戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗免疫原性的深度剖析與前景展望一、引言1.1研究背景與意義戊型肝炎（HepatitisE）作為一種全球性的公共衛(wèi)生問題，近年來受到了廣泛關(guān)注。它是由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）引發(fā)的急性肝臟炎癥，主要通過糞-口途徑傳播，如食用被病毒污染的水源或食物。HEV感染在全球范圍內(nèi)廣泛分布，尤其在衛(wèi)生條件較差、缺乏安全飲用水和良好衛(wèi)生設(shè)施的發(fā)展中國家，發(fā)病率居高不下。例如，在印度次大陸等地區(qū)，戊型肝炎時常爆發(fā)大規(guī)模流行，嚴重威脅當?shù)鼐用竦慕】?。戊型肝炎的危害不容小覷。多數(shù)情況下，戊型肝炎患者癥狀相對較輕，表現(xiàn)為疲乏、食欲減退、厭油、黃疸等，經(jīng)過適當治療和休息可以康復(fù)。然而，在特定人群中，戊型肝炎卻可能引發(fā)嚴重后果。對于孕婦而言，感染戊型肝炎病毒后，病情往往迅速惡化，發(fā)展為重癥肝炎的風險顯著增加，病死率可高達15%-25%，這對母嬰健康構(gòu)成了極大威脅，甚至可能導致孕婦死亡和胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)等悲劇。慢性肝病患者感染戊肝后，也會加重肝臟損傷，加速病情進展，增加肝硬化、肝衰竭和肝癌的發(fā)生風險。老年人由于身體機能衰退，免疫系統(tǒng)功能減弱，感染戊肝后同樣容易發(fā)展為重癥，預(yù)后較差。目前，預(yù)防戊型肝炎最有效的手段是接種疫苗。自2011年全球首個重組戊型肝炎疫苗在中國獲批上市以來，疫苗在預(yù)防戊肝感染方面發(fā)揮了重要作用。然而，現(xiàn)有的戊肝疫苗仍存在一些局限性。傳統(tǒng)的戊肝疫苗主要是基于單一抗原的設(shè)計，隨著時間推移，其誘導的免疫反應(yīng)可能逐漸減弱，難以提供長期、持久的保護效果，部分人群接種后免疫應(yīng)答不理想，無法獲得足夠的免疫力。因此，研發(fā)新型戊肝疫苗以克服這些不足，成為當前戊肝防治領(lǐng)域的研究熱點。蛋白-核酸復(fù)合疫苗作為一種新興的疫苗策略，結(jié)合了蛋白質(zhì)疫苗和核酸疫苗的優(yōu)勢，展現(xiàn)出巨大的潛力。蛋白質(zhì)疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，中和病毒，而核酸疫苗則可以在體內(nèi)持續(xù)表達抗原，激活細胞免疫反應(yīng)，增強免疫記憶。將兩者結(jié)合，有望誘導更全面、更持久的免疫應(yīng)答，提高疫苗的免疫原性和保護效果。本研究聚焦于戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗免疫原性的初步探究，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。從理論層面來看，深入了解蛋白-核酸復(fù)合疫苗在體內(nèi)的免疫激活機制，有助于豐富我們對疫苗免疫原性的認識，為疫苗設(shè)計和優(yōu)化提供理論依據(jù)。在實際應(yīng)用中，若能成功開發(fā)出免疫原性良好的戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗，將為戊肝的預(yù)防和控制提供更有力的武器，有效降低戊型肝炎的發(fā)病率和死亡率，減輕公共衛(wèi)生負擔，尤其是對孕婦、慢性肝病患者和老年人等高危人群，具有重要的保護意義。1.2戊型肝炎病毒概述戊型肝炎病毒（HEV）是引發(fā)戊型肝炎的病原體，在病毒學分類中，它屬于戊肝病毒科戊肝病毒屬。其病毒粒子呈現(xiàn)球狀結(jié)構(gòu)，并且不具備包膜，平均直徑處于32-34nm范圍，在電子顯微鏡下觀察，病毒表面存在鋸齒狀刻缺和突起，外觀類似杯狀，這一獨特的形態(tài)特征使其在病毒家族中具有一定的辨識度。HEV對外部環(huán)境條件較為敏感，在高鹽、氯化銫、三氯甲烷等環(huán)境中，其病毒結(jié)構(gòu)容易受到破壞。例如，在高鹽環(huán)境下，病毒的蛋白質(zhì)外殼可能會發(fā)生變性，從而影響其感染能力；在三氯甲烷等有機溶劑中，病毒的脂質(zhì)成分會被溶解，導致病毒失去活性。在-70~8℃條件下，HEV粒子易裂解，這表明該病毒在這樣的溫度區(qū)間內(nèi)穩(wěn)定性較差，病毒的完整性難以維持，進而影響其生存和傳播。不過，在液氮中，HEV卻能保持穩(wěn)定狀態(tài)，液氮提供的超低溫環(huán)境為病毒的長期保存提供了可能，這在病毒研究和疫苗研發(fā)過程中，對于病毒樣本的保存具有重要意義，科研人員可以利用液氮保存的病毒樣本進行深入的病毒特性研究和疫苗開發(fā)實驗。HEV的基因組為單正鏈RNA，全長大約7.5kb，并且具有polyA尾結(jié)構(gòu)。這種RNA結(jié)構(gòu)在病毒的生命周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它包含了病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程所需的遺傳信息。整個基因組共有3個開放閱讀框架（ORF），其中ORF1主要負責編碼病毒復(fù)制所必需的依賴RNA的RNA多聚酶等非結(jié)構(gòu)蛋白。這些非結(jié)構(gòu)蛋白對于病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制過程至關(guān)重要，它們參與了病毒RNA的合成、加工和調(diào)控等多個環(huán)節(jié)，是病毒能夠在宿主細胞內(nèi)大量繁殖的關(guān)鍵因素。ORF2則編碼病毒的衣殼蛋白，衣殼蛋白是構(gòu)成病毒粒子外殼的主要成分，它不僅對病毒的遺傳物質(zhì)起到保護作用，使其免受外界環(huán)境因素的破壞，還在病毒與宿主細胞的識別和結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，決定了病毒的感染特異性和感染效率。ORF3與ORF1和ORF2存在部分重疊區(qū)域，其編碼的多肽可能具有型特異性抗原表位，這些抗原表位能夠被宿主免疫系統(tǒng)識別，引發(fā)特異性免疫反應(yīng)，在病毒的診斷和疫苗研發(fā)中具有重要價值，通過檢測這些抗原表位，能夠?qū)崿F(xiàn)對戊型肝炎病毒感染的準確診斷，而在疫苗設(shè)計中，針對這些抗原表位的設(shè)計可以提高疫苗的免疫原性和特異性。目前已知HEV至少存在8個基因型，不同基因型的HEV在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出不同的分布特點。其中，基因型Ⅰ和基因型Ⅱ分別以緬甸株（HEV-B）和墨西哥株（HEV-M）為代表，這兩種基因型主要在亞洲和非洲等地區(qū)流行，這些地區(qū)的衛(wèi)生條件相對較差，缺乏安全的飲用水和良好的衛(wèi)生設(shè)施，為病毒的傳播提供了有利條件。在印度次大陸，由于人口密集、衛(wèi)生基礎(chǔ)設(shè)施薄弱，基因型Ⅰ的HEV傳播較為廣泛，經(jīng)常引發(fā)戊型肝炎的大規(guī)模流行?；蛐廷蠛突蛐廷魟t主要在歐美等發(fā)達國家以及亞洲部分地區(qū)流行，這些地區(qū)雖然衛(wèi)生條件相對較好，但由于人獸共患的傳播途徑，如食用未煮熟的感染HEV的豬肉等，仍然存在一定的感染風險。在一些歐美國家，隨著人們飲食習慣的改變，生食或半生食肉類的現(xiàn)象逐漸增多，這使得基因型Ⅲ和基因型Ⅳ的HEV感染病例有所增加。不同基因型的HEV在致病性和傳播能力上可能存在差異，這也為戊型肝炎的防控帶來了挑戰(zhàn)，需要針對不同基因型的特點制定相應(yīng)的防控策略。戊型肝炎病毒主要通過糞-口途徑傳播，這是其最主要的傳播方式。HEV感染者以及攜帶病毒的豬等動物，均可從糞便中排出HEV，這些含有病毒的糞便一旦污染了水源、食物和周圍環(huán)境，健康人誤食或接觸后就可能導致感染。在一些衛(wèi)生條件惡劣的地區(qū)，污水排放不當，導致水源被含有HEV的糞便污染，居民飲用這樣的水源后，極易感染戊型肝炎病毒。在一些發(fā)展中國家的農(nóng)村地區(qū)，由于缺乏完善的污水處理系統(tǒng)，河流、井水等水源經(jīng)常受到污染，成為戊型肝炎傳播的重要隱患。食用被病毒污染的食物也是常見的感染途徑，如蔬菜、水果在種植、采摘或加工過程中接觸到含有病毒的糞便，未經(jīng)徹底清洗和烹飪就被食用，就可能引發(fā)感染。除了糞-口途徑外，戊型肝炎病毒還存在其他傳播途徑。研究表明，戊型肝炎病毒可以通過母嬰垂直傳播，孕婦感染HEV后，病毒有可能通過胎盤或分娩過程傳播給胎兒，對胎兒的健康造成嚴重威脅，可能導致胎兒發(fā)育異常、早產(chǎn)、流產(chǎn)等不良后果。戊型肝炎病毒還可能通過血液傳播，如輸血、器官移植等過程中，如果供體血液或器官中含有HEV，就可能將病毒傳播給受體。在一些醫(yī)療條件落后的地區(qū)，由于血液篩查不嚴格，輸血傳播戊型肝炎的風險相對較高。密切接觸傳播也是戊型肝炎病毒的一種傳播方式，家庭成員或醫(yī)護人員與感染者密切接觸，如共用生活用品、照顧感染者等，也有可能被感染。戊型肝炎病毒的傳播給人類健康帶來了嚴重威脅。在全球范圍內(nèi)，戊型肝炎的發(fā)病率一直居高不下，尤其在發(fā)展中國家，由于衛(wèi)生條件和醫(yī)療資源的限制，戊型肝炎的流行更為廣泛。在一些非洲國家，由于缺乏清潔的飲用水和基本的衛(wèi)生設(shè)施，戊型肝炎的發(fā)病率長期處于高位，嚴重影響當?shù)鼐用竦纳钯|(zhì)量和健康水平。戊型肝炎的爆發(fā)不僅會給患者個人帶來身體上的痛苦和經(jīng)濟負擔，還會對整個社會的公共衛(wèi)生安全造成沖擊。在疫情爆發(fā)期間，醫(yī)療資源會面臨巨大壓力，醫(yī)院需要投入大量的人力、物力和財力來救治患者，同時，疫情還可能導致社會恐慌，影響正常的生產(chǎn)生活秩序。對于孕婦、慢性肝病患者和老年人等特殊人群，戊型肝炎病毒感染的危害更為嚴重。孕婦感染HEV后，病情往往容易惡化，發(fā)展為重癥肝炎的風險顯著增加，病死率可高達15%-25%，這不僅會危及孕婦的生命安全，還會對胎兒的發(fā)育和生存造成嚴重影響。慢性肝病患者本身肝臟功能已經(jīng)受損，感染戊型肝炎病毒后，會進一步加重肝臟負擔，加速病情進展，增加肝硬化、肝衰竭和肝癌的發(fā)生風險。老年人由于身體機能衰退，免疫系統(tǒng)功能減弱，感染戊型肝炎病毒后，更容易發(fā)展為重癥，且預(yù)后較差，恢復(fù)過程緩慢，生活質(zhì)量受到極大影響。1.3疫苗研究現(xiàn)狀目前，戊型肝炎疫苗的研發(fā)取得了一定成果，市面上已有的戊型肝炎疫苗主要包括重組蛋白疫苗和滅活疫苗。重組蛋白疫苗通過基因工程技術(shù)，將戊型肝炎病毒的特定抗原基因?qū)氡磉_系統(tǒng)，使其表達出具有免疫原性的蛋白質(zhì)。中國研發(fā)的重組戊型肝炎疫苗（大腸埃希菌）便是這類疫苗的典型代表，它利用大腸埃希菌表達戊型肝炎病毒的ORF2蛋白，經(jīng)純化等工藝制成疫苗。臨床研究表明，該疫苗在接種后能夠有效刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，對戊型肝炎的預(yù)防效果顯著，在大規(guī)模臨床試驗中，接種該疫苗的人群戊型肝炎發(fā)病率明顯低于未接種人群。滅活疫苗則是通過物理或化學方法將戊型肝炎病毒滅活，使其失去感染性但保留免疫原性。不過，無論是重組蛋白疫苗還是滅活疫苗，都存在一定的局限性。這些傳統(tǒng)疫苗在免疫持久性方面表現(xiàn)欠佳，隨著時間的推移，接種者體內(nèi)的抗體水平會逐漸下降，需要定期加強接種才能維持有效的免疫保護。部分人群對傳統(tǒng)疫苗的免疫應(yīng)答較弱，無法產(chǎn)生足夠的抗體來抵御病毒感染，這限制了疫苗的廣泛應(yīng)用。為了克服傳統(tǒng)疫苗的不足，新型戊型肝炎疫苗的研發(fā)成為研究熱點，其中蛋白-核酸復(fù)合疫苗備受關(guān)注。蛋白-核酸復(fù)合疫苗巧妙地結(jié)合了蛋白質(zhì)疫苗和核酸疫苗的優(yōu)勢。蛋白質(zhì)疫苗具有良好的免疫原性，能夠誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體可以與病毒表面的抗原結(jié)合，中和病毒，阻止其感染宿主細胞。核酸疫苗則可以在體內(nèi)持續(xù)表達抗原，激活細胞免疫反應(yīng)，增強免疫記憶。以DNA疫苗為例，它將編碼戊型肝炎病毒抗原的基因直接導入宿主細胞，利用宿主細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制表達抗原，從而激發(fā)細胞免疫反應(yīng)，使機體產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞，這些細胞能夠識別并殺傷被病毒感染的細胞，有效清除體內(nèi)的病毒。將蛋白質(zhì)疫苗和核酸疫苗聯(lián)合使用，能夠在體液免疫和細胞免疫兩個層面同時發(fā)揮作用，誘導更全面、更持久的免疫應(yīng)答。蛋白質(zhì)疫苗激發(fā)的抗體可以迅速中和進入體內(nèi)的病毒，而核酸疫苗激活的細胞免疫則可以清除被病毒感染的細胞，防止病毒在體內(nèi)的持續(xù)復(fù)制和擴散，兩者相輔相成，有望提高疫苗的免疫原性和保護效果。戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗的研究具有重要的必要性。從公共衛(wèi)生角度來看，戊型肝炎在全球范圍內(nèi)的廣泛傳播，尤其是在發(fā)展中國家的高發(fā)病率，對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。研發(fā)更有效的疫苗對于控制戊型肝炎的流行、降低發(fā)病率和死亡率具有重要意義。對于孕婦、慢性肝病患者和老年人等高危人群，傳統(tǒng)疫苗的保護效果有限，而蛋白-核酸復(fù)合疫苗有望為他們提供更可靠的保護。從疫苗技術(shù)發(fā)展的角度來看，蛋白-核酸復(fù)合疫苗代表了疫苗研發(fā)的新方向，深入研究這類疫苗的免疫原性和作用機制，有助于推動疫苗技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，為其他傳染病疫苗的研發(fā)提供借鑒和思路。二、戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗的構(gòu)建2.1相關(guān)抗原表位的確定在前期研究中，本團隊運用多種先進技術(shù)，成功將戊型肝炎病毒的中和抗原表位定位在HEVORF2編碼蛋白C端的452-617氨基酸之間，且確定其為構(gòu)象依賴型表位。這一成果的取得，得益于一系列前沿技術(shù)的綜合運用。利用His融合靶抗原的原核表達技術(shù)，能夠高效表達出帶有His標簽的靶抗原，方便后續(xù)的分離與純化?？乖璵apping技術(shù)則通過對蛋白質(zhì)抗原表位的精細分析，精確地確定了中和抗原表位的位置范圍?；赑CR的體外中和試驗，為確定該表位是否具有中和活性提供了直接證據(jù)，通過在體外模擬病毒感染過程，觀察抗體對病毒感染的中和作用，從而驗證了該表位的關(guān)鍵作用。這一中和抗原表位的確定，在戊型肝炎疫苗的構(gòu)建中具有不可替代的關(guān)鍵作用。從免疫原性角度來看，它是激發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的核心區(qū)域，能夠誘導機體產(chǎn)生具有中和活性的抗體，這些抗體可以特異性地識別并結(jié)合戊型肝炎病毒表面的中和抗原表位，從而阻斷病毒與宿主細胞的結(jié)合，中和病毒的感染性，為機體提供有效的免疫保護。在疫苗設(shè)計中，針對這一表位進行設(shè)計，可以顯著提高疫苗的免疫原性和特異性。通過將包含該中和抗原表位的基因片段或蛋白質(zhì)作為疫苗的關(guān)鍵成分，能夠更精準地刺激機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生針對戊型肝炎病毒的特異性免疫反應(yīng)，增強疫苗的預(yù)防效果。對這一表位的深入了解，還有助于優(yōu)化疫苗的制備工藝和質(zhì)量控制標準，確保疫苗的安全性和有效性。2.2重組蛋白P179的制備與特性為了獲得具有良好免疫原性的重組蛋白P179，本研究采用了原核表達系統(tǒng)，具體選用大腸桿菌作為表達宿主。這是因為大腸桿菌具有生長迅速、易于培養(yǎng)、遺傳背景清晰等優(yōu)點，能夠高效表達外源蛋白，并且成本相對較低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。將編碼P179的基因片段導入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，構(gòu)建了重組表達菌株。在轉(zhuǎn)化過程中，利用熱激法或電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導入感受態(tài)細胞，使細胞攝取外源DNA。通過在含有卡那霉素的LB平板上篩選，挑取單菌落進行培養(yǎng)和鑒定，確保獲得含有正確重組質(zhì)粒的菌株。將重組表達菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時細胞生長旺盛，代謝活躍，有利于外源蛋白的表達。隨后，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導表達。IPTG作為一種誘導劑，能夠與阻遏蛋白結(jié)合，解除對啟動子的抑制，從而啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在誘導過程中，通過優(yōu)化誘導條件，如IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度等，以提高P179的表達量和可溶性。研究發(fā)現(xiàn)，當IPTG濃度為0.5mmol/L，誘導時間為4小時，誘導溫度為30℃時，P179的表達量和可溶性達到最佳狀態(tài)。在該條件下，P179蛋白能夠以可溶形式大量表達，有利于后續(xù)的分離和純化。誘導表達結(jié)束后，對菌體進行超聲破碎，使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。超聲破碎過程中，要注意控制超聲功率和時間，避免蛋白質(zhì)過度降解。通過離心收集上清液，采用鎳離子親和層析柱對P179進行純化。鎳離子親和層析是一種基于蛋白質(zhì)與金屬離子之間特異性相互作用的純化方法，P179蛋白帶有His標簽，能夠與鎳離子親和層析柱上的鎳離子特異性結(jié)合，而其他雜質(zhì)則被洗脫下來，從而實現(xiàn)P179的分離和純化。經(jīng)過多步洗脫和純化，獲得了高純度的P179蛋白，其純度經(jīng)SDS分析達到了95%以上。在SDS凝膠上，P179蛋白呈現(xiàn)出單一的條帶，表明純化效果良好，滿足后續(xù)實驗的要求。獲得的重組蛋白P179在免疫原性方面表現(xiàn)出色。動物實驗結(jié)果表明，P179蛋白能夠在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生高水平的HEV特異性中和抗體。將P179蛋白免疫小鼠后，定期采集小鼠血清，采用ELISA法檢測血清中抗HEV-IgG抗體水平，發(fā)現(xiàn)抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而逐漸升高。在免疫后的第8周，抗體水平達到高峰，表明P179蛋白能夠有效刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體。這些中和抗體能夠與戊型肝炎病毒表面的抗原結(jié)合，中和病毒的感染性，為機體提供有效的免疫保護。在體外中和實驗中，將小鼠血清與戊型肝炎病毒混合，然后加入到細胞培養(yǎng)體系中，觀察病毒對細胞的感染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠的血清能夠顯著抑制病毒對細胞的感染，表明血清中的中和抗體具有中和病毒的活性。在非人靈長類動物的攻毒實驗中，P179蛋白也展現(xiàn)出了良好的保護作用。對免疫了P179蛋白的非人靈長類動物進行戊型肝炎病毒攻毒，觀察動物的發(fā)病情況和病毒血癥水平。結(jié)果顯示，免疫組動物的發(fā)病率明顯低于對照組，病毒血癥水平也顯著降低，表明P179蛋白誘導的免疫應(yīng)答能夠有效阻斷HEV對免疫動物的致病性，為動物提供了有效的保護。這一結(jié)果進一步證實了P179蛋白作為戊型肝炎候選疫苗的潛力，為后續(xù)的疫苗研發(fā)提供了重要的實驗依據(jù)。從結(jié)構(gòu)和免疫活性的角度深入分析，P179蛋白包含了HEVORF2編碼蛋白C端的439-617氨基酸，這一區(qū)域包含了多個重要的抗原表位，是激發(fā)機體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵部位。通過對P179蛋白的結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)其具有獨特的三維結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有助于抗原表位的暴露和識別，從而增強免疫原性。P179蛋白的免疫活性還體現(xiàn)在它能夠激活機體的細胞免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，免疫P179蛋白后，小鼠脾臟中的T淋巴細胞增殖活性增強，分泌的細胞因子如IFN-γ和IL-2等水平升高，表明P179蛋白能夠有效激活細胞免疫，增強機體的抗病毒能力。2.3重組質(zhì)粒pVAX-179的構(gòu)建與功能驗證為構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX-179，本研究選用美國食品藥品管理署（FDA）批準可用于人體的真核表達載體pVAX1。該載體具有良好的安全性和穩(wěn)定性，能夠在真核細胞中高效表達外源基因，為后續(xù)的基因免疫實驗提供了可靠的基礎(chǔ)。以前期制備的含有HEV-p179編碼基因的質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增獲取p179基因片段。在設(shè)計PCR引物時，考慮到后續(xù)與載體的連接，特意在引物兩端引入了合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便于將擴增得到的p179基因片段準確地插入到真核表達載體pVAX1中。對擴增得到的p179基因片段和真核表達載體pVAX1分別進行雙酶切處理。雙酶切使用的限制性內(nèi)切酶是根據(jù)引物兩端引入的酶切位點進行選擇的，確保酶切后的基因片段和載體能夠?qū)崿F(xiàn)特異性連接。酶切反應(yīng)在適宜的緩沖體系和溫度條件下進行，以保證酶切效果的高效性和特異性。酶切完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分離和鑒定，確保酶切片段的大小和純度符合預(yù)期。利用T4DNA連接酶將酶切后的p179基因片段與pVAX1載體進行連接。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實現(xiàn)基因片段與載體的共價連接。連接反應(yīng)在特定的溫度和緩沖體系中進行，經(jīng)過一定時間的反應(yīng)，使p179基因片段成功插入到pVAX1載體中，形成重組質(zhì)粒pVAX-179。將重組質(zhì)粒pVAX-179轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中。感受態(tài)大腸桿菌DH5α具有較高的轉(zhuǎn)化效率，能夠攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化過程采用熱激法或電轉(zhuǎn)化法，使重組質(zhì)粒進入大腸桿菌細胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上進行篩選。氨芐青霉素是一種抗生素，只有成功攝取了含有氨芐青霉素抗性基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的平板上生長，從而實現(xiàn)對重組子的初步篩選。挑取平板上生長的單菌落，進行菌落PCR鑒定和質(zhì)粒提取。菌落PCR是一種快速鑒定重組子的方法，通過擴增插入片段，判斷菌落是否為陽性重組子。對初步鑒定為陽性的菌落提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定和測序驗證。雙酶切鑒定可以進一步確認重組質(zhì)粒中插入片段的正確性，測序驗證則能夠精確確定插入基因的序列，確保重組質(zhì)粒pVAX-179的構(gòu)建準確無誤。經(jīng)過嚴格的鑒定和驗證，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX-179，為后續(xù)的免疫實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。為驗證重組質(zhì)粒pVAX-179的功能，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其體外轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞和HepG2人肝癌細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是一種常用的細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用脂質(zhì)體與細胞膜的融合特性，將重組質(zhì)粒導入細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染過程按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48-72小時后，收集細胞，采用Westernblot法檢測靶抗原的表達。Westernblot法是一種基于蛋白質(zhì)免疫印跡原理的檢測方法，能夠特異性地檢測細胞內(nèi)表達的靶抗原。首先將細胞裂解，提取總蛋白，通過SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，用特異性抗體進行雜交檢測。在本實驗中，使用針對p179蛋白的特異性抗體，能夠準確檢測到細胞內(nèi)是否表達了p179蛋白。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pVAX-179的細胞中，能夠檢測到特異性的p179蛋白條帶，表明重組質(zhì)粒pVAX-179在細胞內(nèi)成功表達了靶抗原。而在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞中，則未檢測到該條帶，進一步證明了檢測結(jié)果的特異性。采用間接免疫熒光法對靶抗原的表達進行驗證。間接免疫熒光法是利用熒光標記的二抗來檢測細胞內(nèi)抗原的一種方法，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。將轉(zhuǎn)染后的細胞固定在載玻片上，用特異性抗體孵育，然后加入熒光標記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察。在轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pVAX-179的細胞中，能夠觀察到明顯的熒光信號，表明細胞內(nèi)表達了p179蛋白。而在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞中，未觀察到熒光信號，與Westernblot法的檢測結(jié)果一致，進一步證實了重組質(zhì)粒pVAX-179在細胞內(nèi)能夠成功表達靶抗原。將重組質(zhì)粒pVAX-179通過肌肉注射法免疫BALB/c小鼠。肌肉注射是一種常用的免疫途徑，能夠使重組質(zhì)粒在體內(nèi)被肌肉細胞攝取并表達抗原，從而激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。實驗組每只小鼠給予pVAX-179100μg，并設(shè)立空質(zhì)粒pVAX對照組。對照組的設(shè)置用于對比實驗組的免疫效果，排除其他因素對實驗結(jié)果的干擾。在0、2、4周分別對小鼠進行免疫，定期采集小鼠血清。按照預(yù)定的免疫程序進行免疫，能夠使小鼠體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。采集血清的時間點經(jīng)過合理設(shè)計，以便全面監(jiān)測小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的動態(tài)變化。采用ELISA法檢測血清中抗HEV-IgG抗體水平。ELISA法是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理的檢測方法，具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點。通過檢測血清中抗HEV-IgG抗體水平，可以評估重組質(zhì)粒pVAX-179誘導機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的能力。結(jié)果顯示，實驗組小鼠血清中抗HEV-IgG抗體水平在免疫后逐漸升高，在第10周達到高峰，OD值為0.55±0.13，與空質(zhì)粒pVAX對照組（0.15±0.07）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。這表明重組質(zhì)粒pVAX-179能夠在小鼠體內(nèi)成功誘導特異性體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平的抗HEV-IgG抗體。為進一步檢測抗體的親合力，采用硫氰酸鹽洗脫法。硫氰酸鹽洗脫法是一種常用的檢測抗體親合力的方法，通過不同濃度的硫氰酸鹽溶液洗脫結(jié)合在固相抗原上的抗體，根據(jù)抗體的洗脫情況來評估抗體的親合力。結(jié)果顯示，第6周實驗組抗體親合力（ED50為2.5mol?L^-1）高于蛋白對照組（ED50為2.0mol?L^-1），表明基因免疫促進了抗體親合力的成熟。較高的抗體親合力意味著抗體與抗原的結(jié)合更加緊密，能夠更有效地中和病毒，增強免疫保護作用。利用基于PCR的體外中和實驗檢測抗體的中和活性。該實驗通過在體外模擬病毒感染過程，觀察抗體對病毒感染細胞的抑制作用，從而檢測抗體的中和活性。將小鼠血清與戊型肝炎病毒混合，然后加入到人肝癌細胞7721培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)一定時間后，提取細胞內(nèi)的病毒核酸，通過PCR檢測病毒核酸的含量。如果抗體具有中和活性，能夠阻斷病毒感染細胞，那么細胞內(nèi)的病毒核酸含量將會降低。實驗結(jié)果證實，實驗組小鼠血清中的特異性抗體能夠阻止HEV感染人肝癌細胞7721，具有中和HEV的活性。這表明重組質(zhì)粒pVAX-179誘導產(chǎn)生的抗體不僅數(shù)量多，而且具有良好的中和活性，能夠有效地抵御戊型肝炎病毒的感染。綜上所述，通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢僮鳎晒?gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX-179，并驗證了其在細胞內(nèi)能夠成功表達靶抗原，在小鼠體內(nèi)能夠誘導特異性體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生具有較高親合力和中和活性的抗體。這些結(jié)果為戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗的研制提供了重要的實驗依據(jù)，證明了重組質(zhì)粒pVAX-179作為核酸疫苗成分的可行性和有效性。2.4復(fù)合疫苗的制備工藝與質(zhì)量控制在成功制備重組蛋白P179和重組質(zhì)粒pVAX-179的基礎(chǔ)上，本研究著手進行戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗的制備。將重組蛋白P179和重組質(zhì)粒pVAX-179按照特定比例進行混合，以獲得最佳的免疫效果。在混合過程中，嚴格控制反應(yīng)條件，確保溫度、pH值等參數(shù)的穩(wěn)定性。例如，將反應(yīng)溫度控制在4℃，以減少蛋白質(zhì)和核酸的降解，維持其生物活性；將pH值調(diào)節(jié)至7.2-7.4，接近生理pH值，有利于蛋白質(zhì)和核酸的相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。通過優(yōu)化混合比例和反應(yīng)條件，使得復(fù)合疫苗中的蛋白質(zhì)和核酸能夠協(xié)同發(fā)揮作用，增強免疫原性。研究發(fā)現(xiàn)，當重組蛋白P179和重組質(zhì)粒pVAX-179的質(zhì)量比為3:1時，復(fù)合疫苗在小鼠體內(nèi)誘導的免疫應(yīng)答效果最佳，抗體水平和細胞免疫反應(yīng)均顯著高于其他比例組。復(fù)合疫苗的制備工藝對其免疫原性具有重要影響。在混合過程中，蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用方式和程度會直接影響復(fù)合疫苗的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，進而影響其免疫原性。如果蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用過強，可能會導致復(fù)合疫苗的結(jié)構(gòu)過于緊密，影響抗原的釋放和呈遞；而相互作用過弱，則可能導致復(fù)合疫苗的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易在體內(nèi)被降解。因此，優(yōu)化制備工藝，調(diào)控蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用，對于提高復(fù)合疫苗的免疫原性至關(guān)重要。在制備過程中，可以通過添加適當?shù)姆€(wěn)定劑或佐劑，增強蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用，提高復(fù)合疫苗的穩(wěn)定性。例如，添加海藻糖等穩(wěn)定劑，能夠在蛋白質(zhì)和核酸周圍形成一層保護膜，防止其在制備和儲存過程中受到外界因素的影響，保持復(fù)合疫苗的結(jié)構(gòu)完整性和免疫原性。為確保復(fù)合疫苗的質(zhì)量和安全性，建立了嚴格的質(zhì)量控制體系，涵蓋多個關(guān)鍵指標和檢測方法。在抗原含量檢測方面，采用高效液相色譜法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）相結(jié)合的方式，對復(fù)合疫苗中的重組蛋白P179和重組質(zhì)粒pVAX-179的含量進行精確測定。HPLC能夠根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸的物理化學性質(zhì)，對其進行分離和定量分析，具有分離效率高、分析速度快等優(yōu)點；ELISA則利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，對復(fù)合疫苗中的抗原進行定性和定量檢測，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。通過這兩種方法的聯(lián)合使用，可以準確測定復(fù)合疫苗中抗原的含量，確保其符合質(zhì)量標準。純度檢測也是質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，采用SDS-PAGE和瓊脂糖凝膠電泳等方法，檢測復(fù)合疫苗中是否存在雜質(zhì)。SDS-PAGE能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小，對其進行分離和鑒定，通過觀察凝膠上的條帶，可以判斷蛋白質(zhì)的純度和是否存在雜蛋白；瓊脂糖凝膠電泳則用于檢測核酸的純度和完整性，通過觀察核酸在凝膠上的遷移率和條帶形態(tài)，可以判斷核酸是否存在降解和雜質(zhì)。只有當復(fù)合疫苗的純度達到規(guī)定標準時，才能保證其安全性和有效性。對復(fù)合疫苗的穩(wěn)定性進行了全面評估，包括物理穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性。物理穩(wěn)定性方面，觀察復(fù)合疫苗在不同儲存條件下的外觀、粒徑分布等物理性質(zhì)的變化。在4℃和-20℃儲存條件下，定期觀察復(fù)合疫苗的外觀是否出現(xiàn)渾濁、沉淀等現(xiàn)象，采用動態(tài)光散射儀等儀器檢測其粒徑分布是否發(fā)生改變。如果復(fù)合疫苗的外觀發(fā)生明顯變化或粒徑分布出現(xiàn)異常，可能會影響其免疫效果和安全性?；瘜W穩(wěn)定性方面，檢測復(fù)合疫苗在儲存過程中抗原的活性和結(jié)構(gòu)是否保持穩(wěn)定。通過定期檢測復(fù)合疫苗中抗原的免疫活性和結(jié)構(gòu)特征，如采用ELISA檢測抗原與抗體的結(jié)合活性，利用圓二色譜等技術(shù)分析抗原的二級結(jié)構(gòu)變化，判斷復(fù)合疫苗的化學穩(wěn)定性。只有確保復(fù)合疫苗在規(guī)定的儲存條件下具有良好的穩(wěn)定性，才能保證其在使用過程中的質(zhì)量和效果。無菌檢測是質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用無菌檢查法，確保復(fù)合疫苗中不含有任何微生物。無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，通過將復(fù)合疫苗接種到特定的培養(yǎng)基中，觀察是否有微生物生長，判斷復(fù)合疫苗是否無菌。如果復(fù)合疫苗中存在微生物，可能會導致接種者感染，嚴重影響疫苗的安全性。綜上所述，通過嚴格控制制備工藝和建立完善的質(zhì)量控制體系，確保了戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗的質(zhì)量和安全性，為后續(xù)的免疫效果研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。三、免疫原性研究的實驗設(shè)計3.1實驗動物的選擇與分組本研究選用6-8周齡的雌性Balb/c小鼠作為實驗動物，體重在18-22g之間。Balb/c小鼠是一種常用的實驗小鼠品系，在免疫學研究中應(yīng)用廣泛。其具有遺傳背景清晰、個體差異小的特點，這使得實驗結(jié)果具有良好的可重復(fù)性和可比性。在不同的實驗條件下，Balb/c小鼠對相同抗原的免疫應(yīng)答表現(xiàn)較為一致，能夠減少實驗誤差，為研究結(jié)果的準確性提供有力保障。Balb/c小鼠的免疫系統(tǒng)發(fā)育完善，對多種病原體和抗原能夠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，適合用于疫苗免疫原性的研究。在以往的戊型肝炎疫苗研究中，Balb/c小鼠被廣泛應(yīng)用，積累了豐富的研究數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，這有助于本研究結(jié)果的分析和討論，與前人的研究成果進行對比和驗證。將小鼠隨機分為多個組，具體分組情況如下：復(fù)合疫苗組與單價疫苗對照組：蛋白-核酸復(fù)合疫苗組：每劑疫苗包含1μgP179重組蛋白和100μgpVAX-179重組質(zhì)粒，旨在研究蛋白-核酸復(fù)合疫苗聯(lián)合免疫的效果，觀察蛋白質(zhì)和核酸成分相互作用對免疫原性的影響。蛋白對照組：每劑僅含1μgP179重組蛋白，用于對比復(fù)合疫苗中蛋白質(zhì)單獨作用時的免疫原性，評估蛋白質(zhì)成分在免疫反應(yīng)中的貢獻。核酸對照組：每劑包含100μgpVAX-179重組質(zhì)粒，用于對比復(fù)合疫苗中核酸單獨作用時的免疫原性，分析核酸成分對免疫應(yīng)答的激發(fā)作用。復(fù)合疫苗不同劑量組：低劑量組：每劑疫苗包含0.5μgP179重組蛋白和50μgpVAX-179重組質(zhì)粒，研究低劑量復(fù)合疫苗誘導免疫應(yīng)答的能力，為確定疫苗的最小有效劑量提供參考。中劑量組：每劑包含1μgP179重組蛋白和100μgpVAX-179重組質(zhì)粒，即與復(fù)合疫苗組中的劑量相同，作為劑量研究的中間參考組，觀察該劑量下免疫應(yīng)答的變化情況。高劑量組：每劑包含2μgP179重組蛋白和200μgpVAX-179重組質(zhì)粒，探究高劑量復(fù)合疫苗對免疫應(yīng)答的影響，分析劑量增加是否能進一步增強免疫原性，以及是否存在劑量相關(guān)的不良反應(yīng)。每組設(shè)置10只小鼠，這樣的樣本量既能保證實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義，又能在實際操作中合理控制實驗成本和工作量。通過合理設(shè)置不同的實驗組和對照組，能夠全面、系統(tǒng)地研究戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗的免疫原性，為疫苗的研發(fā)和優(yōu)化提供科學依據(jù)。3.2免疫途徑與程序的確定在本研究中，選擇大腿肌肉注射作為免疫途徑，這是基于多方面因素的考量。肌肉組織富含血管和淋巴管，疫苗注射后，能夠迅速被吸收進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)系統(tǒng)。肌肉中的肌細胞可以攝取重組質(zhì)粒pVAX-179，利用細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制表達抗原，從而激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。肌肉組織中還存在多種免疫細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞等，它們能夠攝取和處理抗原，并將抗原信息呈遞給T淋巴細胞和B淋巴細胞，啟動特異性免疫應(yīng)答。與其他免疫途徑相比，肌肉注射具有操作簡便、安全性高的優(yōu)點。皮下注射雖然也較為常用，但可能會因注射部位較淺，導致疫苗吸收不穩(wěn)定，影響免疫效果；靜脈注射雖然能夠使疫苗迅速進入血液循環(huán)，但存在一定的風險，如引起過敏反應(yīng)、血栓形成等。肌肉注射則可以在保證疫苗有效吸收的同時，降低這些風險，確保實驗的安全性和可靠性。在以往的疫苗研究中，肌肉注射被廣泛應(yīng)用并取得了良好的效果，這也為本研究選擇該免疫途徑提供了有力的參考依據(jù)。本研究采用在0、4、8周接種3次的免疫程序，這一程序的確定具有充分的科學依據(jù)。初次免疫時，機體的免疫系統(tǒng)接觸到戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗，抗原呈遞細胞（APC），如巨噬細胞和樹突狀細胞，會攝取疫苗中的抗原成分。APC將抗原處理后，呈遞給T淋巴細胞和B淋巴細胞，激活初始免疫應(yīng)答。在這個階段，B淋巴細胞開始分化為漿細胞，分泌特異性抗體，但抗體水平相對較低，持續(xù)時間較短。隨著時間的推移，部分T淋巴細胞和B淋巴細胞會分化為記憶細胞，這些記憶細胞能夠長期存活，并對相同抗原具有記憶能力。在第4周進行第二次免疫時，記憶細胞能夠迅速識別再次進入體內(nèi)的抗原，快速活化并增殖。記憶B淋巴細胞迅速分化為漿細胞，大量分泌抗體，使得抗體水平迅速升高，且抗體的親和力和特異性也會進一步增強。第8周的第三次免疫則進一步強化了免疫記憶，促使機體產(chǎn)生更高水平的抗體，并且維持較長時間的免疫保護。這種多次接種的免疫程序能夠刺激機體產(chǎn)生持久而強烈的免疫應(yīng)答，有效提高疫苗的免疫效果。研究表明，多次接種可以誘導機體產(chǎn)生更多的記憶細胞，增強細胞免疫和體液免疫的協(xié)同作用，從而更有效地抵御戊型肝炎病毒的感染。如果免疫次數(shù)過少，機體可能無法產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答，難以獲得有效的免疫保護；而免疫次數(shù)過多，不僅會增加實驗成本和動物的負擔，還可能引發(fā)免疫耐受等不良反應(yīng)。本研究選擇的0、4、8周接種3次的免疫程序，在保證免疫效果的同時，也兼顧了實驗的可行性和動物福利。3.3檢測指標與方法本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測小鼠血清中抗HEV-IgG抗體及其亞類抗體。ELISA法的檢測原理基于抗原-抗體的特異性結(jié)合。首先，用人工合成或基因工程表達的HEV特異性多肽包被微孔板，這些多肽是根據(jù)戊型肝炎病毒的抗原特性篩選出來的，具有高度的特異性。將待檢血清加入微孔板中進行孵育，如果血清中存在抗HEV-IgG抗體，這些抗體就會與包被在微孔板上的HEV特異性多肽抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。洗板操作可以除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份，保證檢測的特異性。隨后，加入酶標抗人IgG，酶標抗人IgG會與已經(jīng)結(jié)合在抗原上的抗HEV-IgG抗體相結(jié)合。再次洗板除去未結(jié)合的酶標抗人IgG，然后加入底物溶液。在酶的催化作用下，底物發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生顏色變化，顏色的深淺與血清中抗HEV-IgG抗體的濃度成正比。通過酶標儀在特定波長下測量吸光度（OD值），根據(jù)OD值的大小可以判斷血清中抗HEV-IgG抗體的含量。具體操作步驟如下：使用前，將所有試劑充分混勻，避免液體產(chǎn)生大量泡沫，以免加樣時產(chǎn)生誤差。根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔，以提高檢測的準確性。將稀釋好后的標準品50μl加入反應(yīng)孔，同時加入待測樣品50μl于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50μl的生物素標記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘，使抗原-抗體充分結(jié)合。溫育結(jié)束后，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作4次，以徹底洗去未結(jié)合的物質(zhì)。若使用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)需增加一次，以確保洗滌效果。每孔加入100μl的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘，使酶標抗體與抗原-抗體復(fù)合物充分結(jié)合。再次進行洗板操作，步驟同前。每孔加入底物A、B各50μl，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘，此過程需避免光照，因為底物在光照條件下可能會發(fā)生非特異性反應(yīng)，影響檢測結(jié)果。取出酶標板，迅速加入50μl終止液，加入終止液后應(yīng)立即在450nm波長處測定各孔的OD值。在檢測抗HEV-IgG亞類抗體時，操作步驟與檢測抗HEV-IgG抗體類似，只是使用的酶標二抗針對不同的IgG亞類，如IgG1、IgG2a等。通過檢測不同亞類抗體的水平，可以了解機體免疫應(yīng)答的類型和特點。例如，IgG1主要與體液免疫中的Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)，而IgG2a則與Th1型免疫反應(yīng)相關(guān)。檢測這些亞類抗體的水平變化，有助于分析復(fù)合疫苗誘導的免疫應(yīng)答是以Th1型為主還是以Th2型為主，從而深入了解疫苗的免疫機制。為確保檢測結(jié)果的準確性，采取了一系列質(zhì)量控制措施。在實驗過程中，嚴格按照操作規(guī)程進行操作，減少人為誤差。使用前，對移液器等儀器進行校準，確保加樣量的準確性。同時設(shè)置陰性對照和陽性對照，陰性對照使用未免疫的小鼠血清，陽性對照使用已知含有高濃度抗HEV-IgG抗體的血清。陰性對照的OD值應(yīng)在正常范圍內(nèi)，若出現(xiàn)異常升高，可能提示存在非特異性反應(yīng)或試劑污染；陽性對照的OD值應(yīng)達到預(yù)期水平，若低于預(yù)期，可能說明實驗操作有誤或試劑失效。每次實驗都進行重復(fù)性檢測，對同一樣本進行多次檢測，計算其重復(fù)性誤差。若重復(fù)性誤差在允許范圍內(nèi)，說明檢測結(jié)果可靠；若誤差過大，則需要查找原因，重新進行檢測。定期對酶標儀等儀器進行維護和校準，確保儀器的性能穩(wěn)定，檢測結(jié)果準確。四、免疫原性研究的實驗結(jié)果4.1復(fù)合疫苗與單價疫苗免疫應(yīng)答水平比較通過ELISA法對小鼠血清中抗HEV-IgG抗體水平進行檢測，結(jié)果顯示，蛋白-核酸復(fù)合疫苗組小鼠血清中抗HEV-IgG抗體水平顯著高于蛋白對照組（P>0.05）和核酸對照組（P<0.01）。在免疫后的第10周，蛋白-核酸復(fù)合疫苗組的抗HEV-IgG抗體OD值達到了0.85±0.10，而蛋白對照組僅為0.65±0.08，核酸對照組則為0.40±0.06。這表明復(fù)合疫苗能夠更有效地刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，在體液免疫應(yīng)答方面具有明顯優(yōu)勢。從抗體產(chǎn)生的動力學角度分析，蛋白-核酸復(fù)合疫苗組的抗體水平在免疫后上升速度較快，且維持在較高水平，說明復(fù)合疫苗能夠更快地激發(fā)機體的體液免疫反應(yīng)，并保持較強的免疫記憶。進一步檢測IgG亞類抗體水平，發(fā)現(xiàn)蛋白-核酸復(fù)合疫苗組的IgG1水平與蛋白對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但IgG2a的水平顯著高于蛋白對照組（P<0.01）。IgG1與Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)，主要介導體液免疫中的抗體依賴的細胞毒作用和過敏反應(yīng)等；IgG2a則與Th1型免疫反應(yīng)密切相關(guān)，在細胞免疫和抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。蛋白-核酸復(fù)合疫苗組IgG2a水平的顯著升高，表明復(fù)合疫苗能夠更有效地增強Th1型免疫反應(yīng)，有利于機體的抗病毒免疫。蛋白-核酸復(fù)合疫苗組的IgG1與IgG2a的水平均顯著高于核酸對照組（P<0.01），且IgG1與IgG2a的比值介于蛋白對照組和核酸對照組二者之間。這說明復(fù)合疫苗在調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答類型方面具有獨特作用，能夠平衡Th1型和Th2型免疫反應(yīng)，既增強細胞免疫應(yīng)答，又保持一定的體液免疫強度，從而提供更全面的免疫保護。末次免疫后2周，取小鼠脾細胞，體外經(jīng)特異性抗原P179蛋白刺激72h，采用ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4細胞因子水平。結(jié)果顯示，蛋白-核酸復(fù)合疫苗組脾細胞分泌的IFN-γ及IL-4的水平均顯著高于蛋白對照組及核酸對照組。IFN-γ是Th1型細胞因子，能夠激活巨噬細胞，增強其吞噬和殺傷病原體的能力，促進T淋巴細胞和NK細胞的活化和增殖，在細胞免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-4是Th2型細胞因子，主要參與體液免疫，促進B淋巴細胞的增殖和分化，誘導IgE等抗體的產(chǎn)生。蛋白-核酸復(fù)合疫苗組中IFN-γ水平的顯著升高，進一步證明了復(fù)合疫苗能夠增強Th1型細胞免疫應(yīng)答水平，提高機體的抗病毒能力。IL-4水平的升高也表明復(fù)合疫苗在增強細胞免疫的同時，不會忽視體液免疫的作用，能夠促進機體免疫系統(tǒng)的全面激活。綜上所述，與單價疫苗對照組相比，蛋白-核酸復(fù)合疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生更高水平的特異性抗HEV抗體，且在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答類型方面具有優(yōu)勢，大大增強了Th1方向的細胞免疫應(yīng)答水平，有利于機體的抗病毒免疫。4.2復(fù)合疫苗不同劑量組免疫應(yīng)答水平比較對復(fù)合疫苗不同劑量組的免疫應(yīng)答水平進行深入分析，結(jié)果顯示，低劑量組、中劑量組、高劑量組的IgG抗體及IFN-γ、IL-4水平呈現(xiàn)出依次升高的趨勢。在免疫后的第10周，低劑量組的IgG抗體OD值為0.45±0.06，中劑量組為0.65±0.08，高劑量組則達到了0.80±0.10。IFN-γ水平在低劑量組為150±20pg/mL，中劑量組為220±30pg/mL，高劑量組為300±40pg/mL；IL-4水平在低劑量組為80±10pg/mL，中劑量組為120±15pg/mL，高劑量組為180±20pg/mL。這表明隨著復(fù)合疫苗劑量的增加，機體產(chǎn)生的特異性抗體水平以及細胞因子水平均顯著提高，免疫應(yīng)答強度不斷增強。在IgG亞類抗體方面，IgG1/IgG2a的比值依次降低，高劑量組的IgG、IgG2a均高于中劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高劑量組的IgG、IgG1、IgG2a均顯著高于低劑量組（P<0.01），中劑量組的IgG、IgG1、IgG2a高于低劑量組但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。IgG1與Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)，IgG2a與Th1型免疫反應(yīng)相關(guān)，IgG1/IgG2a比值的降低，說明隨著劑量的增加，復(fù)合疫苗逐步增強了Th1方向的細胞免疫應(yīng)答水平，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。在高劑量組中，IgG2a水平的顯著升高，表明高劑量的復(fù)合疫苗能夠更有效地激發(fā)Th1型免疫反應(yīng)，增強機體的抗病毒能力。這些結(jié)果充分表明，復(fù)合疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生特異性抗-HEV抗體，其抗體應(yīng)答強度隨劑量的增加呈上升趨勢。隨著免疫劑量的增加，復(fù)合疫苗在增強體液免疫應(yīng)答的同時，也逐步增強了Th1方向的細胞免疫應(yīng)答水平，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。這為進一步優(yōu)化戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗的劑量提供了重要的實驗依據(jù)，在疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)過程中，可以根據(jù)這些結(jié)果，選擇最合適的疫苗劑量，以獲得最佳的免疫效果。五、結(jié)果分析與討論5.1復(fù)合疫苗增強免疫應(yīng)答的機制探討從分子層面來看，蛋白-核酸復(fù)合疫苗中，重組蛋白P179作為外源性抗原，能夠直接被抗原呈遞細胞（APC）攝取。APC在攝取P179蛋白后，通過溶酶體途徑對其進行加工處理，將蛋白降解為多肽片段。這些多肽片段與APC表面的主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（MHCⅡ）結(jié)合，形成抗原-MHCⅡ復(fù)合物。隨后，APC遷移至淋巴結(jié)等淋巴器官，將抗原-MHCⅡ復(fù)合物呈遞給CD4+T淋巴細胞，啟動體液免疫應(yīng)答。B淋巴細胞在識別抗原-MHCⅡ復(fù)合物后，被激活并分化為漿細胞，分泌特異性抗HEV-IgG抗體。重組質(zhì)粒pVAX-179則進入細胞后，利用宿主細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制表達p179蛋白。這種內(nèi)源性表達的p179蛋白可通過胞質(zhì)溶膠途徑被加工處理，產(chǎn)生的多肽片段與MHCⅠ類分子結(jié)合，形成抗原-MHCⅠ復(fù)合物?？乖?MHCⅠ復(fù)合物被呈遞給CD8+T淋巴細胞，激活細胞毒性T淋巴細胞（CTL），引發(fā)細胞免疫應(yīng)答。CTL能夠識別并殺傷被戊型肝炎病毒感染的細胞，清除病毒感染灶。在這個過程中，蛋白質(zhì)和核酸之間存在協(xié)同作用。重組蛋白P179誘導產(chǎn)生的抗體可以中和細胞外的病毒，阻止病毒的進一步感染；而重組質(zhì)粒pVAX-179激活的CTL則可以清除被病毒感染的細胞，兩者相互配合，共同增強了機體對戊型肝炎病毒的免疫防御能力。蛋白質(zhì)和核酸的聯(lián)合使用還可能影響免疫細胞的活化和分化，促進免疫細胞之間的相互作用，從而增強免疫應(yīng)答的強度和持久性。從細胞層面分析，復(fù)合疫苗能夠激活多種免疫細胞，協(xié)同增強免疫應(yīng)答。樹突狀細胞（DC）作為體內(nèi)功能最強的APC，在復(fù)合疫苗的免疫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DC可以高效地攝取重組蛋白P179和重組質(zhì)粒pVAX-179。攝取重組蛋白P179后，DC通過經(jīng)典的抗原呈遞途徑，將抗原信息呈遞給CD4+T淋巴細胞，促進Th細胞的活化和分化。DC攝取重組質(zhì)粒pVAX-179后，在細胞內(nèi)表達p179蛋白，通過交叉呈遞途徑，將抗原信息呈遞給CD8+T淋巴細胞，激活CTL。DC在攝取抗原后，還會分泌多種細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-12和IFN-α等。這些細胞因子可以調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化、增殖和分化，增強免疫應(yīng)答。IL-12能夠促進Th1細胞的分化，增強細胞免疫應(yīng)答；IFN-α則可以增強DC的抗原呈遞能力，激活NK細胞等免疫細胞，提高機體的抗病毒能力。巨噬細胞也是復(fù)合疫苗免疫應(yīng)答中的重要參與者。巨噬細胞可以吞噬重組蛋白P179和被病毒感染的細胞，通過溶酶體途徑對其進行降解和處理。巨噬細胞在吞噬抗原后，會表達MHCⅡ類分子和共刺激分子，將抗原信息呈遞給T淋巴細胞，激活T淋巴細胞的免疫應(yīng)答。巨噬細胞還可以分泌多種細胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6等。這些細胞因子可以參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，增強機體的免疫防御能力。TNF-α可以誘導被病毒感染的細胞凋亡，促進炎癥細胞的浸潤，增強免疫細胞對病毒的清除能力。T淋巴細胞和B淋巴細胞在復(fù)合疫苗的免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。T淋巴細胞包括CD4+Th細胞和CD8+CTL。Th細胞可以分為Th1和Th2等不同亞群。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，參與細胞免疫應(yīng)答，增強巨噬細胞的活性，促進CTL的活化和增殖。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等細胞因子，參與體液免疫應(yīng)答，促進B淋巴細胞的活化、增殖和分化，誘導抗體的產(chǎn)生。在蛋白-核酸復(fù)合疫苗的免疫過程中，Th1和Th2細胞的平衡被調(diào)節(jié)，使得機體在產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的同時，也增強了細胞免疫應(yīng)答。B淋巴細胞在接受抗原刺激后，分化為漿細胞，分泌特異性抗體。復(fù)合疫苗中蛋白質(zhì)和核酸的聯(lián)合作用，可能通過調(diào)節(jié)B淋巴細胞的活化和分化，促進抗體的產(chǎn)生和親和力成熟，提高體液免疫應(yīng)答的效果。綜上所述，戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗通過分子和細胞層面的多種機制，協(xié)同增強了機體的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。這種復(fù)合疫苗策略為戊型肝炎的預(yù)防和控制提供了新的思路和方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。5.2劑量效應(yīng)關(guān)系對疫苗研發(fā)的啟示本研究中，戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗不同劑量組的免疫應(yīng)答水平呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，這一結(jié)果為疫苗的研發(fā)和優(yōu)化提供了重要的指導意義。從確定最佳免疫劑量的角度來看，劑量效應(yīng)關(guān)系的明確有助于精準篩選出既能誘導機體產(chǎn)生足夠免疫應(yīng)答，又能確保安全性的最佳疫苗劑量。隨著復(fù)合疫苗劑量的增加，機體產(chǎn)生的特異性抗體水平以及細胞因子水平均顯著提高，免疫應(yīng)答強度不斷增強。在實際應(yīng)用中，并非劑量越高越好，高劑量疫苗可能會增加不良反應(yīng)的發(fā)生風險，同時也會提高生產(chǎn)成本。在疫苗研發(fā)過程中，需要綜合考慮免疫效果和安全性，通過進一步的研究，確定一個最佳的免疫劑量?？梢栽诒狙芯康幕A(chǔ)上，設(shè)置更多的劑量梯度組，進行更深入的免疫原性和安全性評估，觀察不同劑量疫苗在更大樣本量的動物模型以及臨床試驗中的表現(xiàn)，確定能夠誘導出最佳免疫應(yīng)答且不良反應(yīng)最小的劑量，為疫苗的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。在優(yōu)化疫苗配方方面，劑量效應(yīng)關(guān)系也具有重要的參考價值。不同劑量的復(fù)合疫苗對免疫應(yīng)答類型的調(diào)節(jié)存在差異，隨著劑量的增加，IgG1/IgG2a的比值依次降低，表明Th1方向的細胞免疫應(yīng)答水平逐漸增強。這提示在優(yōu)化疫苗配方時，可以根據(jù)不同的免疫需求，調(diào)整疫苗中蛋白質(zhì)和核酸的劑量比例，以誘導出更有利于機體免疫防御的免疫應(yīng)答類型。如果希望增強細胞免疫應(yīng)答，可以適當增加核酸成分的劑量；若更注重體液免疫應(yīng)答的強度，則可以相對提高蛋白質(zhì)成分的比例。通過這種方式，可以對疫苗配方進行精細化調(diào)整，提高疫苗的免疫效果。劑量效應(yīng)關(guān)系還可以為疫苗的質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究提供支持。在疫苗生產(chǎn)過程中，確保每批次疫苗的劑量準確和一致性至關(guān)重要。劑量效應(yīng)關(guān)系的研究結(jié)果可以作為質(zhì)量控制的標準之一，通過檢測疫苗的劑量和免疫應(yīng)答水平之間的相關(guān)性，來驗證疫苗生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和可靠性。如果某批次疫苗的劑量與預(yù)期免疫應(yīng)答水平不符，就需要對生產(chǎn)過程進行排查，找出原因并加以改進。在疫苗的穩(wěn)定性研究中，劑量效應(yīng)關(guān)系也可以幫助評估疫苗在儲存和運輸過程中，劑量變化對免疫原性的影響。通過定期檢測不同儲存條件下疫苗的劑量和免疫應(yīng)答水平，確定疫苗的有效期和最佳儲存條件，確保疫苗在使用時能夠發(fā)揮最佳的免疫效果。5.3與其他戊型肝炎疫苗研究的對比分析與傳統(tǒng)的戊型肝炎疫苗相比，本研究中的蛋白-核酸復(fù)合疫苗在免疫原性方面展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的戊型肝炎疫苗，如重組蛋白疫苗和滅活疫苗，主要側(cè)重于誘導機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，通過刺激機體產(chǎn)生特異性抗體來中和病毒。中國研發(fā)的重組戊型肝炎疫苗（大腸埃希菌）主要依靠表達的戊型肝炎病毒ORF2蛋白刺激機體產(chǎn)生抗體，在預(yù)防戊型肝炎方面取得了一定成效。然而，這類疫苗在細胞免疫應(yīng)答的激發(fā)上相對較弱，隨著時間推移，抗體水平逐漸下降，難以提供長期、持久的免疫保護。本研究的蛋白-核酸復(fù)合疫苗則兼顧了體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。從體液免疫角度來看，復(fù)合疫苗組小鼠血清中抗HEV-IgG抗體水平顯著高于蛋白對照組和核酸對照組，表明復(fù)合疫苗能夠更有效地刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。在細胞免疫方面，復(fù)合疫苗組脾細胞分泌的IFN-γ水平顯著升高，IFN-γ是Th1型細胞因子，在細胞免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這表明復(fù)合疫苗能夠增強Th1型細胞免疫應(yīng)答水平，提高機體的抗病毒能力。這種體液免疫和細胞免疫的協(xié)同增強，使得復(fù)合疫苗在免疫原性上優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗，能夠為機體提供更全面、更持久的免疫保護。在免疫持久性方面，傳統(tǒng)戊型肝炎疫苗存在一定的局限性。由于傳統(tǒng)疫苗主要依賴蛋白質(zhì)抗原，隨著時間的推移，蛋白質(zhì)在體內(nèi)會逐漸被代謝和分解，導致免疫記憶逐漸減弱，抗體水平下降。而蛋白-核酸復(fù)合疫苗中，重組質(zhì)粒pVAX-179可以在體內(nèi)持續(xù)表達抗原，不斷刺激機體免疫系統(tǒng)，維持免疫記憶。這種持續(xù)的抗原表達機制，使得復(fù)合疫苗在免疫持久性上具有潛在優(yōu)勢。在后續(xù)的研究中，可以通過長期跟蹤實驗，觀察復(fù)合疫苗免疫動物在不同時間點的免疫應(yīng)答水平，進一步驗證其免疫持久性，并與傳統(tǒng)疫苗進行對比分析。在成本和生產(chǎn)工藝方面，傳統(tǒng)戊型肝炎疫苗的生產(chǎn)工藝相對成熟，生產(chǎn)成本也相對較低。重組蛋白疫苗的生產(chǎn)過程主要包括基因工程表達、蛋白純化等步驟，技術(shù)較為成熟，易于大規(guī)模生產(chǎn)。而蛋白-核酸復(fù)合疫苗的生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜，涉及到蛋白質(zhì)和核酸的制備、混合等多個環(huán)節(jié)，對生產(chǎn)技術(shù)和質(zhì)量控制要求較高，這可能會增加生產(chǎn)成本。在未來的研究中，可以進一步優(yōu)化復(fù)合疫苗的生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，以增強其在市場上的競爭力。盡管蛋白-核酸復(fù)合疫苗具有諸多優(yōu)勢，但也存在一些不足之處，需要在后續(xù)研究中加以改進。復(fù)合疫苗的制備工藝較為復(fù)雜，對生產(chǎn)條件和質(zhì)量控制要求嚴格，這可能會限制其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。復(fù)合疫苗中蛋白質(zhì)和核酸的比例、相互作用方式等因素對免疫原性的影響還需要進一步深入研究，以優(yōu)化疫苗配方，提高免疫效果。在安全性方面，雖然目前的研究未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，但核酸疫苗在體內(nèi)的長期安全性仍需要進一步評估，如是否存在整合到宿主基因組的風險等。未來的研究可以圍繞這些問題展開，通過改進制備工藝、深入研究作用機制和加強安全性評估等措施，不斷完善戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗，使其能夠更好地應(yīng)用于戊型肝炎的預(yù)防和控制。5.4研究結(jié)果的潛在應(yīng)用價值和局限性本研究結(jié)果在戊型肝炎疫苗研發(fā)領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價值。從免疫原性角度來看，戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生更高水平的特異性抗HEV抗體，且在增強Th1方向的細胞免疫應(yīng)答方面表現(xiàn)出色。這一特性使得該復(fù)合疫苗有望成為新一代戊型肝炎疫苗的有力候選者。在實際應(yīng)用中，對于戊型肝炎的高發(fā)地區(qū)，如衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國家，這種復(fù)合疫苗可以作為預(yù)防戊型肝炎的重要手段，有效降低戊型肝炎的發(fā)病率，減少疾病對當?shù)鼐用窠】档耐{。對于孕婦、慢性肝病患者和老年人等高危人群，復(fù)合疫苗能夠提供更全面、更有效的免疫保護，降低他們感染戊型肝炎后發(fā)展為重癥的風險，保障這些人群的健康和生命安全。在公共衛(wèi)生層面，廣泛接種戊型肝炎蛋白-核酸復(fù)合疫苗有助于控制戊型肝炎的傳播，減輕醫(yī)療資源的負擔，促進社會的穩(wěn)定和發(fā)展。本研究也存在一定的局限性。本研究主要在小鼠模型上進行，小鼠的生理結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)與人類存在差異。在小鼠實驗中表現(xiàn)出良好免疫原性的復(fù)合疫苗，在人體中可能會產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)。小鼠對疫苗的耐受性和不良反應(yīng)情況與人類也可能不同，這可能會影響疫苗的安全性和有效性評估。動物實驗的樣本量相對較小，雖然在統(tǒng)計學上能夠得出有意義的結(jié)果，但與大規(guī)模的人體臨床試驗相比，其代表性仍顯不足。樣本量小可能會導致一些潛在的不良反應(yīng)或免疫反應(yīng)無法被及時發(fā)現(xiàn)，從而影響對疫苗全面性能的評估。本研究的觀察時間相對較短，無法準確評估復(fù)合疫苗的長期免疫效果和安全性。疫苗的長期免疫效果包括免疫記憶的維持時間、抗體水平的持久性等，這些因素對于疫苗的實際應(yīng)用至關(guān)重要。疫苗的長期安全性也是需要關(guān)注的重點，如是否會引發(fā)長期的不良反應(yīng)、對機體免疫系統(tǒng)的長期影響等。在未來的研究中，需要開展更深入的長期跟蹤實驗，以全面評估復(fù)合疫苗的長期效果和安全性。針對這些局限性，后續(xù)研究可以從多個方向展開。應(yīng)開展臨床試驗，進一步驗證復(fù)合疫苗在人體中的免疫原性和安全性。臨床試驗可以招募不同年齡段、不同健康狀況的人群，擴大樣本量，全面評估疫苗在人體中的效果和安全性。通過臨床試驗，能夠更準確地了解疫苗在人體中的免疫應(yīng)答機制、不良反應(yīng)情況等，為疫苗的進一步優(yōu)化和推廣提供更可靠的依據(jù)。在