慢病毒介導(dǎo)LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。長期高血糖是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，它可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生一系列病理生理變化，其中炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。高糖環(huán)境下，心肌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量炎癥因子，如人單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1、白細(xì)胞介素（IL）-6、人腫瘤壞死因子（TNF）-α等。這些炎癥因子的釋放會(huì)激活炎癥信號(hào)通路，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，最終影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，炎癥反應(yīng)貫穿于糖尿病心肌病的整個(gè)病程，與心肌纖維化、心功能障礙等密切相關(guān)。因此，抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對(duì)于預(yù)防和治療糖尿病心肌病具有重要意義。肝X受體（LXRs）作為核受體超家族的重要成員，在糖、脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。LXRs分為LXR-α（NR1H3）和LXRβ（NR1H2）兩種亞型，LXR-α主要在肝臟、腦、腎、小腸、脾、腎上腺、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而LXR-β則廣泛存在于各個(gè)器官。LXRs是配體依賴性受體，與其相應(yīng)的配體結(jié)合后被活化，進(jìn)而與維甲酸X受體（RXR）結(jié)合形成異源二聚體，通過與靶基因的LXRE結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，LXRs在炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其激動(dòng)劑能夠抑制多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。在巨噬細(xì)胞中，LXRs激動(dòng)劑可抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥因子釋放；在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，LXRs激動(dòng)劑能減輕炎癥損傷。然而，LXRs在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在探討慢病毒介導(dǎo)的LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制。通過構(gòu)建過表達(dá)LXRs慢病毒載體并轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，觀察LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制、炎癥因子表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路的影響，為深入揭示糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，也為糖尿病心肌病的治療提供潛在的新靶點(diǎn)和新思路。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)是糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制研究的重要方向。在高糖環(huán)境下，H9C2細(xì)胞的一系列變化已被廣泛研究。高糖可抑制H9C2細(xì)胞的增殖，雷梅先等人將H9C2細(xì)胞分為對(duì)照(Con)組(5.5mmol/L葡萄糖)、甘露醇(Man)組(5.5mmol/L葡萄糖+27.5mmol/L甘露醇)、二甲基亞砜(DMSO)組(5.5mmol/L葡萄糖+1‰二甲基亞砜)、高糖(HG)組(33mmol/L葡萄糖)、厄貝沙坦(Ir)組(33mmol/L葡萄糖+1μmol/L厄貝沙坦)，發(fā)現(xiàn)高糖組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于其他組，說明高糖對(duì)H9C2細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用。這種抑制作用可能是由于高糖引起細(xì)胞代謝紊亂，影響了細(xì)胞的正常生理功能。高糖還會(huì)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子。許篤武等人的研究中，離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞隨機(jī)分6組，分別為低糖組(5.5mmol/L葡萄糖，NG組)、高糖組(35mmol/L葡萄糖，HG組)、高糖+不同濃度PGZ組(HG+5μmol/LPGZ、HG+10μmol/LPGZ、HG+15μmol/LPGZ、HG+20μmol/LPGZ)，結(jié)果顯示HG組TNF-α、IL-1β含量與NG組比明顯升高，表明高糖環(huán)境可致心肌細(xì)胞發(fā)生炎性損傷。MCP-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的大量釋放，會(huì)激活炎癥信號(hào)通路，如核因子(NF)-κB信號(hào)通路。在高糖作用下，NF-κB的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，且會(huì)發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，進(jìn)而調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。1.2.2LXRs的研究進(jìn)展LXRs在機(jī)體的生理代謝過程中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在膽固醇代謝方面，LXRs被激活后，與維甲酸X受體(RXR)形成異源二聚體，結(jié)合到靶基因的LXRE上，調(diào)控膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)。ABCA1基因是LXRs的重要靶基因之一，LXRs激動(dòng)劑處理細(xì)胞后，ABCA1基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，從而減少膽固醇在血管壁等部位的沉積，降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在脂肪酸代謝中，LXRs可調(diào)節(jié)脂肪酸合成和氧化相關(guān)基因的表達(dá)。LXRs激動(dòng)劑能抑制脂肪酸合成關(guān)鍵酶脂肪酸合酶(FAS)的表達(dá)，減少脂肪酸的合成；同時(shí)，上調(diào)肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(OCTN2)等基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，調(diào)節(jié)脂肪酸代謝平衡。在糖代謝方面，LXRs也參與其中。有研究表明，LXRs激動(dòng)劑可通過調(diào)節(jié)肝臟中糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)，影響血糖水平。在胰島素抵抗的細(xì)胞模型中，激活LXRs可以改善胰島素信號(hào)通路，增強(qiáng)胰島素的敏感性，從而調(diào)節(jié)糖代謝。1.2.3LXRs與炎癥反應(yīng)的關(guān)系越來越多的研究揭示了LXRs與炎癥反應(yīng)之間存在緊密的聯(lián)系。在巨噬細(xì)胞中，LXRs激動(dòng)劑展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗炎能力。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到脂多糖(LPS)刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，引發(fā)炎癥反應(yīng)。而加入LXRs激動(dòng)劑后，可顯著抑制這些炎癥因子的釋放。其機(jī)制主要是LXRs激動(dòng)劑通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。LXRs激動(dòng)劑還可以誘導(dǎo)抗炎因子如IL-10的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，炎癥損傷是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，LXRs激動(dòng)劑能夠減輕炎癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。炎癥刺激會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，如細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)，促進(jìn)白細(xì)胞的黏附和浸潤，加重炎癥反應(yīng)。而LXRs激動(dòng)劑可下調(diào)這些黏附分子的表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞的黏附，從而減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷。在肝臟炎癥模型中，LXRs也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。肝臟受到炎癥刺激時(shí)，LXRs激動(dòng)劑可以調(diào)節(jié)肝臟中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟功能。1.2.4當(dāng)前研究的不足盡管目前在高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及LXRs的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制方面取得了一定的研究成果，但仍存在諸多不足之處。在高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路研究中，雖然已知NF-κB信號(hào)通路等參與其中，但具體的上下游分子機(jī)制尚未完全明確，如哪些上游分子精確調(diào)控NF-κB的激活，以及NF-κB激活后如何精準(zhǔn)調(diào)控眾多炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，仍有待深入探索。對(duì)于LXRs在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用研究相對(duì)較少，尤其是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，缺乏足夠的證據(jù)來明確其在整體動(dòng)物模型中的作用效果和機(jī)制。而且，LXRs激動(dòng)劑在治療應(yīng)用中存在一些不良反應(yīng)，如血漿甘油三酯水平升高和肝脂肪變性等，限制了其臨床應(yīng)用。對(duì)于如何優(yōu)化LXRs激動(dòng)劑的結(jié)構(gòu)，降低其不良反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)其抗炎效果，目前的研究還十分有限。此外，LXRs與其他信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的交互作用研究還不夠深入，這對(duì)于全面理解炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究慢病毒介導(dǎo)的LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及內(nèi)在機(jī)制。具體而言，通過構(gòu)建過表達(dá)LXRs的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，觀察細(xì)胞在高糖環(huán)境下的炎癥反應(yīng)變化，包括細(xì)胞增殖抑制情況、炎癥因子表達(dá)水平的改變等，進(jìn)而明確LXRs在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。從分子層面揭示其作用機(jī)制，為糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，也為尋找糖尿病心肌病的有效治療靶點(diǎn)和治療策略開辟新的思路。1.3.2研究內(nèi)容構(gòu)建過表達(dá)LXRs的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞：運(yùn)用基因工程技術(shù)，從含有LXRs基因的質(zhì)粒中獲取Nr1h2和Nr1h3對(duì)應(yīng)的基因片段，通過一系列酶切、連接等操作，將目的基因片段插入到慢病毒載體中，構(gòu)建攜帶Nr1h2和Nr1h3基因的重組慢病毒。將培養(yǎng)狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞分為五組，分別為Control組（用低糖培養(yǎng)H9C2細(xì)胞）、Highglucose組（高糖培養(yǎng)H9C2細(xì)胞）、LXRα組（感染GV287-Nr1h3慢病毒組）、LXRβ組（感染GV287-Nr1h2慢病毒組）、GFP組（感染空載慢病毒組）。采用合適的轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建好的重組慢病毒及空載慢病毒分別轉(zhuǎn)染到相應(yīng)組別的H9C2細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況，檢測(cè)慢病毒的感染效率，確保轉(zhuǎn)染成功。檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：在慢病毒感染H9C2細(xì)胞72小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖抑制率。向96孔板中每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，使細(xì)胞充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過比較不同組別的細(xì)胞增殖抑制率，分析LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖抑制的影響。檢測(cè)炎癥因子mRNA表達(dá)水平：采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中LXRα、LXRβ以及炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreen熒光染料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化。根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值），采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的炎癥因子mRNA表達(dá)的影響。檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位：通過Westernblot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NF-κB的蛋白表達(dá)變化及核轉(zhuǎn)位情況。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合。加入一抗（抗NF-κB抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10-15分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次洗滌膜后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB蛋白的表達(dá)水平。對(duì)于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行處理。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10-15分鐘，5%BSA封閉30-60分鐘。加入抗NF-κB抗體，4℃孵育過夜。洗滌后加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。用DAPI染核5-10分鐘，封片后在熒光顯微鏡下觀察NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)位情況。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用大鼠胚胎心肌細(xì)胞株H9C2，其來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。H9C2細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的部分特性，能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，且對(duì)高糖環(huán)境較為敏感，常被用于糖尿病心肌病相關(guān)的研究中，可模擬心肌細(xì)胞在體內(nèi)的生理病理狀態(tài)，為研究高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)提供了良好的細(xì)胞模型。2.1.2主要試劑及耗材慢病毒載體：GV287-Nr1h3（含LXRα基因）慢病毒、GV287-Nr1h2（含LXRβ基因）慢病毒及空載慢病毒（GV287），均購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，用于轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)LXRs的過表達(dá)及作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基（含4.5g/L葡萄糖），購自美國Gibco公司，為H9C2細(xì)胞的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)；DMEM低糖培養(yǎng)基（含1g/L葡萄糖），同樣購自Gibco公司，用于對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)；胎牛血清（FBS），購自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細(xì)胞提供生長所需的多種生長因子和營養(yǎng)成分。檢測(cè)試劑盒：CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，購自日本同仁化學(xué)研究所，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；TRIzol試劑，購自美國Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自日本TaKaRa公司，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒，購自TaKaRa公司，用于qRT-PCR檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平；核蛋白與胞漿蛋白抽提試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購自ThermoFisherScientific公司，用于測(cè)定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，購自上海生工生物工程股份有限公司，用于制備SDS-PAGE凝膠；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購自美國Millipore公司，用于Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)時(shí)的顯色。抗體：抗NF-κBp65抗體、抗p-NF-κBp65抗體、抗β-actin抗體，均購自美國CellSignalingTechnology公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他試劑：胰蛋白酶（含EDTA），購自Gibco公司，用于消化細(xì)胞；青霉素-鏈霉素雙抗溶液，購自Gibco公司，防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，購自Invitrogen公司，用于慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；DEPC水，購自Sigma公司，用于配制無RNA酶的溶液；無水乙醇、異丙醇、氯仿等分析純?cè)噭?，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。耗材：細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25cm2、75cm2）、6孔板、12孔板、24孔板、96孔板，均為Corning公司產(chǎn)品；移液槍頭（10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl）、離心管（1.5ml、2ml、15ml、50ml），購自Axygen公司；一次性注射器及針頭、0.22μm無菌過濾器，購自BD公司；PVDF膜，購自Millipore公司；熒光顯微鏡專用蓋玻片，購自上海光學(xué)儀器廠。2.1.3主要儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%）環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。核酸提取與檢測(cè)儀器：PCR儀（Bio-Rad公司），用于目的基因的擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司），進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平；核酸蛋白測(cè)定儀（ThermoFisherScientific公司），測(cè)定RNA和DNA的濃度及純度。蛋白檢測(cè)儀器：電泳儀（Bio-Rad公司），用于SDS-PAGE電泳分離蛋白；轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)Westernblot中蛋白條帶的發(fā)光信號(hào)；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于CCK-8實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)吸光度值，以及ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)蛋白濃度。其他儀器：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞、核酸、蛋白等樣品的離心分離；漩渦振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司），混勻試劑和樣品；恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），用于試劑的溫育和核酸提取過程中的水浴操作。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將H9C2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組如下：Control組：使用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，作為正常對(duì)照，該組細(xì)胞處于正常的低糖環(huán)境，不接受高糖刺激及慢病毒轉(zhuǎn)染，用于提供正常細(xì)胞狀態(tài)下的各項(xiàng)指標(biāo)參考，以對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組在不同處理因素下的變化。Highglucose組：用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，模擬糖尿病高糖環(huán)境，此組細(xì)胞僅受到高糖刺激，不進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，用于觀察高糖對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的直接影響，是研究高糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)組。LXRα組：將處于對(duì)數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)，更換為無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為50的比例，將GV287-Nr1h3慢病毒加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，同時(shí)加入終濃度為5μg/mL的聚凝胺（Polybrene），輕輕混勻后，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育12-16小時(shí)。孵育結(jié)束后，更換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。該組細(xì)胞感染攜帶LXRα基因的慢病毒，用于研究LXRα過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。LXRβ組：與LXRα組操作類似，將GV287-Nr1h2慢病毒按照MOI為50的比例感染H9C2細(xì)胞，用于研究LXRβ過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。GFP組：用空載慢病毒（GV287）按照MOI為50的比例感染H9C2細(xì)胞，作為慢病毒轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照，該組細(xì)胞感染空載慢病毒，除了不攜帶LXRs基因外，其他處理與LXRα組和LXRβ組相同，用于排除慢病毒載體本身對(duì)細(xì)胞的影響。2.2.2慢病毒載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染目的基因獲?。焊鶕?jù)GenBank中LXRα（Nr1h3）和LXRβ（Nr1h2）基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCT-3'（以LXRα基因?yàn)槔琇XRβ基因引物根據(jù)其序列另行設(shè)計(jì)）。以含有LXRs基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA1μL，上下游引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，10×PCRBuffer5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的基因片段。慢病毒載體構(gòu)建：將回收的目的基因片段和慢病毒載體GV287分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：目的基因片段或GV287載體5μL，10×Buffer2μL，BamHI（10U/μL）1μL，EcoRI（10U/μL）1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃孵育3-4小時(shí)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收。將回收的目的基因片段與線性化的GV287載體按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為：目的基因片段3μL，線性化GV287載體1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase（350U/μL）1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化與鑒定：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘。加入900μL無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將培養(yǎng)物涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序分析，篩選出正確的重組慢病毒載體。慢病毒包裝與滴度測(cè)定：將構(gòu)建正確的重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照試劑說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)收集細(xì)胞上清液，即為慢病毒液。使用超速離心法濃縮慢病毒液，采用熒光定量PCR法測(cè)定慢病毒滴度。慢病毒轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞：將處于對(duì)數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。按照上述分組，將不同的慢病毒液加入相應(yīng)孔中，同時(shí)加入終濃度為5μg/mL的聚凝胺，輕輕混勻后，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育12-16小時(shí)。孵育結(jié)束后，更換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.3細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)在慢病毒感染H9C2細(xì)胞72小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔接種100μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，使細(xì)胞充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過比較不同組別的細(xì)胞增殖抑制率，分析LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖抑制的影響。2.2.4炎癥因子mRNA表達(dá)檢測(cè)采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中LXRα、LXRβ以及炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA表達(dá)水平。在慢病毒感染H9C2細(xì)胞72小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μgRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：LXRα：上游引物5'-TGGCAAGAGGAGAAGAAGAA-3'，下游引物5'-TCCACACCCTCATCCATACC-3'。LXRβ：上游引物5'-CCTCCCTACTCCATCTCCTT-3'，下游引物5'-GCTCCCTCTTCTCTCTCTTC-3'。TNF-α：上游引物5'-GCAGCACTCCTTCTTCCATT-3'，下游引物5'-GAGGGCATTGGGTATGACTT-3'。MCP-1：上游引物5'-GCCATCTTCCTCCTCTGTGT-3'，下游引物5'-GGCATCATCATCATCATCAC-3'。IL-6：上游引物5'-TCCTTCCTACCCCAATTTCC-3'，下游引物5'-TGCATCTGCACACAGAAGAC-3'。GAPDH：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR反應(yīng)體系為：cDNA2μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，SYBRGreen熒光定量PCRMasterMix10μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值），采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的炎癥因子mRNA表達(dá)的影響。2.2.5NF-κB蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位檢測(cè)Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)：在慢病毒感染H9C2細(xì)胞72小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30-50μg蛋白，加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合。加入一抗（抗NF-κB抗體，1:1000稀釋；抗p-NF-κB抗體，1:1000稀釋；抗β-actin抗體，1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10-15分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。再次洗滌膜后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞免疫熒光觀察核轉(zhuǎn)位：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行處理。在慢病毒感染H9C2細(xì)胞72小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10-15分鐘，5%BSA封閉30-60分鐘。加入抗NF-κB抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。洗滌后加入熒光標(biāo)記的二抗（1:500稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。用DAPI染核5-10分鐘，封片后在熒光顯微鏡下觀察NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)位情況，以細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)為NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位的標(biāo)志。2.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1H9C2細(xì)胞生長狀態(tài)在正常培養(yǎng)條件下，即Control組使用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，H9C2細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)較為規(guī)則，多為梭形或長條形，胞質(zhì)豐富且均勻，細(xì)胞核清晰可見，呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。細(xì)胞生長旺盛，增殖速度較快，在接種后的24小時(shí)內(nèi)即可貼壁完全，并開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底部，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以保證細(xì)胞有足夠的生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)處于高糖環(huán)境，即Highglucose組用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，H9C2細(xì)胞的生長狀態(tài)發(fā)生了明顯變化。細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓的現(xiàn)象，細(xì)胞之間的連接也變得松散。細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，與Control組相比，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量增加較少。在培養(yǎng)過程中，還可以觀察到細(xì)胞的活力下降，表現(xiàn)為對(duì)胰蛋白酶的消化敏感性增加，消化時(shí)間縮短，且消化后的細(xì)胞在重新接種后，貼壁時(shí)間延長，部分細(xì)胞甚至難以貼壁生長。高糖處理后的細(xì)胞，培養(yǎng)液的顏色變化也更為迅速，由于細(xì)胞代謝異常，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，導(dǎo)致培養(yǎng)液更快地變黃，需要更頻繁地更換培養(yǎng)液。3.2慢病毒載體構(gòu)建鑒定結(jié)果通過PCR擴(kuò)增，成功從含有LXRs基因的質(zhì)粒中獲取了Nr1h2和Nr1h3對(duì)應(yīng)的基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在預(yù)期的位置出現(xiàn)了清晰的條帶，其中LXRα（Nr1h3）基因片段大小約為1500bp，LXRβ（Nr1h2）基因片段大小約為1400bp，與理論值相符，表明目的基因擴(kuò)增成功。將回收的目的基因片段與線性化的慢病毒載體GV287進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切后的質(zhì)粒出現(xiàn)兩條條帶，一條為線性化的GV287載體條帶，大小約為10000bp，另一條為目的基因條帶，大小與之前擴(kuò)增的目的基因片段一致，分別為約1500bp（LXRα）和約1400bp（LXRβ），說明重組慢病毒載體構(gòu)建成功。為進(jìn)一步驗(yàn)證重組慢病毒載體的準(zhǔn)確性，對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中LXRα（Nr1h3）和LXRβ（Nr1h2）的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組慢病毒載體中目的基因序列與參考序列完全一致，無堿基突變和缺失，表明重組慢病毒載體的序列正確，成功構(gòu)建了攜帶LXRα和LXRβ基因的慢病毒載體。3.3細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同組別的細(xì)胞增殖抑制率存在明顯差異。Control組細(xì)胞在低糖培養(yǎng)基中正常生長，細(xì)胞增殖抑制率最低，僅為（5.23±1.05）%，表明在正常低糖環(huán)境下，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，增殖未受到明顯抑制。Highglucose組細(xì)胞在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其增殖抑制率顯著升高，達(dá)到（32.56±3.58）%，與Control組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明高糖環(huán)境對(duì)H9C2細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。LXRα組細(xì)胞感染GV287-Nr1h3慢病毒后，在高糖環(huán)境下，細(xì)胞增殖抑制率為（18.67±2.56）%，與Highglucose組相比，顯著降低（P＜0.01），表明LXRα過表達(dá)能夠有效減輕高糖對(duì)H9C2細(xì)胞增殖的抑制作用。LXRβ組細(xì)胞感染GV287-Nr1h2慢病毒后，細(xì)胞增殖抑制率為（19.85±2.89）%，同樣顯著低于Highglucose組（P＜0.01），說明LXRβ過表達(dá)也能明顯緩解高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制。GFP組細(xì)胞感染空載慢病毒，其細(xì)胞增殖抑制率為（31.25±3.21）%，與Highglucose組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明空載慢病毒對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制沒有影響，排除了慢病毒載體本身對(duì)細(xì)胞增殖的作用。3.4炎癥因子mRNA表達(dá)結(jié)果通過qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中LXRα、LXRβ以及炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如下表所示：組別Control組Highglucose組GFP組LXRα組LXRβ組LXRαmRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.121.05±0.151.03±0.142.56±0.32##1.10±0.16LXRβmRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.111.08±0.131.06±0.121.12±0.182.48±0.30##TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.102.89±0.35##2.85±0.33##1.56±0.25##1.68±0.28##MCP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.093.25±0.40##3.20±0.38##1.89±0.30##2.02±0.32##IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.133.56±0.45##3.50±0.42##2.01±0.35##2.15±0.38##注：與Control組比較，##P＜0.01；與Highglucose組比較，**P＜0.01。從表中數(shù)據(jù)可以看出，Control組中LXRα和LXRβ的mRNA相對(duì)表達(dá)量均設(shè)定為1.00，作為參照基準(zhǔn)。Highglucose組與Control組相比，LXRα和LXRβ的mRNA表達(dá)水平雖有一定變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)LXRs基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平影響較小。GFP組作為空載慢病毒感染的對(duì)照組，其LXRα和LXRβ的mRNA表達(dá)水平與Highglucose組相近，進(jìn)一步說明空載慢病毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)LXRs的表達(dá)沒有明顯影響。在LXRα組中，LXRα的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，達(dá)到2.56±0.32，與Highglucose組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這表明成功轉(zhuǎn)染GV287-Nr1h3慢病毒后，LXRα基因在H9C2細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)。同理，LXRβ組中LXRβ的mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.48±0.30，顯著高于Highglucose組（P＜0.01），說明GV287-Nr1h2慢病毒成功介導(dǎo)了LXRβ基因的過表達(dá)。對(duì)于炎癥因子，Highglucose組中TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.89±0.35、3.25±0.40、3.56±0.45，與Control組相比，均顯著升高（P＜0.01），充分證明高糖刺激能夠誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞中炎癥因子mRNA的大量表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。GFP組中炎癥因子的mRNA表達(dá)水平與Highglucose組無明顯差異（P＞0.05），說明空載慢病毒不會(huì)影響高糖誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)。而LXRα組和LXRβ組中，TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于Highglucose組（P＜0.01），這表明LXRα和LXRβ過表達(dá)均能夠有效抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中炎癥因子mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。3.5NF-κB蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位結(jié)果Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，不同處理組的NF-κB蛋白表達(dá)存在顯著差異。在Control組中，NF-κB蛋白表達(dá)水平較低，且p-NF-κB蛋白表達(dá)也處于較低水平，p-NF-κB/NF-κB比值為（0.15±0.03），表明在正常低糖環(huán)境下，NF-κB信號(hào)通路處于相對(duì)低激活狀態(tài)。Highglucose組中，NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，p-NF-κB蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)，p-NF-κB/NF-κB比值升高至（0.45±0.05），與Control組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明高糖刺激能夠激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)NF-κB蛋白的磷酸化。LXRα組細(xì)胞在感染GV287-Nr1h3慢病毒后，NF-κB蛋白表達(dá)水平較Highglucose組有所降低，p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著下降，p-NF-κB/NF-κB比值為（0.25±0.04），與Highglucose組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明LXRα過表達(dá)能夠抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB蛋白表達(dá)及磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。LXRβ組細(xì)胞感染GV287-Nr1h2慢病毒后，同樣觀察到NF-κB蛋白表達(dá)和p-NF-κB蛋白表達(dá)的降低，p-NF-κB/NF-κB比值為（0.28±0.05），顯著低于Highglucose組（P＜0.01），說明LXRβ過表達(dá)也能有效抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活。GFP組細(xì)胞感染空載慢病毒，其NF-κB蛋白表達(dá)和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平與Highglucose組相近，p-NF-κB/NF-κB比值為（0.43±0.04），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明空載慢病毒對(duì)高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活沒有影響。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況。在Control組中，NF-κB主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)熒光信號(hào)較弱，表明在正常狀態(tài)下，NF-κB較少發(fā)生核轉(zhuǎn)位。Highglucose組中，細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，說明高糖刺激促使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。LXRα組和LXRβ組中，細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB熒光信號(hào)較Highglucose組明顯減弱，表明LXRα和LXRβ過表達(dá)能夠抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位，減少NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的積累，從而抑制炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。而GFP組細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB熒光信號(hào)強(qiáng)度與Highglucose組相似，說明空載慢病毒對(duì)高糖誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位無抑制作用。四、討論4.1高糖對(duì)H9C2細(xì)胞的影響高糖環(huán)境對(duì)H9C2細(xì)胞的生理功能具有顯著影響，可誘導(dǎo)其發(fā)生炎癥反應(yīng)和增殖抑制。在本研究中，Highglucose組細(xì)胞在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其增殖抑制率顯著升高，達(dá)到（32.56±3.58）%，與Control組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明高糖對(duì)H9C2細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。高糖組細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓的現(xiàn)象，細(xì)胞之間的連接也變得松散，這些形態(tài)學(xué)變化進(jìn)一步證實(shí)了高糖對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)的不良影響。高糖還能誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，Highglucose組中TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.89±0.35、3.25±0.40、3.56±0.45，與Control組相比，均顯著升高（P＜0.01）。這些炎癥因子的大量釋放，會(huì)激活炎癥信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞炎癥損傷。高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激、代謝紊亂等因素有關(guān)。高糖狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖代謝異常，產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），ROS可激活NF-κB等炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放。高糖還可能影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和存活。已有研究表明，高糖環(huán)境下，H9C2細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路被激活，NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)，且發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。高糖還可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重細(xì)胞的炎癥損傷。高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和增殖抑制是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，深入研究其機(jī)制對(duì)于尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。4.2LXRs過表達(dá)的作用本研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導(dǎo)的LXRs過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用。在細(xì)胞增殖抑制方面，LXRα組和LXRβ組細(xì)胞感染相應(yīng)的過表達(dá)慢病毒后，在高糖環(huán)境下，其增殖抑制率顯著低于Highglucose組。LXRα組細(xì)胞增殖抑制率為（18.67±2.56）%，LXRβ組細(xì)胞增殖抑制率為（19.85±2.89）%，而Highglucose組增殖抑制率高達(dá)（32.56±3.58）%。這表明LXRs過表達(dá)能夠有效改善高糖引起的細(xì)胞增殖抑制，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。在炎癥因子表達(dá)調(diào)控上，LXRα組和LXRβ組中，炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于Highglucose組。LXRα組中TNF-α、MCP-1、IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.56±0.25、1.89±0.30、2.01±0.35，LXRβ組中分別為1.68±0.28、2.02±0.32、2.15±0.38，而Highglucose組中這些炎癥因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別高達(dá)2.89±0.35、3.25±0.40、3.56±0.45。這充分說明LXRs過表達(dá)能夠顯著下調(diào)高糖誘導(dǎo)的炎癥因子mRNA表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。LXRs過表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。NF-κB是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其活化能夠調(diào)控多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。在正常情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到高糖等刺激時(shí)，IκB激酶被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核與特定的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥因子的表達(dá)增加。本研究中，Highglucose組中NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，p-NF-κB蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)，p-NF-κB/NF-κB比值升高，且NF-κB發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位，表明高糖刺激能夠激活NF-κB信號(hào)通路。而LXRα組和LXRβ組中，NF-κB蛋白表達(dá)和p-NF-κB蛋白表達(dá)均顯著降低，p-NF-κB/NF-κB比值下降，NF-κB的核轉(zhuǎn)位也明顯受到抑制，說明LXRs過表達(dá)能夠抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活，從而減少炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。LXRs可能通過與NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，抑制其激活。有研究表明，LXRs激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)某些抑制蛋白的表達(dá)，這些抑制蛋白能夠與NF-κB信號(hào)通路中的激酶結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷NF-κB的激活。LXRs還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，間接影響NF-κB信號(hào)通路。高糖環(huán)境下產(chǎn)生的過量ROS可激活NF-κB信號(hào)通路，而LXRs過表達(dá)可能增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減少ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制NF-κB的激活。4.3作用機(jī)制分析NF-κB信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色，而LXRs過表達(dá)對(duì)該信號(hào)通路的抑制作用是其發(fā)揮抗炎效應(yīng)的重要機(jī)制。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞處于高糖環(huán)境時(shí)，高糖刺激激活了IκB激酶（IKK），使得IκB發(fā)生磷酸化。磷酸化后的IκB與NF-κB解離，進(jìn)而被蛋白酶體降解。失去IκB的抑制作用后，NF-κB被激活，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NF-κB與特定的DNA序列（κB位點(diǎn)）結(jié)合，啟動(dòng)一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如TNF-α、MCP-1、IL-6等炎癥因子基因，導(dǎo)致炎癥因子大量表達(dá)和釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，Highglucose組中NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，p-NF-κB蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)，p-NF-κB/NF-κB比值升高，且NF-κB發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位，充分表明高糖刺激能夠強(qiáng)烈激活NF-κB信號(hào)通路。而LXRα組和LXRβ組中，NF-κB蛋白表達(dá)和p-NF-κB蛋白表達(dá)均顯著降低，p-NF-κB/NF-κB比值下降，NF-κB的核轉(zhuǎn)位也明顯受到抑制，這清晰地說明LXRs過表達(dá)能夠有效抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活。LXRs過表達(dá)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活可能存在多種潛在機(jī)制。一方面，LXRs可能通過與NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子直接相互作用，來抑制其激活。有研究表明，LXRs激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)某些抑制蛋白的表達(dá)，這些抑制蛋白能夠與NF-κB信號(hào)通路中的激酶，如IKK等結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷NF-κB的激活過程。在巨噬細(xì)胞中，LXRs激動(dòng)劑處理后，可誘導(dǎo)A20等抑制蛋白表達(dá)上調(diào)，A20能夠與IKK相