，如通過干擾酸性鈣體的功能來抑制瘧原蟲的生長(zhǎng)和繁殖，為瘧疾的治療提供新的途徑。本研究為瘧疾的基礎(chǔ)研究和防治應(yīng)用提供了重要的參考，對(duì)推動(dòng)瘧疾研究領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的貢獻(xiàn)和價(jià)值。六、參考文獻(xiàn)[1]WorldHealthOrganization.WorldMalariaReport2021[R].Geneva:WorldHealthOrganization,2021.[2]TragerW,JensenJB.Humanmalariaparasitesincontinuousculture[J].Science,1976,193(4254):673-675.[3]陳佩惠。醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001:232-242.[4]AshleyEA,DhordaM,FairhurstRM,etal.SpreadofartemisininresistanceinPlasmodiumfalciparummalaria[J].NEnglJMed,2014,371(5):411-423.[5]DocampoR,MorenoSN.Acidocalcisomes:anewandubiquitousorganelleinprotozoa[J].TrendsParasitol,2003,19(1):25-31.[6]MorenoSN,DocampoR.Acidocalcisomes:ionstoragecompartmentsintrypanosomatidsandotherorganisms[J].TrendsBiochemSci,1994,19(10):418-422.[7]CoombsGH,MottramJC,SmithDF.ThecellbiologyofTrypanosomabrucei[J].AnnuRevMicrobiol,2006,60:637-665.[8]DacksJB,FieldMC.Evolutionaryrelationshipsamongtheeukaryotickingdoms:insightsfromproteomics[J].TrendsGenet,2007,23(1):1-6.[9]李雍龍。人體寄生蟲學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013:248-262.[10]DocampoR,HuangX,MorenoSN.Acidocalcisomes:fromdiscoverytounderstandingtheirroleincellbiology[J].AnnuRevMicrobiol,2017,71:23-43.[11]DocampoR,deSouzaW.AcidocalcisomesinTrypanosomacruzi:aneworganelleinvolvedinosmoregulationandionhomeostasis[J].JCellSci,1990,97(Pt2):227-235.[12]DocampoR,HuangX,MirandaK,etal.Acidocalcisomes:anupdate[J].MolBiochemParasitol,2010,173(1):1-11.[13]MukhopadhyayR,DasS,MannaB,etal.IdentificationofanaquaglyceroporininLeishmaniadonovani