肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注構(gòu)建策略演講人04/肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建材料與支架設(shè)計03/肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)基礎(chǔ)與仿生需求02/引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的背景與意義01/肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注構(gòu)建策略06/構(gòu)建過程中的挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向05/肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注策略08/總結(jié)與展望07/應(yīng)用前景與未來展望目錄01肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注構(gòu)建策略02引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的背景與意義引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的背景與意義肝臟作為人體最重要的代謝與解毒器官，其功能的實(shí)現(xiàn)高度依賴于精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)與微環(huán)境。肝小葉是肝臟的基本功能單位，其內(nèi)部的血管網(wǎng)絡(luò)（包括門靜脈分支、肝動脈分支、肝竇及中央靜脈）不僅承擔(dān)著血液運(yùn)輸?shù)墓δ埽歉渭?xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等實(shí)質(zhì)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換、信號傳遞的關(guān)鍵場所。然而，傳統(tǒng)的二維（2D）肝細(xì)胞培養(yǎng)模型無法模擬肝小葉的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞快速去分化、功能喪失；而現(xiàn)有的三維（3D）模型雖在一定程度上改善了細(xì)胞生長環(huán)境，但仍缺乏功能性血管網(wǎng)絡(luò)的灌注支持，限制了氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)的長距離運(yùn)輸與代謝廢物的有效清除，難以滿足藥物肝毒性篩選、肝疾病建模及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用需求。引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的背景與意義近年來，隨著組織工程、微流控技術(shù)與生物打印等學(xué)科的快速發(fā)展，構(gòu)建具有生理功能性的肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)成為研究熱點(diǎn)。通過模擬肝小葉內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與血流動力學(xué)特征，結(jié)合動態(tài)灌注策略，有望在體外構(gòu)建出高度仿生的肝臟微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)對肝臟生理病理過程的精準(zhǔn)模擬，為藥物研發(fā)、疾病機(jī)制研究及肝再生治療提供新的技術(shù)平臺。本文將從肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)基礎(chǔ)、仿生構(gòu)建材料、支架設(shè)計、灌注策略及優(yōu)化方向等方面，系統(tǒng)闡述肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注構(gòu)建策略，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。03肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)基礎(chǔ)與仿生需求肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)特征肝小葉呈六邊形柱狀結(jié)構(gòu)，長軸約1-2mm，其核心結(jié)構(gòu)是中央靜脈，周圍以放射狀分布的肝板為基本單元，肝板之間為肝竇。肝竇是肝小葉內(nèi)特殊的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）、庫普弗細(xì)胞（KCs）和肝星狀細(xì)胞（HSCs）構(gòu)成，窗孔結(jié)構(gòu)（直徑100-150nm）允許大分子物質(zhì)自由通過，是肝細(xì)胞與血液進(jìn)行物質(zhì)交換的主要場所。肝小葉的血液供應(yīng)呈“雙輸入-單輸出”模式：門靜脈（占肝血流的75%）和肝動脈（占25%）的血液在肝小葉周邊匯入，經(jīng)肝竇匯入中央靜脈，最終通過下腔靜脈回流入體循環(huán)。這種獨(dú)特的血流路徑使得肝小葉內(nèi)不同區(qū)域的肝細(xì)胞面臨不同的氧濃度、激素水平與代謝底物梯度，從而形成了“帶狀分區(qū)”（zone1-3）的代謝功能差異：Zone1（門靜脈周圍）以有氧代謝為主，Zone3（中央靜脈周圍）以無氧代謝為主，Zone2介于兩者之間。血管網(wǎng)絡(luò)對肝功能維持的核心作用1.物質(zhì)交換與代謝功能調(diào)控：肝竇的窗孔結(jié)構(gòu)與內(nèi)皮細(xì)胞窗孔膜（fenestrateddiaphragm）形成了選擇性屏障，允許營養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖、氨基酸）與代謝廢物（如乳酸、氨）的自由擴(kuò)散，同時限制大分子物質(zhì)（如白蛋白）的泄漏，維持肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。血流動力學(xué)因素（如剪切力）通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響肝細(xì)胞的代謝活性（如尿素合成、糖原儲存）與解毒功能（如細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)）。2.細(xì)胞互作與信號傳遞：肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞之間通過旁分泌與自分泌信號分子（如肝細(xì)胞生長因子HGF、轉(zhuǎn)化生長因子-βTGF-β、白細(xì)胞介素-6IL-6）維持動態(tài)平衡。例如，庫普弗細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可調(diào)控肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，肝星狀細(xì)胞活化后分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）則參與肝纖維化的進(jìn)程。血管網(wǎng)絡(luò)對肝功能維持的核心作用3.結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)維持：血管網(wǎng)絡(luò)的完整性是肝小葉結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或血管塌陷會導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血壞死，進(jìn)而引發(fā)肝功能障礙；而血管新生過度則與肝纖維化、肝癌等病理過程密切相關(guān)。仿生構(gòu)建的核心需求基于肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)特征，仿生構(gòu)建需滿足以下核心需求：-結(jié)構(gòu)仿生：重現(xiàn)肝小葉的六邊形結(jié)構(gòu)、中央靜脈-肝竇-門靜脈的三級血管網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洌约案渭?xì)胞索與肝竇的空間排列關(guān)系；-功能仿生：模擬“雙輸入-單輸出”的血流模式，維持生理范圍內(nèi)的剪切力（0.1-10dyn/cm2）與壓力梯度（5-15mmHg）；-細(xì)胞互作仿生：共培養(yǎng)肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞等實(shí)質(zhì)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信號傳遞與功能協(xié)同；-動態(tài)微環(huán)境仿生：通過灌注系統(tǒng)模擬體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)、代謝廢物清除及氧濃度梯度，維持細(xì)胞的長期活性與功能。3214504肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建材料與支架設(shè)計構(gòu)建材料的選擇原則構(gòu)建肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的材料需滿足以下原則：011.生物相容性：材料及其降解產(chǎn)物無細(xì)胞毒性，支持細(xì)胞黏附、增殖與分化；022.可降解性：降解速率與組織再生速率匹配，避免長期殘留影響功能；033.力學(xué)性能：匹配肝臟的彈性模量（5-10kPa），為細(xì)胞提供適宜的力學(xué)微環(huán)境；044.可加工性：可通過3D打印、微流控等技術(shù)精確控制微觀結(jié)構(gòu)；055.功能性：可修飾生物活性分子（如細(xì)胞黏附肽、生長因子），調(diào)控細(xì)胞行為。06常用構(gòu)建材料分類與特性天然高分子材料-膠原蛋白（Collagen）：肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，含有細(xì)胞識別位點(diǎn)（如RGD序列），支持肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與功能。但機(jī)械強(qiáng)度低（彈性模量0.1-1kPa），易在動態(tài)灌注下降解，常需與其他材料復(fù)合使用。-明膠（Gelatin）：膠原蛋白的水解產(chǎn)物，具有良好的生物相容性與可修飾性，可通過物理交聯(lián)（溫度誘導(dǎo)）或化學(xué)交聯(lián)（戊二醛、genipin）提高機(jī)械強(qiáng)度，但交聯(lián)劑可能殘留細(xì)胞毒性。-纖維蛋白原（Fibrinogen）：凝血過程中的關(guān)鍵蛋白，可在凝血酶作用下形成纖維蛋白凝膠，支持細(xì)胞遷移與血管生成，常用于構(gòu)建可注射性血管網(wǎng)絡(luò)。-透明質(zhì)酸（HyaluronicAcid,HA）：ECM的重要成分，具有親水性與保水性，可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附與遷移，但機(jī)械強(qiáng)度低，需通過修飾（如乙酰化、甲基化）或復(fù)合其他材料改善性能。常用構(gòu)建材料分類與特性合成高分子材料-聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）：FDA批準(zhǔn)的可降解材料，降解速率可通過乳酸與羥基乙酸的比例調(diào)控（1:1時降解速率約1-3個月），機(jī)械強(qiáng)度高（彈性模量1-10GPa），但疏水性強(qiáng)，細(xì)胞相容性較差，需通過表面修飾（如等離子體處理、接枝親水性分子）改善。-聚己內(nèi)酯（PCL）：疏水性合成聚合物，降解緩慢（2-3年），機(jī)械強(qiáng)度高（彈性模量約350MPa），常用于構(gòu)建長期植入的血管支架，但需與快速降解材料復(fù)合以匹配組織再生速率。-聚乙二醇（PEG）：親水性聚合物，無免疫原性，可通過光交聯(lián)形成水凝膠，常用于細(xì)胞封裝與3D打印。但缺乏生物活性位點(diǎn)，需接枝RGD等肽段以促進(jìn)細(xì)胞黏附。常用構(gòu)建材料分類與特性生物衍生材料-脫細(xì)胞肝臟基質(zhì)（DecellularizedLiverMatrix,DLM）：通過物理、化學(xué)或酶學(xué)方法去除肝臟細(xì)胞，保留ECM成分（如膠原蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖），具有與天然肝臟相似的組成與結(jié)構(gòu)，是構(gòu)建仿生血管網(wǎng)絡(luò)的理想材料。但脫細(xì)胞過程可能破壞ECM的微觀結(jié)構(gòu)，且批次間差異較大，需優(yōu)化脫細(xì)胞工藝以保留關(guān)鍵生物活性分子。支架設(shè)計與制造技術(shù)支架是仿生血管網(wǎng)絡(luò)的物理骨架，需精確模擬肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與微觀特征。常用的制造技術(shù)包括：支架設(shè)計與制造技術(shù)3D生物打印技術(shù)-原理：通過計算機(jī)輔助設(shè)計（CAD）構(gòu)建肝小葉的三維模型，利用生物打印機(jī)將細(xì)胞-材料混合物（生物墨水）按預(yù)設(shè)結(jié)構(gòu)層層沉積，形成具有血管網(wǎng)絡(luò)的支架。-生物墨水選擇：需兼顧打印精度與細(xì)胞活性。例如，以海藻酸鈉/明膠為基質(zhì)的生物墨水可支持內(nèi)皮細(xì)胞的存活與血管形成，而以PLGA/膠原蛋白復(fù)合的生物墨水則可用于構(gòu)建高機(jī)械強(qiáng)度的血管主干。-優(yōu)勢：可精確控制血管網(wǎng)絡(luò)的分支角度（70-120，模擬肝小葉內(nèi)肝竇的放射狀排列）、管徑（5-50μm，模擬肝竇直徑）與空間密度，實(shí)現(xiàn)“按需定制”的支架結(jié)構(gòu)。-挑戰(zhàn)：高細(xì)胞密度（>1×10?cells/mL）生物墨水的打印精度有限，且打印過程中剪切力可能損傷細(xì)胞，需優(yōu)化打印參數(shù)（如噴嘴直徑、打印速度）以減少細(xì)胞損傷。支架設(shè)計與制造技術(shù)微流控芯片技術(shù)-原理：利用微通道網(wǎng)絡(luò)模擬肝小葉的血管結(jié)構(gòu)，通過軟光刻技術(shù)制作PDMS芯片，將內(nèi)皮細(xì)胞接種于微通道內(nèi)形成血管內(nèi)皮層，再在周邊區(qū)域接種肝細(xì)胞構(gòu)建肝細(xì)胞索。-優(yōu)勢：可精確模擬血流動力學(xué)參數(shù)（如剪切力、壓力梯度），實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測（如通過顯微觀察細(xì)胞形態(tài)、通過傳感器檢測代謝產(chǎn)物），適用于高通量藥物篩選。-挑戰(zhàn)：芯片尺寸?。ㄍǔ?lt;1cm2），難以擴(kuò)展至大規(guī)模組織構(gòu)建；微通道易發(fā)生堵塞，需優(yōu)化培養(yǎng)基成分與流動參數(shù)。支架設(shè)計與制造技術(shù)靜電紡絲技術(shù)STEP1STEP2STEP3-原理：通過高壓靜電將聚合物溶液或熔體拉伸成納米級纖維，沉積在接收板上形成多孔纖維膜，可用于構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)的“外基質(zhì)支架”。-優(yōu)勢：纖維直徑（50-500nm）接近ECM的微觀結(jié)構(gòu)，孔隙率高（>80%），有利于細(xì)胞滲透與營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散。-挑戰(zhàn)：纖維排列隨機(jī)，難以形成定向的血管網(wǎng)絡(luò)；機(jī)械強(qiáng)度與降解速率需通過材料復(fù)合與工藝優(yōu)化調(diào)控。支架設(shè)計與制造技術(shù)模板法與生物相容性犧牲材料-原理：利用可犧牲材料（如瓊脂糖糖絲、PLGA微球）作為血管模板，將生物材料（如膠原蛋白、水凝膠）包裹于模板周圍，通過溶解去除模板，形成中空血管網(wǎng)絡(luò)。-優(yōu)勢：可構(gòu)建復(fù)雜的三維血管分支結(jié)構(gòu)，適用于多種材料的復(fù)合使用。-挑戰(zhàn)：犧牲材料的去除過程（如酶解、溶解）可能破壞支架的微觀結(jié)構(gòu)，需優(yōu)化去除條件以減少對支架的損傷。05肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注策略肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注策略灌注策略是仿生血管網(wǎng)絡(luò)功能實(shí)現(xiàn)的核心，通過模擬體內(nèi)的血流動力學(xué)環(huán)境，維持細(xì)胞的活性與功能。本部分將從動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)、流體力學(xué)優(yōu)化、細(xì)胞互作調(diào)控及灌注介質(zhì)設(shè)計等方面，系統(tǒng)闡述灌注策略的關(guān)鍵技術(shù)。動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建灌注系統(tǒng)的組成-驅(qū)動單元：根據(jù)流量需求選擇蠕動泵、注射泵或微泵。蠕動泵適用于大流量（>1mL/min）、低剪切力的灌注，如肝竇血流模擬；注射泵可精確控制小流量（<0.1mL/min），適用于微流控芯片的精確調(diào)控；微泵（如壓電泵、電磁泵）可實(shí)現(xiàn)集成化、智能化的流量控制，適用于器官芯片系統(tǒng)。-培養(yǎng)基循環(huán)單元：包括儲液罐、管路、氧合器與加熱單元。儲液罐需采用生物相容性材料（如玻璃、聚碳酸酯），避免培養(yǎng)基成分吸附；管路內(nèi)徑需與血管網(wǎng)絡(luò)管徑匹配（如肝竇模擬管路內(nèi)徑50-200μm），避免湍流產(chǎn)生；氧合器（如膜式氧合器）可維持培養(yǎng)基的氧分壓（PO?=50-100mmHg，模擬肝竇內(nèi)的氧濃度梯度）；加熱單元（如水浴鍋、加熱板）將溫度維持在37℃，模擬體內(nèi)溫度。動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建灌注系統(tǒng)的組成-監(jiān)測與反饋單元：通過傳感器（如pH傳感器、氧傳感器、壓力傳感器）實(shí)時監(jiān)測培養(yǎng)基的pH（7.2-7.4）、氧濃度、流速與壓力，通過反饋系統(tǒng)（如PID控制器）自動調(diào)節(jié)泵速，維持參數(shù)穩(wěn)定。動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建動態(tài)培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)的對比-靜態(tài)培養(yǎng)：細(xì)胞處于低剪切力（<0.1dyn/cm2）環(huán)境，營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散受限，代謝廢物積累，導(dǎo)致細(xì)胞快速凋亡（24-48h內(nèi)肝白蛋白合成下降50%以上）。-動態(tài)培養(yǎng)：生理剪切力（1-5dyn/cm2）可激活內(nèi)皮細(xì)胞的mechanotransduction通路（如PI3K/Akt、MAPK通路），促進(jìn)一氧化氮（NO）與前列環(huán)素（PGI?）的分泌，抑制血小板聚集，維持血管通透性；同時，剪切力可增強(qiáng)肝細(xì)胞的細(xì)胞連接（如緊密連接、橋粒），提高極性與功能活性（動態(tài)培養(yǎng)7天后，肝白蛋白合成量是靜態(tài)培養(yǎng)的3-5倍）。流體力學(xué)參數(shù)的優(yōu)化剪切力的調(diào)控肝竇內(nèi)皮細(xì)胞承受的生理剪切力范圍為0.1-10dyn/cm2，其中門靜脈周圍（Zone1）剪切力較高（5-10dyn/cm2），中央靜脈周圍（Zone3）較低（0.1-2dyn/cm2）。通過計算流體力學(xué)（CFD）模擬優(yōu)化灌注參數(shù)，可實(shí)現(xiàn)剪切力的梯度分布：-剪切力計算：根據(jù)Navier-Stokes方程，模擬流體在血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的流動，計算管壁剪切力（τ=4μQ/πr3，μ為培養(yǎng)基黏度，Q為流速，r為血管半徑）；-剪切力調(diào)控：通過調(diào)整流速（Q）與血管半徑（r）實(shí)現(xiàn)。例如，在肝竇模擬區(qū)域（r=20μm），流速設(shè)置為0.5mL/min時，剪切力約為2dyn/cm2，符合Zone2的生理水平。流體力學(xué)參數(shù)的優(yōu)化壓力梯度的維持肝小葉內(nèi)的壓力梯度為5-15mmHg（門靜脈分支至中央靜脈），過高壓力（>20mmHg）會導(dǎo)致肝竇擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞損傷；過低壓力（<5mmHg）則無法維持血流灌注。通過CFD模擬優(yōu)化血管網(wǎng)絡(luò)的分支結(jié)構(gòu)與管徑分布，可確保壓力梯度的均勻性：例如，門靜脈分支管徑逐漸減小（從200μm至50μm），中央靜脈管徑逐漸增大（從50μm至100μm），形成“漸縮-漸擴(kuò)”的流道，降低流動阻力，維持壓力梯度穩(wěn)定。流體力學(xué)參數(shù)的優(yōu)化流場均勻性優(yōu)化血管網(wǎng)絡(luò)的分支結(jié)構(gòu)易導(dǎo)致血流分布不均，部分區(qū)域出現(xiàn)“低灌注”或“高灌注”。通過以下策略優(yōu)化流場均勻性：01-分支角度優(yōu)化：肝竇分支角度為70-120，CFD模擬表明，90分支角度可減少血流分離（flowseparation），降低湍流強(qiáng)度（Reynolds數(shù)<2000）；02-管徑比例優(yōu)化：遵循“立方定律”（CubedLaw），即父血管與子血管的管徑比為3:1，確保流量分配均勻（如門靜脈分支流量為1mL/min時，各級肝竇流量分配誤差<10%）；03-阻力調(diào)控：在低灌注區(qū)域引入微流控阻力元件（如微針陣列、多孔膜），增加局部流動阻力，促進(jìn)流量重新分布。04細(xì)胞互作的動態(tài)調(diào)控共培養(yǎng)體系的設(shè)計-細(xì)胞比例：肝細(xì)胞:內(nèi)皮細(xì)胞:庫普弗細(xì)胞:肝星狀細(xì)胞=70:20:5:5，模擬肝小葉內(nèi)細(xì)胞組成；-空間排列：內(nèi)皮細(xì)胞包被于血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)壁，肝細(xì)胞以“索狀”排列于血管周圍（距離血管10-50μm，模擬肝細(xì)胞與肝竇的距離），庫普弗細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞分散于肝細(xì)胞索之間，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的直接接觸與旁分泌信號傳遞；-動態(tài)共培養(yǎng)：通過灌注系統(tǒng)將庫普弗細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α）運(yùn)輸至肝細(xì)胞區(qū)域，調(diào)控肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；同時，肝細(xì)胞代謝產(chǎn)生的乳酸、氨等廢物可通過血管網(wǎng)絡(luò)清除，避免細(xì)胞毒性。細(xì)胞互作的動態(tài)調(diào)控生物活性因子的遞送-物理吸附：將生長因子（如HGF、EGF）吸附于支架材料表面，通過血流沖刷緩慢釋放（半衰期24-48h）；-化學(xué)偶聯(lián)：通過共價鍵（如碳二亞胺交聯(lián)）將生長因子固定于支架材料上，實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定釋放（半衰期>7天）；-載體包裹：利用微球（如PLGA微球、脂質(zhì)體）包裹生長因子，通過灌注介質(zhì)的流動實(shí)現(xiàn)控釋，避免生長因子在體內(nèi)快速降解。例如，HGF包裹的PLGA微球（粒徑10-50μm）可在灌注條件下持續(xù)釋放HGF14天，顯著促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖與功能維持。灌注介質(zhì)的優(yōu)化培養(yǎng)基成分的動態(tài)調(diào)整-基礎(chǔ)培養(yǎng)基：采用威廉氏培養(yǎng)基E（Williams’E）或DMEM/F12，添加10%FBS、1%ITS（胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒）、40μg/mL脯氨酸，支持肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；-激素補(bǔ)充：添加10??M地塞米松（促進(jìn)肝細(xì)胞極性）、10??M甲狀腺素（促進(jìn)代謝酶表達(dá)）；-動態(tài)補(bǔ)充：通過灌注系統(tǒng)實(shí)時監(jiān)測葡萄糖濃度，維持在5-10mM（模擬肝竇內(nèi)的葡萄糖梯度）；補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基以清除乳酸（濃度<10mM）與氨（濃度<0.1mM），避免細(xì)胞酸中毒與毒性。灌注介質(zhì)的優(yōu)化氧濃度的梯度控制1肝小葉內(nèi)存在明顯的氧濃度梯度：Zone1（門靜脈周圍）PO?=50-70mmHg，Zone3（中央靜脈周圍）PO?=20-30mmHg。通過以下策略實(shí)現(xiàn)氧濃度梯度：2-物理梯度構(gòu)建：在芯片底部設(shè)置氧滲透膜（如PDMS膜），控制氧從底部向上擴(kuò)散，形成垂直氧濃度梯度；3-化學(xué)梯度調(diào)控：在培養(yǎng)基中加入氧載體（如全氟碳化合物），提高氧溶解度，通過調(diào)整流速調(diào)控氧傳遞速率；4-實(shí)時監(jiān)測：采用熒光氧傳感器（如ruthenium配合物）實(shí)時監(jiān)測不同區(qū)域的氧濃度，通過反饋系統(tǒng)調(diào)整氧合器的氧流量，維持梯度穩(wěn)定。06構(gòu)建過程中的挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向構(gòu)建過程中的挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向盡管肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建已取得一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，需從材料、技術(shù)、細(xì)胞來源等方面進(jìn)行優(yōu)化。主要挑戰(zhàn)血管網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性與長期功能維持-問題：在動態(tài)灌注下，天然材料（如膠原蛋白）易降解導(dǎo)致血管塌陷；合成材料（如PLGA）的疏水性導(dǎo)致細(xì)胞黏附不良；內(nèi)皮細(xì)胞單層在長期灌注下易出現(xiàn)脫落、凋亡，失去屏障功能。-案例：某研究使用膠原蛋白-明膠復(fù)合水凝膠構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)，灌注3天后血管塌陷率達(dá)40%，肝細(xì)胞存活率下降至60%。主要挑戰(zhàn)細(xì)胞來源的局限性-問題：原代肝細(xì)胞來源有限（如手術(shù)切除組織、肝移植剩余組織），且體外擴(kuò)增后快速去分化；干細(xì)胞（如iPSCs、MSCs）向肝細(xì)胞分化的效率低（<50%），且分化后的細(xì)胞功能不成熟（如CYP3A4表達(dá)量僅為原代肝細(xì)胞的30%）。-案例：iPSCs分化的肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)2周后，尿素合成能力下降70%，難以滿足長期實(shí)驗需求。主要挑戰(zhàn)規(guī)?；c標(biāo)準(zhǔn)化難題-問題：3D生物打印與微流控芯片構(gòu)建的肝小葉模型尺寸小（<1cm3），難以滿足藥物篩選的大規(guī)模需求；不同實(shí)驗室間的材料批次、細(xì)胞來源、工藝參數(shù)差異大，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差。-案例：兩個實(shí)驗室使用相同方法構(gòu)建的肝小葉模型，在相同藥物處理下，肝毒性結(jié)果的差異可達(dá)30%。主要挑戰(zhàn)免疫排斥反應(yīng)-問題：異種細(xì)胞（如豬肝細(xì)胞）或異種來源材料（如豬源性膠原蛋白）在體內(nèi)應(yīng)用時，會引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植失敗。-案例：豬肝細(xì)胞移植到靈長類動物體內(nèi)后，7天內(nèi)出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，移植細(xì)胞存活率<10%。優(yōu)化方向材料改性提高穩(wěn)定性與生物活性-復(fù)合材料設(shè)計：將天然材料（如膠原蛋白）與合成材料（如PCL）復(fù)合，利用合成材料的機(jī)械強(qiáng)度彌補(bǔ)天然材料的不足，同時保留天然材料的生物活性。例如，膠原蛋白/PCL復(fù)合支架（PCL含量20%）的機(jī)械強(qiáng)度（彈性模量8kPa）接近肝臟，且在灌注下可維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定>14天。-表面修飾：在材料表面接枝細(xì)胞黏附肽（如RGD、YIGSR）與抗凝血分子（如肝素、NO供體），提高內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率與抗血栓能力。例如，肝素修飾的膠原蛋白支架可使內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率提高80%，血小板黏附率降低60%。優(yōu)化方向細(xì)胞來源的拓展與功能成熟-干細(xì)胞定向分化：通過三維培養(yǎng)（如肝球培養(yǎng)）、共培養(yǎng)（與內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞）與化學(xué)誘導(dǎo)（如DMSO、OSM），提高iPSCs向肝細(xì)胞的分化效率（>70%）與功能成熟度（CYP3A4表達(dá)量達(dá)原代肝細(xì)胞的80%）。-基因編輯：利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯干細(xì)胞的代謝通路（如敲除HNF4α抑制去分化），或過表達(dá)關(guān)鍵基因（如CYP3A4、ALB），增強(qiáng)細(xì)胞的功能穩(wěn)定性。優(yōu)化方向規(guī)?；c標(biāo)準(zhǔn)化構(gòu)建-模塊化設(shè)計：將肝小葉模型設(shè)計為“模塊單元”（如1mm3），通過并聯(lián)多個單元實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?；采用標(biāo)準(zhǔn)化工藝（如統(tǒng)一生物墨水配方、打印參數(shù)），提高不同批次間的一致性。-自動化構(gòu)建：結(jié)合機(jī)器人技術(shù)與微流控芯片，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞接種、支架打印、灌注培養(yǎng)的自動化，減少人為誤差，提高構(gòu)建效率。優(yōu)化方向免疫兼容性提升231-同種異體細(xì)胞：使用患者來源的iPSCs構(gòu)建個性化肝小葉模型，避免免疫排斥；-免疫隔離：利用半透膜（如聚醚砜膜，孔徑50-100nm）包裹肝小葉模型，允許營養(yǎng)物質(zhì)與代謝廢物通過，但阻斷免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞）的進(jìn)入；-免疫調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基中加入免疫抑制劑（如環(huán)孢素A）或抗炎因子（如IL-10），減輕免疫排斥反應(yīng)。07應(yīng)用前景與未來展望應(yīng)用前景與未來展望肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注構(gòu)建策略，在藥物研發(fā)、疾病建模、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，未來將向多學(xué)科交叉、智能化、臨床轉(zhuǎn)化方向發(fā)展。應(yīng)用前景藥物肝毒性篩選傳統(tǒng)2D肝細(xì)胞模型無法預(yù)測藥物的體內(nèi)肝毒性（如臨床前肝毒性預(yù)測準(zhǔn)確率<50%），而肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)模型可模擬肝臟的代謝活化（如CYP450酶系）、血流動力學(xué)與細(xì)胞互作，顯著提高預(yù)測準(zhǔn)確性（準(zhǔn)確率>80%）。例如，某研究使用仿生血管網(wǎng)絡(luò)模型篩選了100種已知肝毒性藥物，其預(yù)測敏感性與特異性分別達(dá)85%與90%，顯著優(yōu)于2D模型（敏感性60%，特異性70%）。應(yīng)用前景肝臟疾病建模通過模擬疾病微環(huán)境（如肝纖維化的TGF-β高表達(dá)、肝癌的血管異常新生），構(gòu)建疾病特異性肝小葉模型，可用于疾病機(jī)制研究與藥物篩選。例如，在肝纖維化模型中，通過灌注TGF-β（10ng/mL）誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，7天后膠原蛋白分泌量增加5倍，成功模擬了肝纖維化的早期進(jìn)程；在肝癌模型中，通過灌注血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，50ng/mL）誘導(dǎo)血管新生，14天后血管密度增加3倍，可用于抗血管生成藥物的篩選。應(yīng)用前景再生醫(yī)學(xué)與生物人工肝肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)可作為生物人工肝（BAL）的核心組件，為肝衰竭患者提供臨時肝支持功能。例如，某研究將患者來源的肝細(xì)胞接種于仿生血管網(wǎng)絡(luò)支架，構(gòu)建生物