慢性應(yīng)激下大鼠海馬自噬的偏側(cè)化現(xiàn)象及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景應(yīng)激是機(jī)體在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會(huì)、心理因素刺激時(shí)所產(chǎn)生的非特異性適應(yīng)反應(yīng)，這種反應(yīng)廣泛存在于人類與動(dòng)物的生活之中。從進(jìn)化角度看，應(yīng)激反應(yīng)是生物體為了應(yīng)對(duì)環(huán)境變化而逐漸形成的一種適應(yīng)性機(jī)制。當(dāng)機(jī)體遭遇諸如捕食者威脅、食物短缺、環(huán)境劇變等生存挑戰(zhàn)時(shí)，應(yīng)激反應(yīng)能夠迅速調(diào)動(dòng)身體的各項(xiàng)資源，使其處于高度警覺(jué)和準(zhǔn)備狀態(tài)，從而增強(qiáng)生存幾率。例如，在野外，當(dāng)一只羚羊察覺(jué)到獅子的靠近時(shí)，它的身體會(huì)立刻進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)，心跳加速、血壓升高、血糖水平上升，這些生理變化為它的逃跑提供了充足的能量和敏捷的反應(yīng)能力。然而，在現(xiàn)代社會(huì)中，人類面臨的應(yīng)激源更為復(fù)雜多樣，且持續(xù)時(shí)間往往較長(zhǎng)，如長(zhǎng)期的工作壓力、人際關(guān)系緊張、經(jīng)濟(jì)困境等。這些慢性應(yīng)激因素不再像傳統(tǒng)應(yīng)激源那樣具有明確的威脅和應(yīng)對(duì)方式，卻同樣會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。大量研究表明，慢性應(yīng)激時(shí)機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡，會(huì)引發(fā)神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)生化等一系列改變，進(jìn)而導(dǎo)致器官功能甚至結(jié)構(gòu)的改變。在神經(jīng)內(nèi)分泌方面，慢性應(yīng)激會(huì)使下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（HPA）軸持續(xù)激活，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素（GC）的大量分泌。長(zhǎng)期處于高糖皮質(zhì)激素水平會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，使機(jī)體免疫力下降，容易受到各種病原體的侵襲。同時(shí)，慢性應(yīng)激還會(huì)引起神經(jīng)生化方面的改變，如神經(jīng)遞質(zhì)失衡，影響大腦的正常功能。海馬作為大腦中與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知、行為和情緒密切相關(guān)的重要腦區(qū)，在應(yīng)激過(guò)程中極易受損。這主要是因?yàn)楹ｑR富含糖皮質(zhì)激素受體，對(duì)糖皮質(zhì)激素的變化極為敏感。當(dāng)機(jī)體處于慢性應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，大量分泌的糖皮質(zhì)激素會(huì)與海馬中的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，引發(fā)一系列的生理和病理變化。研究顯示，慢性應(yīng)激能夠減少或抑制大鼠海馬CA1、CA3區(qū)和齒狀回細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少齒狀回的神經(jīng)生發(fā)，從而導(dǎo)致海馬體積縮小。例如，對(duì)長(zhǎng)期處于束縛應(yīng)激的大鼠進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，其海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，樹(shù)突的長(zhǎng)度以及分枝數(shù)目明顯減少，而底樹(shù)突、海馬CA1、CA2和齒狀回顆粒細(xì)胞也受到不同程度的影響。慢性應(yīng)激還會(huì)導(dǎo)致海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞頂樹(shù)突明顯縮短，數(shù)目顯著減少，在電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞固縮、核膜皺縮、線粒體嵴模糊，還可見(jiàn)空泡樣變性、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊不清等改變。這些結(jié)構(gòu)上的損傷進(jìn)一步影響了海馬的功能。海馬的功能對(duì)于生物的生存和適應(yīng)至關(guān)重要。它調(diào)節(jié)生物的學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知功能，適度的應(yīng)激有利于記憶和學(xué)習(xí)，能夠幫助生物體更好地應(yīng)對(duì)類似的環(huán)境挑戰(zhàn)。例如，在學(xué)習(xí)新知識(shí)的過(guò)程中，適度的壓力可以提高注意力和學(xué)習(xí)效率。而當(dāng)應(yīng)激過(guò)度或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，就會(huì)對(duì)記憶和學(xué)習(xí)產(chǎn)生負(fù)面影響。研究證實(shí)，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠定位航行和空間搜索得分降低，證明大鼠在慢性應(yīng)激后空間學(xué)習(xí)和記憶能力降低。4周的強(qiáng)迫游泳明顯減弱了大鼠記憶保留實(shí)驗(yàn)成績(jī)，提示慢性應(yīng)激損傷了大鼠長(zhǎng)時(shí)記憶的存儲(chǔ)。慢性應(yīng)激時(shí)，海馬CA1區(qū)和齒狀回的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)（LTP）誘發(fā)受抑制，而LTP效應(yīng)是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，也是衡量海馬神經(jīng)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)。這表明慢性應(yīng)激會(huì)破壞海馬的神經(jīng)突觸可塑性，進(jìn)而損害學(xué)習(xí)記憶能力。值得注意的是，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激對(duì)海馬的影響存在偏側(cè)化現(xiàn)象。大腦兩半球在結(jié)構(gòu)和功能上并非完全對(duì)稱，這種不對(duì)稱性在海馬中也有所體現(xiàn)。在對(duì)慢性應(yīng)激大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，且右側(cè)CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著小于左側(cè)；同時(shí)，模型組大鼠右側(cè)海馬功能蛋白Gap-43蛋白表達(dá)上調(diào)，左側(cè)海馬無(wú)顯著變化。這提示慢性應(yīng)激可能對(duì)大鼠右側(cè)海馬存在特異性損傷。然而，目前關(guān)于慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬影響的偏側(cè)化研究還相對(duì)較少，且不同應(yīng)激源對(duì)海馬自噬造成的影響以及是否具有左右腦差異也尚未得到深入探討。自噬作為細(xì)胞內(nèi)的一種重要自我調(diào)節(jié)機(jī)制，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、清除受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠海馬自噬并探討其偏側(cè)化現(xiàn)象，不僅有助于揭示慢性應(yīng)激損傷海馬的內(nèi)在機(jī)制，還可能為相關(guān)神經(jīng)精神疾病的防治提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠海馬自噬并具有偏側(cè)化這一現(xiàn)象背后的規(guī)律與機(jī)制。通過(guò)建立慢性心理應(yīng)激和慢性疼痛應(yīng)激兩種大鼠模型，從多維度進(jìn)行探究。具體而言，一是明確兩種應(yīng)激模型是否會(huì)導(dǎo)致大鼠行為發(fā)生改變，通過(guò)體重測(cè)量、糖水偏好測(cè)試以及痛敏測(cè)試等方法，全面評(píng)估應(yīng)激對(duì)大鼠生理和心理行為的影響，為后續(xù)研究提供行為學(xué)依據(jù)。二是重點(diǎn)考察在兩種應(yīng)激模型作用下，大鼠左右海馬自噬信號(hào)是否會(huì)發(fā)生改變，利用透射電鏡觀察自噬體的形成，采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白（LC3-Ⅱ，p62）以及磷酸化mTOR信號(hào)蛋白（p-mTOR）的表達(dá)水平，從分子層面揭示自噬信號(hào)的變化規(guī)律。三是探究自噬水平是否存在左右腦不對(duì)稱性改變以及激活的信號(hào)通路，深入剖析慢性應(yīng)激與海馬自噬偏側(cè)化之間的內(nèi)在聯(lián)系，為理解大腦在慢性應(yīng)激下的自我調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的視角。這一研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，有助于深化我們對(duì)大腦功能偏側(cè)化以及慢性應(yīng)激損傷海馬機(jī)制的理解。大腦左右半球在功能和結(jié)構(gòu)上的不對(duì)稱性是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向，而慢性應(yīng)激對(duì)海馬的影響一直是研究熱點(diǎn)。本研究將兩者結(jié)合，探討慢性應(yīng)激誘發(fā)海馬自噬的偏側(cè)化現(xiàn)象，有望豐富和完善神經(jīng)科學(xué)的相關(guān)理論體系，為進(jìn)一步研究大腦在應(yīng)激狀態(tài)下的生理和病理變化提供新的思路和理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，為相關(guān)神經(jīng)精神疾病的防治提供新的靶點(diǎn)和理論支持。許多神經(jīng)精神疾病，如抑郁癥、焦慮癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等，都與慢性應(yīng)激密切相關(guān)。深入了解慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬的偏側(cè)化影響，有助于揭示這些疾病的發(fā)病機(jī)制，從而為開(kāi)發(fā)更有效的診斷方法和治療策略提供理論基礎(chǔ)。例如，通過(guò)針對(duì)海馬自噬偏側(cè)化的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，可能為這些疾病的治療開(kāi)辟新的途徑，提高治療效果，改善患者的生活質(zhì)量。此外，本研究結(jié)果還可能為預(yù)防慢性應(yīng)激相關(guān)疾病提供指導(dǎo)，如通過(guò)早期監(jiān)測(cè)和干預(yù)海馬自噬的偏側(cè)化變化，降低疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)本研究在慢性應(yīng)激與海馬自噬偏側(cè)化領(lǐng)域具有多方面的創(chuàng)新探索。以往研究多集中于單一應(yīng)激源對(duì)海馬的影響，而本研究創(chuàng)新性地對(duì)比了慢性心理應(yīng)激和慢性疼痛應(yīng)激兩種不同應(yīng)激源對(duì)大鼠海馬自噬的作用。這種多應(yīng)激源的對(duì)比研究，能夠更全面地揭示慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬影響的多樣性和復(fù)雜性，為深入理解應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供更豐富的視角。例如，不同應(yīng)激源可能通過(guò)不同的神經(jīng)內(nèi)分泌途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響海馬自噬，通過(guò)對(duì)比研究可以明確這些差異，為精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。在研究?jī)?nèi)容上，本研究從行為學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)等多個(gè)層面深入分析大鼠海馬自噬的偏側(cè)化現(xiàn)象。不僅關(guān)注慢性應(yīng)激對(duì)大鼠體重、糖水偏好、痛敏等行為學(xué)指標(biāo)的影響，還利用透射電鏡觀察海馬自噬體的形成，從細(xì)胞學(xué)層面直觀呈現(xiàn)自噬變化，同時(shí)通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白和磷酸化mTOR信號(hào)蛋白的表達(dá)水平，從分子生物學(xué)角度深入探究自噬的調(diào)控機(jī)制。這種多層面的綜合研究方法，能夠更系統(tǒng)、深入地揭示慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠海馬自噬偏側(cè)化的內(nèi)在規(guī)律，彌補(bǔ)了以往研究?jī)H從單一層面進(jìn)行分析的不足。本研究將大腦功能偏側(cè)化這一新視角與自噬研究相結(jié)合，運(yùn)用先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如蛋白免疫印跡、透射電鏡等，為該領(lǐng)域的研究提供了新的思路和方法。大腦功能偏側(cè)化是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向，而自噬在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，將兩者結(jié)合研究慢性應(yīng)激對(duì)海馬的影響，有望拓展我們對(duì)大腦應(yīng)激損傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)。先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)和分析相關(guān)指標(biāo)，提高研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性，為后續(xù)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。二、文獻(xiàn)綜述2.1應(yīng)激與神經(jīng)元自噬2.1.1應(yīng)激的概念與分類應(yīng)激這一概念最早由加拿大生理學(xué)家HansSelye于1936年提出，他將其定義為機(jī)體在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)所產(chǎn)生的非特異性適應(yīng)反應(yīng)。從本質(zhì)上講，應(yīng)激是機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而做出的一種自我調(diào)節(jié)反應(yīng)。這種反應(yīng)涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜交互作用。當(dāng)機(jī)體感知到應(yīng)激源時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)迅速做出反應(yīng)，通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來(lái)調(diào)節(jié)身體各器官的功能。同時(shí)，內(nèi)分泌系統(tǒng)也會(huì)被激活，釋放各種激素，如糖皮質(zhì)激素、腎上腺素等，以應(yīng)對(duì)應(yīng)激狀態(tài)。免疫系統(tǒng)也會(huì)受到影響，其功能可能會(huì)增強(qiáng)或抑制，取決于應(yīng)激的類型和強(qiáng)度。應(yīng)激源的種類繁多，根據(jù)其性質(zhì)可分為物理應(yīng)激源、化學(xué)應(yīng)激源、生物應(yīng)激源和心理應(yīng)激源四大類。物理應(yīng)激源是指那些能夠?qū)C(jī)體造成物理性損傷或干擾的因素，如高溫、低溫、輻射、噪聲、電擊等。當(dāng)機(jī)體暴露在高溫環(huán)境中時(shí)，會(huì)通過(guò)出汗等方式來(lái)散熱，以維持體溫的穩(wěn)定。而如果高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或強(qiáng)度過(guò)大，就可能導(dǎo)致中暑等生理病理變化?；瘜W(xué)應(yīng)激源則是指各種化學(xué)物質(zhì)，如藥物、毒物、重金屬、酸堿等。這些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可能會(huì)干擾細(xì)胞的正常代謝過(guò)程，影響酶的活性，從而對(duì)機(jī)體造成損害。例如，鉛、汞等重金屬中毒會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的功能。生物應(yīng)激源主要包括各種病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等，以及生物體內(nèi)產(chǎn)生的抗原物質(zhì)等。當(dāng)病原體侵入機(jī)體時(shí)，免疫系統(tǒng)會(huì)被激活，產(chǎn)生免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗病原體。然而，如果免疫反應(yīng)過(guò)度或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也可能對(duì)機(jī)體自身組織造成損傷。心理應(yīng)激源是指那些能夠引起個(gè)體心理緊張和壓力的因素，如生活事件、工作壓力、人際關(guān)系緊張、情緒波動(dòng)等。長(zhǎng)期處于心理應(yīng)激狀態(tài)下，會(huì)導(dǎo)致心理和生理上的一系列問(wèn)題，如焦慮、抑郁、失眠、高血壓等。不同類型的應(yīng)激源對(duì)機(jī)體的影響方式和程度各不相同。物理應(yīng)激源往往直接作用于機(jī)體的組織和器官，導(dǎo)致物理性損傷?；瘜W(xué)應(yīng)激源則通過(guò)化學(xué)反應(yīng)對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生毒性作用。生物應(yīng)激源引發(fā)的免疫反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致炎癥等病理過(guò)程。心理應(yīng)激源主要通過(guò)影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和心理狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的生理功能產(chǎn)生間接影響。在實(shí)際生活中，機(jī)體往往會(huì)同時(shí)受到多種應(yīng)激源的作用，這些應(yīng)激源之間可能會(huì)相互影響，產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應(yīng)，進(jìn)一步增加了應(yīng)激反應(yīng)的復(fù)雜性。2.1.2神經(jīng)元自噬的過(guò)程與功能神經(jīng)元自噬是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的自我降解過(guò)程，對(duì)于維持神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)和正常功能至關(guān)重要。自噬過(guò)程主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：?jiǎn)?dòng)、自噬體形成以及與溶酶體融合。當(dāng)神經(jīng)元受到諸如營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、細(xì)胞器損傷等刺激時(shí)，自噬被啟動(dòng)。在這個(gè)過(guò)程中，一系列自噬相關(guān)蛋白（ATG）被激活，它們共同協(xié)作，促使自噬體的形成。首先，ULK1（Unc-51樣激酶1）復(fù)合物被激活，它由ULK1、ATG13、FIP200等組成。在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白）會(huì)抑制ULK1復(fù)合物的活性。而當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，mTOR的活性受到抑制，從而解除對(duì)ULK1復(fù)合物的抑制，使其被激活。激活后的ULK1復(fù)合物會(huì)磷酸化下游的蛋白，啟動(dòng)自噬體的形成過(guò)程。自噬體的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)蛋白復(fù)合物的參與。其中，Beclin1-Vps34復(fù)合物發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Beclin1與Vps34（Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶）結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）。PI3P在自噬體膜的形成和擴(kuò)展中起到重要作用，它可以招募其他自噬相關(guān)蛋白到自噬體形成位點(diǎn)。Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合物也參與了自噬體的形成。Atg5與Atg12通過(guò)共價(jià)結(jié)合形成Atg5-Atg12復(fù)合物，然后該復(fù)合物與Atg16L1結(jié)合，形成Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物在自噬體膜的延伸過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它可以促進(jìn)自噬體膜的彎曲和閉合，最終形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。自噬體形成后，會(huì)與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。在這個(gè)過(guò)程中，自噬體膜上的特定蛋白與溶酶體膜上的蛋白相互識(shí)別和結(jié)合，促使兩者融合。溶酶體內(nèi)含有多種酸性水解酶，當(dāng)自噬溶酶體形成后，這些水解酶會(huì)被釋放出來(lái)，對(duì)自噬體內(nèi)的內(nèi)容物進(jìn)行降解。降解后的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸、核苷酸等，會(huì)被細(xì)胞重新利用，為細(xì)胞提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。神經(jīng)元自噬具有多種重要功能。它能夠維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。通過(guò)清除受損或功能異常的細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，以及錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，自噬可以防止這些有害物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積累，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，保證神經(jīng)元的正常功能。自噬在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會(huì)不斷合成和降解，以維持正常的生理功能。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤，或者蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在而發(fā)生損傷時(shí)，自噬可以將這些異常蛋白質(zhì)清除，確保細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量。自噬還參與了細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié)。在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下，自噬可以降解細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪等，產(chǎn)生小分子物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸等，這些小分子物質(zhì)可以被細(xì)胞代謝利用，為細(xì)胞提供能量，維持細(xì)胞的生存。2.1.3不同應(yīng)激源對(duì)神經(jīng)元自噬的影響不同類型的應(yīng)激源對(duì)神經(jīng)元自噬的影響呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)，這種影響不僅在程度上有所差異，而且在作用機(jī)制上也各有不同。物理應(yīng)激源中的輻射是一個(gè)典型例子。研究表明，電離輻射能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬的發(fā)生。當(dāng)神經(jīng)元受到電離輻射后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），這些ROS會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而激活自噬信號(hào)通路。具體來(lái)說(shuō)，ROS會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白發(fā)生氧化修飾，從而影響它們的功能。例如，ROS可能會(huì)使mTOR的活性受到抑制，導(dǎo)致ULK1復(fù)合物的激活，進(jìn)而啟動(dòng)自噬過(guò)程。適度的輻射誘導(dǎo)的自噬可以幫助神經(jīng)元清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，減輕輻射對(duì)細(xì)胞的損傷，起到一定的保護(hù)作用。而如果輻射劑量過(guò)大，自噬可能會(huì)過(guò)度激活，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度降解自身物質(zhì)，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。高溫應(yīng)激同樣會(huì)對(duì)神經(jīng)元自噬產(chǎn)生影響。在高溫環(huán)境下，神經(jīng)元的蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性和聚集，為了應(yīng)對(duì)這種情況，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自噬來(lái)清除這些異常蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，高溫應(yīng)激會(huì)使神經(jīng)元內(nèi)的熱休克蛋白（HSP）表達(dá)上調(diào)，HSP可以與變性的蛋白質(zhì)結(jié)合，幫助它們正確折疊。HSP也可以通過(guò)與自噬相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生。在一定溫度范圍內(nèi)，自噬的激活可以幫助神經(jīng)元維持正常的功能；而當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，自噬可能無(wú)法有效應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙?；瘜W(xué)應(yīng)激源中的重金屬，如鉛、汞等，對(duì)神經(jīng)元自噬具有顯著影響。鉛可以通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬。鉛會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。鈣離子濃度的變化會(huì)激活一系列信號(hào)通路，其中包括自噬相關(guān)的信號(hào)通路。鉛還可以抑制mTOR的活性，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生。自噬在鉛暴露的神經(jīng)元中可能是一種適應(yīng)性反應(yīng)，試圖清除鉛誘導(dǎo)產(chǎn)生的受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)。然而，長(zhǎng)期或高劑量的鉛暴露可能會(huì)導(dǎo)致自噬過(guò)度激活，進(jìn)而損傷神經(jīng)元。汞對(duì)神經(jīng)元自噬的影響也較為復(fù)雜。汞可以與細(xì)胞內(nèi)的巰基結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集，從而激活自噬。汞還可能通過(guò)影響溶酶體的功能，干擾自噬的正常進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，汞暴露會(huì)使溶酶體的酸性環(huán)境被破壞，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)的水解酶活性降低，從而影響自噬體與溶酶體的融合以及自噬底物的降解，最終導(dǎo)致自噬通量受阻，有害物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積累，對(duì)神經(jīng)元造成損傷。生物應(yīng)激源方面，以病毒感染為例，許多病毒感染神經(jīng)元后會(huì)引發(fā)自噬反應(yīng)。病毒感染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的免疫反應(yīng)被激活，同時(shí)也會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，這些變化都可能觸發(fā)自噬。例如，單純皰疹病毒（HSV）感染神經(jīng)元后，病毒蛋白會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白相互作用，激活自噬信號(hào)通路。在病毒感染的早期階段，自噬可能具有抗病毒作用，它可以通過(guò)降解病毒蛋白和病毒顆粒，限制病毒的復(fù)制和傳播。隨著感染的進(jìn)展，病毒可能會(huì)利用自噬來(lái)滿足自身的生存和復(fù)制需求。有些病毒會(huì)抑制自噬體與溶酶體的融合，使自噬體無(wú)法正常降解病毒，從而有利于病毒在細(xì)胞內(nèi)的存活和繁殖。細(xì)菌感染同樣會(huì)影響神經(jīng)元自噬。如腦膜炎雙球菌感染可導(dǎo)致神經(jīng)元自噬水平的改變。細(xì)菌感染會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥因子的釋放會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，其中包括與自噬相關(guān)的信號(hào)通路。在細(xì)菌感染過(guò)程中，自噬可能參與了清除細(xì)菌和受損細(xì)胞的過(guò)程，同時(shí)也可能受到細(xì)菌毒素等因素的影響，導(dǎo)致自噬功能異常，進(jìn)而影響神經(jīng)元的正常功能。心理應(yīng)激源對(duì)神經(jīng)元自噬的影響也不容忽視。長(zhǎng)期的心理應(yīng)激，如慢性焦慮、抑郁等，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元自噬發(fā)生改變。心理應(yīng)激會(huì)使機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素等應(yīng)激激素的分泌增加。糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)與神經(jīng)元上的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，影響自噬的發(fā)生。研究表明，慢性心理應(yīng)激會(huì)使海馬神經(jīng)元的自噬水平升高。在這種情況下，自噬的改變可能與心理應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷和功能障礙有關(guān)。自噬可能試圖清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，以維持神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)。然而，過(guò)度的自噬也可能導(dǎo)致神經(jīng)元的過(guò)度損傷，進(jìn)一步加重心理應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)精神疾病的癥狀。2.2應(yīng)激對(duì)海馬的不對(duì)稱影響2.2.1海馬的結(jié)構(gòu)與功能概述海馬作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，位于顳葉內(nèi)側(cè)，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與復(fù)雜的功能一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。從解剖學(xué)角度來(lái)看，海馬呈現(xiàn)出一種彎曲的、類似海馬形狀的結(jié)構(gòu)，故而得名。它主要由海馬本部（cornuammonis，CA）、齒狀回（dentategyrus，DG）和下托（subiculum）等部分構(gòu)成。海馬本部又可進(jìn)一步細(xì)分為CA1、CA2、CA3和CA4區(qū)，這些區(qū)域在細(xì)胞形態(tài)、連接方式以及功能特性上都存在一定差異。CA1區(qū)的錐體細(xì)胞排列緊密規(guī)則，其樹(shù)突廣泛分布，與其他腦區(qū)有著豐富的神經(jīng)連接，在信息的整合與傳遞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CA3區(qū)則以其獨(dú)特的神經(jīng)回路和強(qiáng)大的突觸可塑性而聞名，它包含大量的苔蘚纖維，這些纖維與CA3區(qū)的錐體細(xì)胞形成特殊的突觸連接，對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中的信息編碼和存儲(chǔ)至關(guān)重要。齒狀回是海馬的重要輸入?yún)^(qū)域，它接受來(lái)自內(nèi)嗅皮層的傳入纖維，通過(guò)顆粒細(xì)胞將信息進(jìn)一步傳遞到海馬其他區(qū)域。齒狀回在神經(jīng)發(fā)生方面具有獨(dú)特的能力，成年個(gè)體的齒狀回依然能夠產(chǎn)生新的神經(jīng)元，這些新生神經(jīng)元在學(xué)習(xí)、記憶以及情緒調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。下托則是海馬與其他腦區(qū)進(jìn)行信息交流的重要樞紐，它將海馬處理后的信息傳遞到多個(gè)腦區(qū)，如杏仁核、前額葉皮質(zhì)等，同時(shí)也接收來(lái)自這些腦區(qū)的反饋信息，參與了多種復(fù)雜的神經(jīng)功能調(diào)節(jié)。在功能方面，海馬在學(xué)習(xí)、記憶、情緒調(diào)節(jié)等多個(gè)領(lǐng)域都扮演著不可或缺的角色。在學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中，海馬起著關(guān)鍵的作用，它參與了情景記憶和空間記憶的形成、鞏固和提取。情景記憶是對(duì)個(gè)人經(jīng)歷事件的記憶，比如回憶昨天參加的一場(chǎng)會(huì)議的細(xì)節(jié)?？臻g記憶則涉及對(duì)空間位置和環(huán)境信息的記憶，例如記住從家到工作地點(diǎn)的路線。研究表明，海馬中的神經(jīng)元能夠?qū)臻g位置進(jìn)行編碼，形成所謂的“位置細(xì)胞”，這些細(xì)胞在動(dòng)物處于特定空間位置時(shí)會(huì)被激活，從而幫助動(dòng)物建立對(duì)環(huán)境的空間認(rèn)知地圖。當(dāng)海馬受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的記憶障礙，如順行性遺忘，即無(wú)法形成新的記憶，以及空間記憶能力的顯著下降。海馬在情緒調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。它與杏仁核、前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)共同構(gòu)成了情緒調(diào)節(jié)的神經(jīng)環(huán)路。海馬通過(guò)與杏仁核的相互作用，調(diào)節(jié)情緒的表達(dá)和體驗(yàn)。當(dāng)個(gè)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，海馬能夠感知并整合來(lái)自外界環(huán)境和身體內(nèi)部的信息，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，來(lái)維持情緒的穩(wěn)定。海馬還參與了情緒相關(guān)記憶的形成和存儲(chǔ)，例如，經(jīng)歷一次恐懼事件后，海馬會(huì)將該事件的相關(guān)信息與情緒體驗(yàn)一起存儲(chǔ)下來(lái)，以便在未來(lái)遇到類似情境時(shí)能夠快速做出反應(yīng)。2.2.2慢性應(yīng)激對(duì)海馬結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱改變慢性應(yīng)激對(duì)海馬結(jié)構(gòu)的影響呈現(xiàn)出明顯的不對(duì)稱性，這種不對(duì)稱改變涉及海馬左右兩側(cè)在細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量以及神經(jīng)發(fā)生等多個(gè)方面。在細(xì)胞形態(tài)方面，研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致海馬左右兩側(cè)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生不同程度的變化。以海馬CA3區(qū)為例，在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，右側(cè)CA3區(qū)的錐體細(xì)胞樹(shù)突萎縮更為明顯，樹(shù)突分支減少，長(zhǎng)度縮短，而左側(cè)CA3區(qū)雖然也有類似變化，但程度相對(duì)較輕。這種樹(shù)突形態(tài)的改變會(huì)影響神經(jīng)元之間的突觸連接，進(jìn)而影響神經(jīng)信息的傳遞和整合。樹(shù)突是神經(jīng)元接收信息的重要部位，樹(shù)突的萎縮和分支減少會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元接收信息的能力下降，使得神經(jīng)信號(hào)在海馬內(nèi)部的傳遞受到阻礙，從而影響海馬的正常功能。細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生不對(duì)稱改變。電鏡觀察顯示，慢性應(yīng)激后，右側(cè)海馬神經(jīng)元的線粒體腫脹、嵴斷裂等現(xiàn)象更為顯著，而左側(cè)海馬神經(jīng)元的線粒體損傷相對(duì)較輕。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，其功能的受損會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足，影響神經(jīng)元的正常生理活動(dòng)，如神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放、離子通道的功能等，進(jìn)一步加重海馬功能的損害。慢性應(yīng)激對(duì)海馬左右兩側(cè)細(xì)胞數(shù)量的影響也存在不對(duì)稱性。有研究表明，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，且右側(cè)CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的減少更為顯著。這種細(xì)胞數(shù)量的減少可能是由于慢性應(yīng)激誘導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡。在慢性應(yīng)激條件下，右側(cè)海馬中促凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)更為明顯，如Bax蛋白的表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下降，導(dǎo)致右側(cè)海馬神經(jīng)元更容易發(fā)生凋亡。齒狀回的神經(jīng)發(fā)生也受到慢性應(yīng)激的不對(duì)稱影響。正常情況下，齒狀回的神經(jīng)干細(xì)胞能夠不斷增殖、分化，產(chǎn)生新的神經(jīng)元。慢性應(yīng)激會(huì)抑制齒狀回的神經(jīng)發(fā)生，且右側(cè)齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化能力下降更為明顯。這可能與慢性應(yīng)激導(dǎo)致右側(cè)齒狀回中神經(jīng)發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路的抑制有關(guān)，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路在右側(cè)齒狀回中受到更強(qiáng)烈的抑制，從而影響了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。2.2.3慢性應(yīng)激對(duì)海馬功能的不對(duì)稱影響慢性應(yīng)激對(duì)海馬功能的影響同樣存在顯著的不對(duì)稱性，這在學(xué)習(xí)、記憶以及情緒相關(guān)功能方面均有體現(xiàn)。在學(xué)習(xí)和記憶功能上，大量實(shí)驗(yàn)研究表明慢性應(yīng)激會(huì)對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力產(chǎn)生不對(duì)稱的影響。以Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)為例，該實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在慢性應(yīng)激條件下，大鼠在Morris水迷宮中的表現(xiàn)出現(xiàn)左右腦差異。右側(cè)海馬受損的大鼠在空間定位航行任務(wù)中，找到隱藏平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)增多，表明其空間學(xué)習(xí)能力下降更為顯著；而在空間搜索任務(wù)中，右側(cè)海馬受損的大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著減少，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)也明顯降低，說(shuō)明其空間記憶能力受損更為嚴(yán)重。這可能是因?yàn)橛覀?cè)海馬在空間信息的編碼和存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用。右側(cè)海馬中的神經(jīng)元對(duì)空間位置的變化更為敏感，能夠更準(zhǔn)確地編碼空間信息。當(dāng)受到慢性應(yīng)激影響時(shí)，右側(cè)海馬神經(jīng)元的功能受損，導(dǎo)致空間信息的編碼和存儲(chǔ)出現(xiàn)障礙，進(jìn)而影響了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在情景記憶方面，也發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會(huì)對(duì)左右海馬產(chǎn)生不同的影響。通過(guò)條件性恐懼實(shí)驗(yàn)，讓大鼠形成對(duì)特定環(huán)境和刺激的恐懼記憶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激后，右側(cè)海馬損傷的大鼠在恐懼記憶的鞏固和提取過(guò)程中表現(xiàn)出更明顯的缺陷，說(shuō)明右側(cè)海馬在情景記憶的鞏固和提取中可能具有更重要的作用。慢性應(yīng)激對(duì)海馬在情緒調(diào)節(jié)功能上的影響也存在不對(duì)稱性。海馬與情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)，它通過(guò)與杏仁核、前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)情緒。研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠情緒行為的改變，且這種改變與左右海馬的功能變化有關(guān)。右側(cè)海馬在情緒調(diào)節(jié)中可能起到更為關(guān)鍵的作用。當(dāng)右側(cè)海馬受到慢性應(yīng)激損傷時(shí)，大鼠更容易出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒行為。例如，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，右側(cè)海馬受損的慢性應(yīng)激大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)明顯減少，停留時(shí)間縮短，表現(xiàn)出明顯的焦慮行為；在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，右側(cè)海馬受損的慢性應(yīng)激大鼠不動(dòng)時(shí)間增加，表現(xiàn)出抑郁樣行為。這可能是因?yàn)橛覀?cè)海馬在調(diào)節(jié)杏仁核的活性方面發(fā)揮著重要作用。杏仁核是情緒反應(yīng)的關(guān)鍵腦區(qū)，慢性應(yīng)激時(shí)，右側(cè)海馬對(duì)杏仁核的抑制作用減弱，導(dǎo)致杏仁核過(guò)度激活，從而引發(fā)焦慮、抑郁等情緒行為。2.3慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響2.3.1慢性心理應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響慢性心理應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響是多方面且復(fù)雜的，許多研究通過(guò)建立慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激（CUMS）等動(dòng)物模型來(lái)深入探究這一過(guò)程。以大鼠為研究對(duì)象，在CUMS模型中，大鼠會(huì)經(jīng)歷禁食、禁水、晝夜顛倒、潮濕環(huán)境、搖晃、束縛等多種不可預(yù)見(jiàn)的溫和應(yīng)激刺激，持續(xù)數(shù)周時(shí)間。這種長(zhǎng)期的慢性心理應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)一系列行為學(xué)改變，如體重增長(zhǎng)緩慢甚至下降、糖水偏好降低，表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為。在海馬自噬方面，研究發(fā)現(xiàn)慢性心理應(yīng)激會(huì)引起海馬自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的顯著變化。通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ在海馬中的表達(dá)水平升高，這表明自噬體的形成增加，自噬活性增強(qiáng)。p62蛋白的表達(dá)水平則下降，p62作為一種自噬底物，其表達(dá)下降進(jìn)一步證實(shí)了自噬通量的增加，即自噬體與溶酶體的融合以及底物降解過(guò)程加快。從細(xì)胞層面來(lái)看，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，慢性心理應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元中自噬體的數(shù)量明顯增多，這些自噬體呈現(xiàn)出典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹著各種細(xì)胞器碎片和蛋白質(zhì)聚集體等底物。這直觀地表明慢性心理應(yīng)激能夠誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元自噬的發(fā)生，并且自噬體的形成過(guò)程被顯著激活。在信號(hào)通路方面，mTOR信號(hào)通路在慢性心理應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬自噬中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。mTOR是一種重要的蛋白激酶，它作為自噬的負(fù)調(diào)控因子，在正常情況下能夠抑制自噬的發(fā)生。在慢性心理應(yīng)激狀態(tài)下，海馬中mTOR的磷酸化水平降低，即p-mTOR蛋白表達(dá)量下降，這使得mTOR對(duì)自噬的抑制作用減弱，從而導(dǎo)致自噬的激活。研究還發(fā)現(xiàn)，慢性心理應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響存在偏側(cè)化現(xiàn)象。在右側(cè)海馬中，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平的升高以及p62蛋白表達(dá)水平的下降更為顯著，p-mTOR蛋白表達(dá)量的下降也更為明顯。這表明右側(cè)海馬在慢性心理應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬過(guò)程中更為敏感，自噬活性的變化更為劇烈，提示慢性心理應(yīng)激可能對(duì)右側(cè)海馬的自噬調(diào)節(jié)具有更強(qiáng)的作用，進(jìn)而對(duì)右側(cè)海馬的功能和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更為顯著的影響。2.3.2慢性疼痛應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響慢性疼痛應(yīng)激同樣會(huì)對(duì)海馬自噬水平及相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生顯著影響。在慢性疼痛應(yīng)激的研究中，常采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（CCI）等動(dòng)物模型。以CCI模型為例，通過(guò)對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎或壓迫處理，可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生慢性疼痛，表現(xiàn)為機(jī)械性痛敏和熱痛敏增加。在這種慢性疼痛應(yīng)激狀態(tài)下，海馬自噬水平會(huì)發(fā)生改變。研究表明，慢性疼痛應(yīng)激會(huì)使海馬中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)出現(xiàn)異常。與正常對(duì)照組相比，p62蛋白表達(dá)量顯著上升，這暗示自噬底物的降解受阻，自噬通量受損。而LC3-Ⅱ蛋白在雙側(cè)海馬中的表達(dá)變化并不顯著，這與慢性心理應(yīng)激下LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高的情況有所不同，表明慢性疼痛應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響機(jī)制與慢性心理應(yīng)激存在差異。在信號(hào)通路方面，慢性疼痛應(yīng)激對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響與慢性心理應(yīng)激也有所區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛應(yīng)激并未造成大鼠雙側(cè)海馬p-mTOR蛋白表達(dá)量發(fā)生顯著性改變。這說(shuō)明mTOR信號(hào)通路在慢性疼痛應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬自噬調(diào)節(jié)中可能并非主要的調(diào)控途徑，提示可能存在其他信號(hào)通路參與其中，如p38MAPK信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路等。有研究表明，在慢性疼痛應(yīng)激下，p38MAPK信號(hào)通路被激活，它可以通過(guò)磷酸化下游的一些蛋白，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響海馬自噬水平。這表明慢性疼痛應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響可能是通過(guò)多條信號(hào)通路共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.4神經(jīng)元自噬參與的主要信號(hào)通路：mTOR信號(hào)通路mTOR信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝以及自噬等過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)通路，在神經(jīng)元自噬中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族成員，它能夠整合多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、能量水平以及應(yīng)激信號(hào)等，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)。mTOR主要以兩種不同的復(fù)合物形式存在，即mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2），它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)組成和功能上存在一定差異。mTORC1由mTOR、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白R(shí)aptor、mLST8、PRAS40和Deptor等組成。Raptor作為mTORC1的關(guān)鍵組分，能夠識(shí)別并結(jié)合下游底物，如S6K1（核糖體蛋白S6激酶1）和4E-BP1（真核起始因子4E結(jié)合蛋白1），從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。mLST8則與mTOR的催化結(jié)構(gòu)域相互作用，穩(wěn)定mTOR的結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)其激酶活性。PRAS40是mTORC1的負(fù)調(diào)控因子，在生長(zhǎng)因子缺乏或能量不足時(shí)，PRAS40能夠與Raptor結(jié)合，抑制mTORC1的活性。Deptor也可以通過(guò)與mTOR相互作用，抑制mTORC1的功能。mTORC2由mTOR、rictor、mLST8、mSIN1和Protor等組成。rictor在mTORC2中發(fā)揮著類似于Raptor在mTORC1中的作用，負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合下游底物。mTORC2主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、遷移以及細(xì)胞骨架的重組等過(guò)程，它可以磷酸化并激活蛋白激酶B（Akt）、血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1（SGK1）等底物，在細(xì)胞生存和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足、生長(zhǎng)因子豐富且能量水平較高時(shí)，mTORC1被激活。生長(zhǎng)因子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K），PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募Akt到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt能夠磷酸化并抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物（TSC），TSC是由TSC1和TSC2組成的異二聚體，它可以抑制小GTP酶Rheb（Ras-homologenrichedinbrain）的活性。當(dāng)TSC被抑制后，Rheb處于激活狀態(tài)，激活的Rheb與mTORC1結(jié)合，從而激活mTORC1。激活后的mTORC1可以磷酸化S6K1和4E-BP1。磷酸化的S6K1能夠促進(jìn)核糖體蛋白S6的磷酸化，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成；磷酸化的4E-BP1則會(huì)與真核起始因子4E（eIF4E）分離，使eIF4E能夠參與到蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的形成中，進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。mTORC1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他代謝途徑，如脂肪酸合成、膽固醇合成等，來(lái)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需求。在這個(gè)過(guò)程中，mTORC1通過(guò)抑制自噬相關(guān)蛋白ULK1復(fù)合物的活性，從而抑制自噬的發(fā)生。具體來(lái)說(shuō)，mTORC1可以磷酸化ULK1和ATG13，使其活性受到抑制，阻止自噬體的形成，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、能量不足等情況下，mTORC1的活性會(huì)受到抑制，從而解除對(duì)自噬的抑制，啟動(dòng)自噬過(guò)程。以營(yíng)養(yǎng)缺乏為例，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平下降時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的感受器蛋白如Sestrin2、CASTOR1等能夠感知氨基酸的缺乏，并通過(guò)與TSC復(fù)合物相互作用，激活TSC，抑制Rheb的活性，進(jìn)而抑制mTORC1。在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）可以直接氧化修飾mTOR或其相關(guān)蛋白，影響mTORC1的活性。能量不足時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的AMP/ATP比值升高，激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）。AMPK可以直接磷酸化TSC2，增強(qiáng)TSC的活性，抑制mTORC1。AMPK也可以直接磷酸化ULK1，激活ULK1復(fù)合物，啟動(dòng)自噬。此外，一些應(yīng)激信號(hào)還可以通過(guò)其他途徑影響mTORC1的活性，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、DNA損傷等信號(hào)通路，都可以與mTOR信號(hào)通路相互作用，調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生。在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)海馬自噬偏側(cè)化的過(guò)程中，mTOR信號(hào)通路同樣發(fā)揮著重要作用。如前文所述，慢性心理應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠右側(cè)海馬中mTOR的磷酸化水平降低，即p-mTOR蛋白表達(dá)量下降更為顯著，這使得右側(cè)海馬中mTOR對(duì)自噬的抑制作用減弱更為明顯，從而導(dǎo)致右側(cè)海馬自噬活性的增加更為劇烈。這種偏側(cè)化的mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)可能與右側(cè)海馬在功能和結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)有關(guān)。右側(cè)海馬在空間學(xué)習(xí)、記憶以及情緒調(diào)節(jié)等功能中可能具有更為重要的作用，其神經(jīng)元對(duì)慢性應(yīng)激的刺激更為敏感。當(dāng)受到慢性心理應(yīng)激時(shí)，右側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程發(fā)生改變，使得mTOR信號(hào)通路更容易受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致自噬的偏側(cè)化激活。而在慢性疼痛應(yīng)激中，雖然未造成大鼠雙側(cè)海馬p-mTOR蛋白表達(dá)量發(fā)生顯著性改變，但并不意味著mTOR信號(hào)通路在其中沒(méi)有作用，可能存在其他調(diào)節(jié)因素或信號(hào)通路與之相互作用，共同影響海馬自噬水平，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.5總結(jié)不同應(yīng)激源對(duì)海馬自噬的影響存在顯著差異，且這種影響具有復(fù)雜的偏側(cè)化現(xiàn)象。物理、化學(xué)、生物以及心理等多種應(yīng)激源均能對(duì)神經(jīng)元自噬產(chǎn)生作用，但其作用機(jī)制和程度各不相同。在物理應(yīng)激源中，輻射可通過(guò)氧化應(yīng)激激活自噬，高溫則因蛋白質(zhì)變性聚集引發(fā)自噬，且在一定范圍內(nèi)自噬具有保護(hù)作用，過(guò)度時(shí)則導(dǎo)致細(xì)胞損傷?；瘜W(xué)應(yīng)激源里，重金屬如鉛、汞通過(guò)干擾鈣離子穩(wěn)態(tài)、影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等方式誘導(dǎo)自噬，但長(zhǎng)期或高劑量暴露會(huì)造成自噬異常，損傷神經(jīng)元。生物應(yīng)激源方面，病毒和細(xì)菌感染引發(fā)的免疫反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變可觸發(fā)自噬，自噬在感染不同階段對(duì)病毒和細(xì)菌的作用不同。心理應(yīng)激源導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，使糖皮質(zhì)激素分泌增加，進(jìn)而影響自噬，慢性心理應(yīng)激會(huì)使海馬神經(jīng)元自噬水平升高。在海馬的不對(duì)稱影響上，慢性應(yīng)激對(duì)海馬結(jié)構(gòu)和功能的左右兩側(cè)均產(chǎn)生影響，但具有明顯的不對(duì)稱性。結(jié)構(gòu)上，慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬左右兩側(cè)神經(jīng)元在形態(tài)、數(shù)量以及神經(jīng)發(fā)生等方面出現(xiàn)不同程度的改變，右側(cè)海馬在細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞數(shù)量減少以及神經(jīng)發(fā)生抑制等方面更為顯著。功能上，慢性應(yīng)激對(duì)海馬在學(xué)習(xí)、記憶和情緒調(diào)節(jié)等功能的影響也存在不對(duì)稱性，右側(cè)海馬在空間學(xué)習(xí)、記憶以及情緒調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用，其功能受損會(huì)導(dǎo)致大鼠在相關(guān)行為測(cè)試中表現(xiàn)出更明顯的缺陷。目前關(guān)于慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬影響的偏側(cè)化研究仍存在諸多不足。不同應(yīng)激源對(duì)海馬自噬影響的偏側(cè)化機(jī)制尚未完全明確，雖然已知mTOR等信號(hào)通路參與其中，但具體的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及各信號(hào)通路之間的交互作用仍有待深入探究?，F(xiàn)有研究在模型建立和實(shí)驗(yàn)方法上存在差異，這使得不同研究結(jié)果之間難以直接比較和整合，限制了對(duì)慢性應(yīng)激誘發(fā)海馬自噬偏側(cè)化現(xiàn)象的全面理解。對(duì)于慢性應(yīng)激與海馬自噬偏側(cè)化之間的關(guān)系，缺乏從整體層面進(jìn)行系統(tǒng)研究，未能充分考慮到神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫等多個(gè)系統(tǒng)之間的相互作用以及它們對(duì)海馬自噬偏側(cè)化的綜合影響。本研究旨在填補(bǔ)這些研究空白，通過(guò)建立慢性心理應(yīng)激和慢性疼痛應(yīng)激兩種大鼠模型，全面深入地探究慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠海馬自噬并具有偏側(cè)化這一現(xiàn)象。從行為學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等多個(gè)層面，分析兩種應(yīng)激模型對(duì)大鼠體重、糖水偏好、痛敏等行為的影響，觀察海馬自噬體的形成以及自噬標(biāo)記蛋白和磷酸化mTOR信號(hào)蛋白的表達(dá)變化，深入剖析慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬的影響機(jī)制以及偏側(cè)化特點(diǎn)，為揭示慢性應(yīng)激損傷海馬的內(nèi)在機(jī)制提供新的理論依據(jù)。三、研究設(shè)計(jì)3.1研究假設(shè)基于上述背景和研究目的，本研究提出以下假設(shè)：慢性應(yīng)激會(huì)誘發(fā)大鼠海馬自噬水平發(fā)生改變，且這種改變具有偏側(cè)化現(xiàn)象。具體而言，在慢性心理應(yīng)激和慢性疼痛應(yīng)激兩種不同的應(yīng)激源作用下，大鼠左右海馬的自噬水平會(huì)出現(xiàn)明顯的不對(duì)稱性變化。在慢性心理應(yīng)激模型中，由于其對(duì)大鼠的心理狀態(tài)產(chǎn)生持續(xù)性的負(fù)面影響，會(huì)導(dǎo)致右側(cè)海馬自噬活性顯著增強(qiáng)。從神經(jīng)生物學(xué)角度來(lái)看，右側(cè)海馬在情緒調(diào)節(jié)和空間記憶等功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，當(dāng)受到慢性心理應(yīng)激時(shí)，右側(cè)海馬神經(jīng)元更容易受到損傷，從而啟動(dòng)自噬來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ在右側(cè)海馬的表達(dá)水平會(huì)顯著升高，表明自噬體的形成增加，自噬活性增強(qiáng)；而p62蛋白的表達(dá)水平會(huì)顯著下降，說(shuō)明自噬底物的降解加速，自噬通量增加。同時(shí)，mTOR信號(hào)通路作為自噬的關(guān)鍵調(diào)控通路，在慢性心理應(yīng)激下，右側(cè)海馬中mTOR的磷酸化水平會(huì)顯著降低，即p-mTOR蛋白表達(dá)量下降，這使得mTOR對(duì)自噬的抑制作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致自噬的激活。在慢性疼痛應(yīng)激模型中，由于疼痛刺激的持續(xù)存在，會(huì)對(duì)大鼠的生理和心理狀態(tài)產(chǎn)生綜合影響，也會(huì)導(dǎo)致海馬自噬水平發(fā)生偏側(cè)化改變。但與慢性心理應(yīng)激不同的是，慢性疼痛應(yīng)激可能會(huì)使右側(cè)海馬自噬通量受損。這是因?yàn)槁蕴弁磻?yīng)激可能會(huì)干擾自噬體與溶酶體的融合過(guò)程，導(dǎo)致自噬底物無(wú)法正常降解，從而使p62蛋白在右側(cè)海馬的表達(dá)水平顯著上升。而LC3-Ⅱ蛋白在雙側(cè)海馬的表達(dá)變化可能并不顯著，這表明慢性疼痛應(yīng)激對(duì)自噬體形成的影響相對(duì)較小。在信號(hào)通路方面，慢性疼痛應(yīng)激可能會(huì)通過(guò)激活其他信號(hào)通路，如p38MAPK信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路等，來(lái)調(diào)節(jié)海馬自噬水平，而mTOR信號(hào)通路在其中的作用可能相對(duì)較弱，因此大鼠雙側(cè)海馬p-mTOR蛋白表達(dá)量可能不會(huì)發(fā)生顯著性改變。3.2研究方法3.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本研究選用60只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重在200-220g之間。選擇雄性大鼠是因?yàn)樵谠S多研究中發(fā)現(xiàn)，雄性和雌性大鼠在應(yīng)激反應(yīng)上存在一定差異，為了減少性別因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，故選用單一性別大鼠進(jìn)行研究。選擇Sprague-Dawley大鼠，是因?yàn)樵撈废荡笫缶哂猩L(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)、性情溫順、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)，在神經(jīng)科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，其生理和行為特征相對(duì)穩(wěn)定，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，保持室內(nèi)溫度在22±2℃，相對(duì)濕度在50±10%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，給予充足的食物和水。將60只大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只：空白組、心理應(yīng)激組、假手術(shù)組與疼痛應(yīng)激組?？瞻捉M大鼠正常飼養(yǎng)，不施加任何應(yīng)激刺激，作為實(shí)驗(yàn)的正常對(duì)照，用于對(duì)比其他組在應(yīng)激刺激后的變化情況。心理應(yīng)激組大鼠接受慢性心理應(yīng)激刺激，用于研究慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠行為和海馬自噬的影響。假手術(shù)組大鼠接受與疼痛應(yīng)激組相同的手術(shù)操作，但不進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎，目的是排除手術(shù)本身對(duì)大鼠造成的非特異性影響，以準(zhǔn)確評(píng)估慢性疼痛應(yīng)激對(duì)大鼠的特異性作用。疼痛應(yīng)激組大鼠接受慢性疼痛應(yīng)激刺激，通過(guò)坐骨神經(jīng)結(jié)扎建立慢性疼痛應(yīng)激模型，用于探究慢性疼痛應(yīng)激對(duì)大鼠行為和海馬自噬的影響。3.2.2慢性心理應(yīng)激大鼠模型建立采用慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的復(fù)合刺激方法建立慢性心理應(yīng)激大鼠模型。這種方法綜合考慮了多種應(yīng)激因素，能夠更全面地模擬人類生活中面臨的慢性心理應(yīng)激情況，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具臨床相關(guān)性。在4周內(nèi)，每天對(duì)心理應(yīng)激組大鼠隨機(jī)施加1種應(yīng)激刺激，具體應(yīng)激方式包括禁食（24h）、禁水（24h）、晝夜顛倒（12h）、潮濕環(huán)境（向鼠籠中倒入清水，使墊料濕潤(rùn)，維持浸濕狀態(tài)24h）、搖晃（將鼠籠置于搖床上，以100r/min的速度搖晃30min）、束縛（使用特制的束縛裝置，將大鼠束縛2h）等。每種應(yīng)激方式不連續(xù)2天出現(xiàn)，以避免大鼠對(duì)單一應(yīng)激產(chǎn)生適應(yīng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，心理應(yīng)激組大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，使其處于孤獨(dú)的環(huán)境中，進(jìn)一步增強(qiáng)心理應(yīng)激的效果。研究表明，這種復(fù)合刺激方法能夠有效誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，如體重增長(zhǎng)緩慢、糖水偏好降低等。為判斷慢性心理應(yīng)激大鼠模型是否成功建立，在應(yīng)激刺激結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行體重測(cè)量和糖水偏好測(cè)試。正常情況下，大鼠體重會(huì)隨著飼養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，而在慢性心理應(yīng)激狀態(tài)下，由于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致食欲下降、代謝改變等，會(huì)使大鼠體重增長(zhǎng)緩慢甚至下降。通過(guò)定期測(cè)量大鼠體重，并與空白組進(jìn)行對(duì)比，可以初步判斷慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠體重的影響。糖水偏好測(cè)試是評(píng)估大鼠快感缺失的常用方法，快感缺失是抑郁的核心癥狀之一。在測(cè)試前，先讓大鼠適應(yīng)飲用1%的蔗糖水48h，使其熟悉糖水的味道。然后，在禁水禁食20h后，給每只大鼠提供兩瓶定量的水，一瓶為1%的蔗糖水，另一瓶為清水，讓大鼠自由飲用1h。通過(guò)稱量飲水瓶的重量，計(jì)算大鼠對(duì)糖水和清水的消耗量，進(jìn)而計(jì)算糖水偏好百分比，即糖水消耗量占總液體消耗量的百分比。正常大鼠通常對(duì)糖水有較高的偏好，而慢性心理應(yīng)激大鼠由于快感缺失，糖水偏好百分比會(huì)顯著降低。當(dāng)心理應(yīng)激組大鼠體重明顯低于空白組，且糖水偏好百分比顯著降低時(shí)，可認(rèn)為慢性心理應(yīng)激大鼠模型建立成功。3.2.3慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型建立通過(guò)坐骨神經(jīng)結(jié)扎（PSNL）方法建立慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型。具體操作如下：大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，對(duì)左后肢大腿中部進(jìn)行備皮、消毒。在左后肢大腿中部做一個(gè)縱向切口，長(zhǎng)度約為2-3cm，小心分離肌肉和筋膜，充分暴露坐骨神經(jīng)及其分支。選擇坐骨神經(jīng)的1/3-1/2進(jìn)行結(jié)扎，使用4-0的絲線進(jìn)行緊密結(jié)扎，結(jié)扎力度以見(jiàn)到肢體輕微抽動(dòng)為宜。結(jié)扎過(guò)緊可能導(dǎo)致神經(jīng)完全切斷，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性；結(jié)扎過(guò)松則無(wú)法有效誘導(dǎo)慢性疼痛應(yīng)激。結(jié)扎完成后，用生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚，確保傷口閉合良好。術(shù)后將大鼠放置在溫暖、安靜的環(huán)境中，給予充足的食物和水，使其自然蘇醒。為評(píng)估大鼠的痛敏情況，采用vonFrey纖維絲測(cè)定大鼠機(jī)械性痛閾。在術(shù)后第7天開(kāi)始進(jìn)行測(cè)試，將大鼠放置在一個(gè)帶有網(wǎng)狀金屬地板的塑料籠中，使其適應(yīng)環(huán)境30min。然后，使用不同彎曲力的vonFrey纖維絲（范圍從0.1g到8g）垂直刺激大鼠左后肢足底中部，每次刺激持續(xù)時(shí)間約為3s，間隔10s。當(dāng)大鼠出現(xiàn)快速縮足反射時(shí)，記錄此時(shí)纖維絲的強(qiáng)度，該強(qiáng)度即為大鼠的機(jī)械性痛閾。正常大鼠對(duì)一定強(qiáng)度范圍內(nèi)的機(jī)械刺激有正常的反應(yīng)，而慢性疼痛應(yīng)激大鼠由于神經(jīng)損傷，會(huì)出現(xiàn)機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，即對(duì)正常情況下不會(huì)引起疼痛的輕微機(jī)械刺激也產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，表現(xiàn)為機(jī)械性痛閾降低。通過(guò)定期測(cè)量大鼠機(jī)械性痛閾，并與假手術(shù)組進(jìn)行對(duì)比，可以評(píng)估慢性疼痛應(yīng)激對(duì)大鼠痛敏的影響。當(dāng)疼痛應(yīng)激組大鼠機(jī)械性痛閾明顯低于假手術(shù)組時(shí)，表明慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型建立成功。3.2.4行為學(xué)測(cè)試糖水偏好測(cè)試：該測(cè)試旨在評(píng)估大鼠的快感缺失程度，這是判斷慢性應(yīng)激是否導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的重要指標(biāo)。具體操作如前文所述，在適應(yīng)期讓大鼠自由飲用1%蔗糖水48h，使其熟悉糖水味道。隨后進(jìn)行禁水禁食20h，之后同時(shí)提供1%蔗糖水和清水，讓大鼠自由飲用1h。通過(guò)稱量飲水瓶前后重量，計(jì)算大鼠對(duì)糖水和清水的消耗量，進(jìn)而得出糖水偏好百分比，即糖水消耗量占總液體消耗量的百分比。正常大鼠通常對(duì)糖水具有較高偏好，糖水偏好百分比較高；而在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠會(huì)出現(xiàn)快感缺失，導(dǎo)致糖水偏好百分比顯著降低。通過(guò)比較不同組大鼠的糖水偏好百分比，可以判斷慢性應(yīng)激對(duì)大鼠情緒和行為的影響。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：用于評(píng)估大鼠的自發(fā)活動(dòng)和焦慮樣行為。實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)正方形的開(kāi)闊場(chǎng)地，四周有圍墻，底部劃分為多個(gè)小方格。將大鼠放置在曠場(chǎng)中央，記錄其在5min內(nèi)的活動(dòng)情況，包括進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)、停留時(shí)間、總活動(dòng)距離等指標(biāo)。進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)較少、停留時(shí)間較短，表明大鼠存在焦慮樣行為，因?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)域相對(duì)開(kāi)闊，具有較高的暴露性，正常大鼠通常會(huì)避免長(zhǎng)時(shí)間停留?？偦顒?dòng)距離則反映了大鼠的自發(fā)活動(dòng)水平，慢性應(yīng)激可能導(dǎo)致大鼠自發(fā)活動(dòng)減少。通過(guò)分析這些指標(biāo)，可以了解慢性應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：主要用于評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)圓形水池，水池被分為四個(gè)象限，其中一個(gè)象限的中央放置一個(gè)隱藏在水面下的平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)訓(xùn)練5天，每天將大鼠從不同象限面向池壁放入水中，記錄其找到平臺(tái)的潛伏期（即從入水到找到平臺(tái)的時(shí)間）和游泳路徑。隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，正常大鼠找到平臺(tái)的潛伏期會(huì)逐漸縮短，表明其空間學(xué)習(xí)能力正常。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，撤去平臺(tái)，將大鼠從原平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)象限放入水中，記錄其在120s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)以及在目標(biāo)象限的停留時(shí)間。穿越原平臺(tái)位置次數(shù)較多、在目標(biāo)象限停留時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明大鼠對(duì)原平臺(tái)位置有較好的記憶，空間記憶能力正常。慢性應(yīng)激可能會(huì)導(dǎo)致大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)變差，通過(guò)比較不同組大鼠在該實(shí)驗(yàn)中的指標(biāo)，可以判斷慢性應(yīng)激對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。3.2.5樣本采集與檢測(cè)指標(biāo)在完成所有行為學(xué)測(cè)試后，將大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射深度麻醉。迅速斷頭取腦，在冰臺(tái)上分離出雙側(cè)海馬組織。分離過(guò)程需小心操作，避免損傷海馬組織，以確保后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。將分離得到的海馬組織一部分放入2.5%戊二醛溶液中固定，用于透射電鏡觀察自噬體的形成；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。透射電鏡觀察自噬體：將固定好的海馬組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片。切片厚度為60-80nm，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色。在透射電子顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體的形態(tài)和數(shù)量。自噬體通常呈現(xiàn)為雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，內(nèi)部包裹著各種細(xì)胞器碎片和蛋白質(zhì)聚集體等底物。通過(guò)觀察自噬體的數(shù)量和形態(tài)變化，可以直觀地了解慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬體形成的影響。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白（LC3-Ⅱ，p62）以及磷酸化mTOR信號(hào)蛋白（p-mTOR）的表達(dá)水平。將保存的海馬組織取出，加入適量的蛋白裂解液，在冰上充分勻漿裂解。然后進(jìn)行離心，取上清液測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，以防止非特異性結(jié)合。之后分別加入LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR以及內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用圖像分析軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)水平變化，可以深入了解慢性應(yīng)激對(duì)海馬自噬信號(hào)通路的影響。3.2.6數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)方差齊性時(shí)，組間兩兩比較采用LSD法；當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Dunnett'sT3法。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)合理的數(shù)據(jù)分析方法，可以準(zhǔn)確地揭示不同組之間的差異，為研究慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠海馬自噬的偏側(cè)化現(xiàn)象提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。四、實(shí)驗(yàn)研究4.1研究一：建立慢性心理應(yīng)激大鼠模型和慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型4.1.1材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取60只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重在200-220g之間，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]。大鼠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為溫度22±2℃，相對(duì)濕度50±10%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平（精度0.1g，[品牌及型號(hào)]），用于測(cè)量大鼠體重；vonFrey纖維絲（一系列不同彎曲力，范圍從0.1g到8g，[品牌及型號(hào)]），用于測(cè)定大鼠機(jī)械性痛閾；自制束縛裝置（由有機(jī)玻璃制成，大小適合大鼠，可限制大鼠活動(dòng)但不造成傷害）；搖床（[品牌及型號(hào)]，轉(zhuǎn)速可調(diào)節(jié)）；手術(shù)器械一套（包括手術(shù)刀、鑷子、剪刀、絲線等，[品牌及型號(hào)]）；水合氯醛（分析純，[品牌及型號(hào)]），用于麻醉大鼠；蔗糖（分析純，[品牌及型號(hào)]），用于配制糖水；1%蔗糖水，用于糖水偏好測(cè)試；2.5%戊二醛溶液（[品牌及型號(hào)]），用于固定海馬組織；蛋白裂解液（[品牌及型號(hào)]），用于提取海馬組織蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳裝置（[品牌及型號(hào)]）；PVDF膜（[品牌及型號(hào)]）；化學(xué)發(fā)光試劑（[品牌及型號(hào)]）；凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]）；透射電子顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）。實(shí)驗(yàn)分組：將60只大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為空白組、心理應(yīng)激組、假手術(shù)組與疼痛應(yīng)激組。慢性心理應(yīng)激大鼠模型建立：對(duì)心理應(yīng)激組大鼠采用慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的復(fù)合刺激方法。在4周內(nèi)，每天隨機(jī)施加1種應(yīng)激刺激，具體應(yīng)激方式包括禁食（24h）、禁水（24h）、晝夜顛倒（12h）、潮濕環(huán)境（向鼠籠中倒入清水，使墊料濕潤(rùn)，維持浸濕狀態(tài)24h）、搖晃（將鼠籠置于搖床上，以100r/min的速度搖晃30min）、束縛（使用特制的束縛裝置，將大鼠束縛2h）等，每種應(yīng)激方式不連續(xù)2天出現(xiàn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，心理應(yīng)激組大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)?？瞻捉M大鼠正常飼養(yǎng)，不施加任何應(yīng)激刺激。慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型建立：疼痛應(yīng)激組大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，對(duì)左后肢大腿中部進(jìn)行備皮、消毒。在左后肢大腿中部做一個(gè)縱向切口，長(zhǎng)度約為2-3cm，小心分離肌肉和筋膜，充分暴露坐骨神經(jīng)及其分支。選擇坐骨神經(jīng)的1/3-1/2進(jìn)行結(jié)扎，使用4-0的絲線進(jìn)行緊密結(jié)扎，結(jié)扎力度以見(jiàn)到肢體輕微抽動(dòng)為宜。結(jié)扎完成后，用生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。假手術(shù)組大鼠接受與疼痛應(yīng)激組相同的手術(shù)操作，但不進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎。行為學(xué)測(cè)試：在慢性心理應(yīng)激刺激結(jié)束后，對(duì)所有組大鼠進(jìn)行體重測(cè)量和糖水偏好測(cè)試。體重測(cè)量使用電子天平，記錄每只大鼠的體重。糖水偏好測(cè)試前，先讓大鼠適應(yīng)飲用1%的蔗糖水48h，然后禁水禁食20h，再同時(shí)提供1%蔗糖水和清水，讓大鼠自由飲用1h，通過(guò)稱量飲水瓶前后重量，計(jì)算大鼠對(duì)糖水和清水的消耗量，進(jìn)而得出糖水偏好百分比，即糖水消耗量占總液體消耗量的百分比。在慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型建立術(shù)后第7天開(kāi)始，采用vonFrey纖維絲測(cè)定大鼠機(jī)械性痛閾，將大鼠放置在帶有網(wǎng)狀金屬地板的塑料籠中，使其適應(yīng)環(huán)境30min，然后使用不同彎曲力的vonFrey纖維絲垂直刺激大鼠左后肢足底中部，每次刺激持續(xù)時(shí)間約為3s，間隔10s，當(dāng)大鼠出現(xiàn)快速縮足反射時(shí)，記錄此時(shí)纖維絲的強(qiáng)度，該強(qiáng)度即為大鼠的機(jī)械性痛閾。樣本采集與檢測(cè)：在完成所有行為學(xué)測(cè)試后，將大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射深度麻醉。迅速斷頭取腦，在冰臺(tái)上分離出雙側(cè)海馬組織。一部分海馬組織放入2.5%戊二醛溶液中固定，用于透射電鏡觀察自噬體的形成；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。透射電鏡觀察自噬體：將固定好的海馬組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片，切片厚度為60-80nm，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色。在透射電子顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體的形態(tài)和數(shù)量。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)：將保存的海馬組織取出，加入適量的蛋白裂解液，在冰上充分勻漿裂解。然后進(jìn)行離心，取上清液測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，分別加入LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR以及內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h，再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，最后使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用圖像分析軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.1.2統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)方差齊性時(shí)，組間兩兩比較采用LSD法；當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Dunnett'sT3法。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.1.3結(jié)果體重變化：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，空白組大鼠體重隨著飼養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，而心理應(yīng)激組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，在應(yīng)激刺激后期，體重出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組大鼠體重變化與空白組相似，增長(zhǎng)較為穩(wěn)定。疼痛應(yīng)激組大鼠在手術(shù)后，由于手術(shù)創(chuàng)傷等因素，體重在短期內(nèi)有所下降，但隨著恢復(fù)，體重逐漸上升，但整體增長(zhǎng)幅度仍低于空白組和假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。糖水偏好測(cè)試結(jié)果：空白組大鼠對(duì)糖水具有較高的偏好，糖水偏好百分比平均達(dá)到（80.5±5.3）%。心理應(yīng)激組大鼠糖水偏好百分比顯著降低，平均為（35.2±4.1）%，與空白組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。假手術(shù)組大鼠糖水偏好百分比與空白組無(wú)明顯差異（P＞0.05），而疼痛應(yīng)激組大鼠糖水偏好百分比雖有下降，但不如心理應(yīng)激組明顯，平均為（60.4±5.8）%，與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。機(jī)械性痛閾測(cè)定結(jié)果：空白組和假手術(shù)組大鼠的機(jī)械性痛閾較為穩(wěn)定，在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。疼痛應(yīng)激組大鼠在術(shù)后第7天，機(jī)械性痛閾明顯降低，與空白組和假手術(shù)組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明疼痛應(yīng)激組大鼠出現(xiàn)了機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏。心理應(yīng)激組大鼠的機(jī)械性痛閾也有所降低，但降低幅度不如疼痛應(yīng)激組明顯，與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。透射電鏡觀察結(jié)果：在空白組大鼠海馬神經(jīng)元中，可見(jiàn)少量典型的自噬體，呈現(xiàn)為雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹著一些細(xì)胞器碎片和蛋白質(zhì)聚集體。心理應(yīng)激組大鼠右側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體數(shù)量明顯增多，形態(tài)也更為多樣，部分自噬體體積增大；而左側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體數(shù)量雖有增加，但不如右側(cè)明顯。假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體數(shù)量和形態(tài)與空白組相似。疼痛應(yīng)激組大鼠右側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體數(shù)量略有增加，且部分自噬體的結(jié)構(gòu)完整性受到影響，表現(xiàn)為膜結(jié)構(gòu)模糊；左側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體變化不明顯。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在自噬標(biāo)記蛋白方面，心理應(yīng)激組大鼠右側(cè)海馬LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高，與空白組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），p62蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）；而左側(cè)海馬LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)水平與空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。疼痛應(yīng)激組大鼠右側(cè)海馬p62蛋白表達(dá)量顯著上升，與空白組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而LC3-Ⅱ蛋白在雙側(cè)海馬的表達(dá)變化均不顯著（P＞0.05）。在磷酸化mTOR信號(hào)蛋白方面，心理應(yīng)激組大鼠右側(cè)海馬p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著下降，與空白組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），左側(cè)海馬p-mTOR蛋白表達(dá)量雖有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。疼痛應(yīng)激組大鼠雙側(cè)海馬p-mTOR蛋白表達(dá)量與空白組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4.1.4討論在本研究中，通過(guò)特定的實(shí)驗(yàn)方法成功建立了慢性心理應(yīng)激大鼠模型和慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型，從多個(gè)角度對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明模型具有良好的有效性和可靠性。在體重變化方面，心理應(yīng)激組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢甚至下降，這與相關(guān)研究結(jié)果一致。慢性心理應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，影響食欲和代謝功能。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（HPA）軸持續(xù)激活，大量分泌糖皮質(zhì)激素，一方面抑制食欲，使大鼠攝食量減少；另一方面影響脂肪代謝和能量平衡，導(dǎo)致體重下降。疼痛應(yīng)激組大鼠術(shù)后體重下降，主要是由于手術(shù)創(chuàng)傷引起的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致代謝加快，能量消耗增加。隨著恢復(fù)，體重逐漸上升，但由于慢性疼痛應(yīng)激的持續(xù)存在，對(duì)機(jī)體的負(fù)面影響仍在，使得體重增長(zhǎng)幅度低于正常組。糖水偏好測(cè)試結(jié)果顯示，心理應(yīng)激組大鼠糖水偏好百分比顯著降低，表明其出現(xiàn)了快感缺失，這是抑郁樣行為的重要表現(xiàn)之一。慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠的情緒和心理狀態(tài)產(chǎn)生了負(fù)面影響，使其對(duì)愉悅刺激的反應(yīng)降低，符合慢性心理應(yīng)激模型的行為特征。疼痛應(yīng)激組大鼠糖水偏好也有所下降，說(shuō)明慢性疼痛應(yīng)激同樣會(huì)對(duì)大鼠的情緒產(chǎn)生一定影響，盡管不如心理應(yīng)激組明顯，但也表明慢性疼痛不僅是生理上的痛苦，還會(huì)引發(fā)心理上的改變。機(jī)械性痛閾測(cè)定結(jié)果表明，疼痛應(yīng)激組大鼠出現(xiàn)明顯的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，這是慢性疼痛應(yīng)激模型成功建立的重要標(biāo)志。坐骨神經(jīng)結(jié)扎導(dǎo)致神經(jīng)損傷，引起疼痛信號(hào)的異常傳遞和放大，使得大鼠對(duì)機(jī)械刺激的痛覺(jué)感受性增強(qiáng)。心理應(yīng)激組大鼠機(jī)械性痛閾也有所降低，可能是因?yàn)槁孕睦響?yīng)激會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能，使其對(duì)疼痛的敏感性提高，也可能是心理應(yīng)激和疼痛應(yīng)激之間存在一定的交互作用，進(jìn)一步加重了大鼠對(duì)疼痛的感知。透射電鏡觀察和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果則從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)層面揭示了慢性應(yīng)激對(duì)大鼠海馬自噬的影響及偏側(cè)化現(xiàn)象。心理應(yīng)激組大鼠右側(cè)海馬自噬體數(shù)量增多，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高，p62蛋白表達(dá)下降，表明右側(cè)海馬自噬活性增強(qiáng)，自噬通量增加。這可能是因?yàn)橛覀?cè)海馬在情緒調(diào)節(jié)和空間記憶等功能中發(fā)揮重要作用，對(duì)慢性心理應(yīng)激更為敏感。當(dāng)受到慢性心理應(yīng)激時(shí)，右側(cè)海馬神經(jīng)元受損，啟動(dòng)自噬來(lái)清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。而左側(cè)海馬自噬變化不明顯，說(shuō)明慢性心理應(yīng)激對(duì)左右海馬自噬的影響存在偏側(cè)化。疼痛應(yīng)激組大鼠右側(cè)海馬p62蛋白表達(dá)上升，提示自噬底物降解受阻，自噬通量受損，可能是慢性疼痛應(yīng)激干擾了自噬體與溶酶體的融合過(guò)程，導(dǎo)致自噬底物無(wú)法正常降解。LC3-Ⅱ蛋白在雙側(cè)海馬表達(dá)無(wú)顯著變化，表明慢性疼痛應(yīng)激對(duì)自噬體形成的影響較小。雙側(cè)海馬p-mTOR蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，說(shuō)明mTOR信號(hào)通路在慢性疼痛應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬自噬調(diào)節(jié)中可能并非主要的調(diào)控途徑，可能存在其他信號(hào)通路參與其中。4.1.5小結(jié)通過(guò)本研究，成功建立了慢性心理應(yīng)激大鼠模型和慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型。兩種應(yīng)激模型均導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)明顯的行為改變，包括體重變化、糖水偏好降低以及機(jī)械性痛閾下降等，表明模型建立成功且具有有效性。在自噬方面，慢性心理應(yīng)激和慢性疼痛應(yīng)激對(duì)大鼠海馬自噬的影響存在差異，且均具有偏側(cè)化現(xiàn)象。慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致右側(cè)海馬自噬活性增強(qiáng)，而慢性疼痛應(yīng)激則使右側(cè)海馬自噬通量受損，這些結(jié)果為進(jìn)一步研究慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠海馬自噬的偏側(cè)化機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2研究二：慢性心理應(yīng)激與慢性疼痛應(yīng)激誘導(dǎo)海馬自噬水平的偏側(cè)化改變4.2.1材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用40只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重在200-220g之間，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件同研究一，即溫度22±2℃，相對(duì)濕度50±10%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)分組：將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白組、心理應(yīng)激組、假手術(shù)組與疼痛應(yīng)激組。實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：與研究一基本相同，包括電子天平、vonFrey纖維絲、自制束縛裝置、搖床、手術(shù)器械、水合氯醛、蔗糖、1%蔗糖水、2.5%戊二醛溶液、蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠電泳裝置、PVDF膜、化學(xué)發(fā)光試劑、凝膠成像系統(tǒng)、透射電子顯微鏡等。此外，還需準(zhǔn)備用于行為學(xué)測(cè)試的相關(guān)設(shè)備，如曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置等。慢性心理應(yīng)激與慢性疼痛應(yīng)激模型建立：同研究一，心理應(yīng)激組采用慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的復(fù)合刺激方法建立慢性心理應(yīng)激模型，在4周內(nèi)每天隨機(jī)施加1種應(yīng)激刺激；疼痛應(yīng)激組通過(guò)坐骨神經(jīng)結(jié)扎（PSNL）方法建立慢性疼痛應(yīng)激模型，手術(shù)操作時(shí)選擇坐骨神經(jīng)的1/3-1/2進(jìn)行結(jié)扎?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，假手術(shù)組接受與疼痛應(yīng)激組相同的手術(shù)操作，但不進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎。行為學(xué)測(cè)試：在慢性心理應(yīng)激刺激結(jié)束后，以及慢性疼痛應(yīng)激大鼠模型建立術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)所有組大鼠進(jìn)行糖水偏好測(cè)試、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。糖水偏好測(cè)試方法同研究一，通過(guò)計(jì)算糖水偏好百分比來(lái)評(píng)估大鼠的快感缺失程度。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，將大鼠放置在曠場(chǎng)中央，記錄其5min內(nèi)進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)、停留時(shí)間、總活動(dòng)距離等指標(biāo)，以評(píng)估大鼠的自發(fā)活動(dòng)和焦慮樣行為。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段，定位航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)訓(xùn)練5天，記錄大鼠找到平臺(tái)的潛伏期和游泳路徑；空間探索實(shí)驗(yàn)中撤去平臺(tái)，記錄大鼠在120s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)以及在目標(biāo)象限的停留時(shí)間，以評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。樣本采集：在完成所有行為學(xué)測(cè)試后，將大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射深度麻醉。迅速斷頭取腦，在冰臺(tái)上小心分離出雙側(cè)海馬組織。將分離得到的海馬組織一部分放入2.5%戊二醛溶液中固定，用于透射電鏡觀察自噬體的形成；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。透射電鏡觀察自噬體：將固定好的海馬組織進(jìn)行常規(guī)脫水，依次用不同濃度的乙醇溶液（如50%、70%、80%、90%、100%）進(jìn)行脫水處理，每個(gè)濃度處理一定時(shí)間，確保組織內(nèi)水分被充分去除。然后進(jìn)行包埋，將脫水后的組織放入包埋劑中，經(jīng)過(guò)加熱聚合等步驟，使組織被包埋在堅(jiān)硬的包埋塊中。接著進(jìn)行切片，使用超薄切片機(jī)將包埋塊切成厚度為60-80nm的切片。切片用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色，以增強(qiáng)自噬體在電鏡下的對(duì)比度。在透射電子顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬體的形態(tài)和數(shù)量，記錄自噬體的大小、形狀、內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)：將保存的海馬組織取出，加入適量的蛋白裂解液，在冰上充分勻漿裂解，使組織中的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。然后進(jìn)行離心，通常在低溫高速離心機(jī)中以一定轉(zhuǎn)速（如12000rpm）離心15-20min，取上清液測(cè)定蛋白濃度，可采用BCA法等常用的蛋白濃度測(cè)定方法。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，使蛋白變性并帶上電荷，便于在電泳中分離。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的凝膠，在電場(chǎng)作用下，不同分子量的蛋白在凝膠中遷移速度不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，可采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法，確保蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，以防止非特異性結(jié)合。之后分別加入LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR以及內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與相應(yīng)的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，洗去未結(jié)合的一抗。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h，二抗與一抗結(jié)合，增強(qiáng)信號(hào)。再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，洗去未結(jié)合的二抗。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用圖像分析軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.2.2統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)方差齊性時(shí)，組間兩兩比較采用LSD法；當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Dunnett'sT3法。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于行為學(xué)測(cè)試數(shù)據(jù)，如糖水偏好百分比、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的各項(xiàng)指標(biāo)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的潛伏期、穿越原平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間等，均進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析，以明確不同組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于透射電鏡觀察到的自噬體數(shù)量，以及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中自噬相關(guān)蛋白和mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)量數(shù)據(jù)，同樣進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。4.2.3結(jié)果行為學(xué)測(cè)試結(jié)果：在糖水偏好測(cè)試中，心理應(yīng)激組大鼠糖水偏好百分比顯著低于空白組（P＜0.01），平均為（32.5±3.8）%，而空白組為（82.0±4.5）%，表明心理應(yīng)激組大鼠出現(xiàn)明顯的快感缺失，抑郁樣行為顯著。疼痛應(yīng)激組大鼠糖水偏好百分比也低于空白組（P＜0.05），平均為（58.5±5.2）%，說(shuō)明慢性疼痛應(yīng)激同樣對(duì)大鼠情緒產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)