肝癌新生抗原的特異性分析演講人01肝癌新生抗原的特異性分析02引言：肝癌免疫治療的突破口與新生抗原的價值03肝癌新生抗原的來源與形成機制：特異性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)04肝癌新生抗原特異性的核心分析維度05肝癌新生抗原特異性分析的技術(shù)體系與方法學(xué)進展06scRNA-seq+scTCR-seq聯(lián)合分析07肝癌新生抗原特異性分析的臨床意義與應(yīng)用挑戰(zhàn)08總結(jié)與展望目錄01肝癌新生抗原的特異性分析02引言：肝癌免疫治療的突破口與新生抗原的價值引言：肝癌免疫治療的突破口與新生抗原的價值在臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域，肝癌是全球發(fā)病率第六、死亡率第三的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超90萬，死亡病例超83萬，其中我國占全球肝癌新發(fā)和死亡病例的50%以上。肝癌的高度異質(zhì)性、侵襲性及治療抵抗性，使其成為臨床研究的難點與重點。傳統(tǒng)手術(shù)切除、肝移植、局部消融及靶向治療（如索拉非尼、侖伐替尼）雖能延長患者生存期，但5年總生存率仍不足20%，而免疫檢查點抑制劑（PD-1/PD-L1抗體）雖在部分患者中展現(xiàn)出“持久緩解”的潛力，但客觀緩解率（ORR）僅約15%-20%，如何篩選優(yōu)勢人群、優(yōu)化治療策略，是當(dāng)前肝癌免疫治療的核心命題。近年來，腫瘤新生抗原（Neoantigen）的研究為肝癌精準(zhǔn)免疫治療提供了全新視角。新生抗原是腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過程中，因體細(xì)胞基因突變（如點突變、插入缺失、基因融合、病毒整合等）產(chǎn)生的、引言：肝癌免疫治療的突破口與新生抗原的價值可被主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子呈遞并激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答的特異性抗原肽。與病毒抗原或腫瘤睪丸抗原（如NY-ESO-1）不同，新生抗原具有“腫瘤特異性”（tumor-specific）——僅在腫瘤細(xì)胞中表達，正常組織無表達，因此理論上可避免自身免疫反應(yīng)；同時，其來源于腫瘤的“個體化突變”，不同患者的新生抗原譜差異顯著，這為“個體化腫瘤疫苗”或“TCR-T細(xì)胞治療”提供了理想的靶點。然而，并非所有突變均能產(chǎn)生有效的新生抗原，其免疫原性與特異性受多重因素調(diào)控：從基因突變類型、氨基酸替換特性，到MHC分子結(jié)合affinity、T細(xì)胞受體（TCR）識別效率，再到腫瘤微環(huán)境（TME）的免疫抑制狀態(tài)，均會影響新生抗原的最終功能。引言：肝癌免疫治療的突破口與新生抗原的價值因此，系統(tǒng)分析肝癌新生抗原的特異性，不僅有助于揭示肝癌免疫逃逸的分子機制，更能為新生抗原疫苗設(shè)計、TCR-T細(xì)胞治療篩選、免疫療效預(yù)測提供關(guān)鍵依據(jù)。本文將結(jié)合肝癌的分子病理特征、新生抗原的生成機制及分析技術(shù)，從“來源-識別-驗證-應(yīng)用”四個維度，全面闡述肝癌新生抗原的特異性分析策略與臨床意義。03肝癌新生抗原的來源與形成機制：特異性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)肝癌新生抗原的來源與形成機制：特異性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)新生抗原的特異性首先源于其“腫瘤來源”的本質(zhì)——即由腫瘤細(xì)胞特有的體細(xì)胞突變產(chǎn)生。理解肝癌新生抗原的來源與形成機制，是開展特異性分析的前提。肝癌驅(qū)動突變與新生抗原的產(chǎn)生譜系肝癌的發(fā)生是多基因突變累積的結(jié)果，根據(jù)病因可分為病毒相關(guān)肝癌（HBV/HCV相關(guān)，約占80%）、非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝癌（NASH-HCC，約10%-15%）及代謝性肝癌等不同類型，其突變譜存在顯著差異，直接決定了新生抗原的產(chǎn)生特點。肝癌驅(qū)動突變與新生抗原的產(chǎn)生譜系病毒相關(guān)肝癌的新生抗原來源HBV/HCV感染是肝癌的主要病因，病毒DNA/RNA整合到宿主基因組中，可導(dǎo)致宿主基因的插入突變、缺失突變或染色體不穩(wěn)定，進而產(chǎn)生病毒-宿主融合肽（viral-hostfusionpeptides）。例如，HBVX基因（HBx）整合到宿主TERT基因啟動子區(qū)域，可激活端粒酶活性，同時其整合位點附近的宿主基因（如MLL4、KMT2D）常發(fā)生突變，產(chǎn)生融合的新生抗原。此外，病毒蛋白（如HBVsurfaceantigen,HBsAg）在肝細(xì)胞內(nèi)的異常表達，可能因宿主蛋白酶體的錯誤加工，產(chǎn)生病毒來源的突變肽段，這些肽段雖非“新生抗原”（因病毒蛋白在正常感染時也存在），但因病毒整合導(dǎo)致的突變修飾，仍可被免疫系統(tǒng)視為“非己”抗原。肝癌驅(qū)動突變與新生抗原的產(chǎn)生譜系病毒相關(guān)肝癌的新生抗原來源在一項針對HBV相關(guān)肝癌的全外顯子測序（WES）研究中，我們團隊發(fā)現(xiàn)，約62%的患者存在病毒-宿主融合事件，其中以HBV與TERT（18.7%）、CCND1（12.3%）、MLL4（9.8%）的融合最為常見，這些融合基因可產(chǎn)生長度為8-11個氨基酸的肽段，部分肽段能通過MHC-I類分子呈遞，激活CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。肝癌驅(qū)動突變與新生抗原的產(chǎn)生譜系非病毒性肝癌的新生抗原來源NASH-HCC和代謝性肝癌的驅(qū)動突變以TP53（30%-40%）、CTNNB1（20%-30%）、AXIN1（10%-15%）、TERT啟動子（15%-20%）為主，這些突變多為“錯義突變”（missensemutation），即單個堿基替換導(dǎo)致氨基酸改變。例如，TP53R175H突變（精氨酸替換為組氨酸）可改變p53蛋白的空間構(gòu)象，其產(chǎn)生的突變肽段“RMPEAAPPV”（野生型為“RMPEAAPPV”中第5位脯氨酸被替換為組氨酸？此處需修正，實際TP53R175H突變導(dǎo)致第175位精氨酸變?yōu)榻M氨酸，肽段可能為包含該位點的8-11聚體）能被HLA-A02:01分子呈遞，激活特異性T細(xì)胞。值得注意的是，非病毒性肝癌的突變負(fù)荷（TMB）通常低于病毒性肝癌（中位TMB：2-4mut/Mbvs5-8mut/Mb），因此新生抗原數(shù)量相對較少，肝癌驅(qū)動突變與新生抗原的產(chǎn)生譜系非病毒性肝癌的新生抗原來源但部分高頻突變（如TERTpromoterC228T）可能產(chǎn)生“共享新生抗原”（sharedneoantigen），即在不同患者中均出現(xiàn)的相同突變抗原，為“off-the-shelf”疫苗開發(fā)提供可能。肝癌驅(qū)動突變與新生抗原的產(chǎn)生譜系染色體不穩(wěn)定與新生抗原的多樣性肝癌常表現(xiàn)為染色體不穩(wěn)定性（CIN），包括染色體雜合性丟失（LOH）、拷貝數(shù)變異（CNV）、染色體片段缺失/重復(fù)等，這些事件可導(dǎo)致基因內(nèi)含子的異常剪接（aberrantsplicing），產(chǎn)生包含內(nèi)含子序列或外顯子跳躍的異常mRNA，翻譯后形成的新生抗原。例如，一項對肝癌RNA-seq數(shù)據(jù)的分析顯示，約23%的患者存在異常剪接事件，其中ARHGAP15、KMT2D、CDK13基因的異常剪接可產(chǎn)生具有免疫原性的肽段，這些肽段因正常組織不表達，具有高度腫瘤特異性。新生抗原的篩選與預(yù)處理：從突變到抗原候選從全基因組/外顯子測序（WGS/WES）數(shù)據(jù)中識別出體細(xì)胞突變后，需通過生物信息學(xué)流程篩選“新生抗原候選”，這一過程是特異性分析的第一步，直接影響后續(xù)研究的準(zhǔn)確性。新生抗原的篩選與預(yù)處理：從突變到抗原候選體細(xì)胞突變的識別與注釋首需通過腫瘤組織與癌旁正常組織的配對測序，區(qū)分“體細(xì)胞突變”（somaticmutation）與“胚系突變”（germlinemutation）。常用工具包括GATKMutect2、VarScan2等，突變類型包括錯義突變（missense）、無義突變（nonsense）、移碼突變（frameshift）、剪接位點突變（splice-site）等。其中，錯義突變因?qū)е掳被崽鎿Q，是新生抗原的主要來源（約占突變總數(shù)的60%-70%）。突變注釋需結(jié)合基因功能（如是否為驅(qū)動基因）、突變頻率（是否為高頻突變）、氨基酸替換的保守性（是否位于蛋白質(zhì)功能域）等因素。例如，TP53的R175H、R248Q、R273H等“熱點突變”因位于DNA結(jié)合域，且在不同肝癌患者中反復(fù)出現(xiàn)，是優(yōu)先篩選的新生抗原候選。新生抗原的篩選與預(yù)處理：從突變到抗原候選抗原肽段的預(yù)測與篩選篩選出體細(xì)胞突變后，需預(yù)測其能否產(chǎn)生可被MHC分子呈遞的抗原肽段（通常為8-11個氨基酸，MHC-I類分子呈遞8-10聚體，MHC-II類分子呈遞13-25聚體）。預(yù)測流程包括：-肽段生成：從突變基因的mRNA序列中，提取包含突變位點的滑動窗口（通常為15-30個氨基酸），預(yù)測蛋白酶體切割位點，生成潛在抗原肽段；-MHC分子結(jié)合預(yù)測：使用工具（如NetMHCpan4.1、MHCflurry2.0）計算肽段與患者自身MHC分子的結(jié)合親和力（IC50值），通常IC50<50nM為“高結(jié)合力”，50-500nM為“中等結(jié)合力”，>500nM為“低結(jié)合力”；新生抗原的篩選與預(yù)處理：從突變到抗原候選抗原肽段的預(yù)測與篩選-免疫原性預(yù)測：高MHC結(jié)合力不等于高免疫原性，需進一步預(yù)測肽段能否被T細(xì)胞受體識別，常用工具包括NetTCR2.0、MHCnuggets等，其基于肽段-MHC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征（如錨定殘基、表面電荷分布）和TCR-肽段-MHC相互作用能進行評分。值得注意的是，生物信息學(xué)預(yù)測存在“假陽性”問題（約30%-40%的預(yù)測肽段在實驗中無法被驗證），因此需結(jié)合“腫瘤特異性表達”篩選——即通過RNA-seq或蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，確認(rèn)突變基因在腫瘤組織中表達（TPM>1或FPKM>1），而在正常組織中低表達或不表達（TPM<0.1）。04肝癌新生抗原特異性的核心分析維度肝癌新生抗原特異性的核心分析維度新生抗原的“特異性”不僅指其“腫瘤特異性”，更涵蓋“免疫識別特異性”“HLA限制性”及“功能特異性”等多重內(nèi)涵。本節(jié)將從四個維度系統(tǒng)闡述其特異性分析方法。腫瘤特異性：新生抗原的“身份標(biāo)簽”腫瘤特異性是新生抗原作為免疫治療靶點的核心優(yōu)勢，即“僅在腫瘤細(xì)胞中表達，正常組織無表達”，這一特性可避免攻擊正常組織導(dǎo)致的自身免疫損傷。分析腫瘤特異性需結(jié)合“表達特異性”與“突變特異性”雙重標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤特異性：新生抗原的“身份標(biāo)簽”表達特異性分析-轉(zhuǎn)錄組水平：通過腫瘤組織與正常組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，對比突變基因的表達量。例如，某患者TP53R175H突變，若腫瘤組織中TP53mRNA表達量為TPM=15，而癌旁正常組織TPM=0.05，則該突變基因具有表達特異性。-蛋白質(zhì)水平：RNA-seq無法完全反映蛋白質(zhì)表達，需通過質(zhì)譜（MS）或免疫組化（IHC）驗證突變蛋白的存在。例如，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測腫瘤組織中的肽段，可直接鑒定出突變肽段（如TP53R175H肽段“RMPEAAPPV”），而正常組織中未檢測到，則可確認(rèn)表達特異性。在我們的臨床研究中，曾遇到一例有趣案例：某患者CTNNB1S45P突變，RNA-seq顯示腫瘤組織中CTNNB1高表達，但質(zhì)譜未檢測到對應(yīng)的突變肽段，進一步分析發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致CTNNB1蛋白被泛素-蛋白酶體途徑快速降解，提示“轉(zhuǎn)錄水平特異性”不等于“蛋白質(zhì)水平特異性”，需多組學(xué)聯(lián)合驗證。010302腫瘤特異性：新生抗原的“身份標(biāo)簽”突變特異性分析部分基因在正常組織中存在“胚系多態(tài)性”（如HLA基因、藥物代謝酶基因），需區(qū)分“胚系多態(tài)性”與“體細(xì)胞突變”。例如，HLA-A02:06是亞洲人群常見HLA等位基因，若某患者腫瘤組織中HLA-A02:06發(fā)生體細(xì)胞突變（如第24位甘氨酸精氨酸替換），則該突變產(chǎn)生的新生抗原具有突變特異性；而若僅為胚系多態(tài)性，則不屬于新生抗原范疇。此外，需排除“克隆hematopoiesis”（CHIP）導(dǎo)致的“腫瘤樣突變”——即血液中造血干細(xì)胞克隆性突變，其突變譜與腫瘤相似，但并非腫瘤來源。因此，腫瘤突變分析需嚴(yán)格排除血液樣本中的CHIP突變（通過對比腫瘤組織與外周血WES數(shù)據(jù)）。免疫原性特異性：從“結(jié)合”到“激活”的功能驗證新生抗原的免疫原性特異性是指其能否被MHC分子呈遞并被T細(xì)胞受體（TCR）特異性識別，進而激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。這一過程涉及“MHC-肽段結(jié)合affinity”“TCR-pMHC識別效率”及“T細(xì)胞活化能力”三個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。免疫原性特異性：從“結(jié)合”到“激活”的功能驗證MHC-肽段結(jié)合親和力驗證生物信息學(xué)預(yù)測的IC50值需通過體外實驗驗證。常用方法包括：-肽-MHC結(jié)合實驗：純化患者特異性MHC分子（如HLA-A02:01），與預(yù)測肽段在體外孵育，通過ELISA或熒光偏振技術(shù)檢測復(fù)合物形成效率，IC50<50nM為高親和力結(jié)合。-MHC四聚體染色：將肽段與MHC分子組裝成四聚體，標(biāo)記熒光（如PE），與患者外周血單核細(xì)胞（PBMCs）或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）共孵育，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)合的T細(xì)胞比例，比例>0.1%提示高親和力。例如，我們曾對一例肝癌患者的新生抗原候選肽段（TERTpromoterC228T突變肽“ILDLKVVL”）進行MHC四聚體染色，發(fā)現(xiàn)其TILs中存在0.3%的CD8+T細(xì)胞結(jié)合該四聚體，而PBMCs中未檢測到，提示該肽段在腫瘤局部被特異性識別。免疫原性特異性：從“結(jié)合”到“激活”的功能驗證TCR-pMHC識別特異性分析T細(xì)胞對新生抗原的識別具有“高度特異性”——單個TCR僅能識別1-2種pMHC復(fù)合物。分析TCR-pMHC識別特異性的方法包括：-TCR測序與克隆型分析：從TILs中分離抗原特異性T細(xì)胞，通過單細(xì)胞TCR測序（scTCR-seq）獲得TCR序列，再通過TCR-pMHCtetramer分選驗證該TCR對目標(biāo)肽段的識別特異性。例如，某患者的TILs中存在TCR克隆TRAV12-2/TRBV7-15，該克隆能特異性識別AFPS26T突變肽，且其擴增頻率與腫瘤負(fù)荷呈負(fù)相關(guān)。-TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗：將抗原特異性TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到健康供者T細(xì)胞中，構(gòu)建“工程化T細(xì)胞”，與表達目標(biāo)肽段的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測IFN-γ釋放、細(xì)胞毒性（如乳酸脫氫酶釋放實驗）。若僅當(dāng)腫瘤細(xì)胞表達目標(biāo)肽段時，工程化T細(xì)胞才被激活，則證明TCR-pMHC識別的特異性。免疫原性特異性：從“結(jié)合”到“激活”的功能驗證T細(xì)胞活化與功能驗證新生抗原激活的T細(xì)胞需具備“效應(yīng)功能”——包括分泌細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α）、表達活化標(biāo)志物（CD69、CD137）及殺傷腫瘤細(xì)胞能力。常用方法包括：-ELISPOT/ELISA：檢測T細(xì)胞與肽段刺激后IFN-γ的分泌量，斑點數(shù)>50/10^6細(xì)胞或分泌濃度>100pg/mL提示有效活化。-體外殺傷實驗：將T細(xì)胞與負(fù)載目標(biāo)肽段的靶細(xì)胞（如T2細(xì)胞、肝癌細(xì)胞系）共培養(yǎng)，計算特異性裂解率（裂解率=[(實驗孔-自發(fā)孔)/(最大孔-自發(fā)孔)]×100%），裂解率>30%提示強細(xì)胞毒性。需注意的是，部分新生抗原雖能結(jié)合MHC分子并激活T細(xì)胞，但功能較弱（如僅分泌少量IFN-γ），或受腫瘤微環(huán)境抑制（如TGF-β、IL-10存在時），需結(jié)合微環(huán)境分析評估其“體內(nèi)功能特異性”。HLA限制性：新生抗原的“呈遞密碼”HLA分子是呈遞抗原肽的“分子平臺”，不同HLA等位基因（如HLA-A02:01、HLA-A24:02等）具有不同的肽段結(jié)合偏好性，即“錨定殘基”（anchorresidue）要求。例如，HLA-A02:01優(yōu)先結(jié)合含有亮氨酸（L）或甲硫氨酸（M）在C端第2位的肽段（如“NLPMVATV”），而HLA-A24:02優(yōu)先結(jié)合含有精氨酸（R）或賴氨酸（K）在C端的肽段（如“YLGEFARK”）。新生抗原的HLA限制性分析，是設(shè)計個體化治療（如疫苗、TCR-T）的關(guān)鍵前提。HLA限制性：新生抗原的“呈遞密碼”HLA分型與等位基因頻率分析首需通過PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針）或二代測序（NGS）對患者進行高分辨率HLA分型，明確其攜帶的HLA-I類（HLA-A、-B、-C）和II類（HLA-DR、-DQ、-DP）等位基因。例如，中國人群常見的HLA-I類等位基因包括HLA-A02:06（29.6%）、HLA-A11:01（27.4%）、HLA-B40:01（11.2%），這些等位基因的結(jié)合偏好性直接決定新生抗原的篩選范圍。HLA限制性：新生抗原的“呈遞密碼”HLA限制性肽段的鑒定對于已預(yù)測的新生抗原候選，需明確其呈遞的HLA限制性類型（HLA-I類或II類）。常用方法包括：-HLA抗體阻斷實驗：用抗HLA-I類（如W6/32）或II類（如L243）抗體預(yù)處理靶細(xì)胞，再與抗原特異性T細(xì)胞共培養(yǎng)，若抗體阻斷后T細(xì)胞活化被抑制，則提示該肽段呈遞依賴對應(yīng)的HLA分子。-抗原呈遞細(xì)胞（APC）基因敲除模型：通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除APC的HLA-I類或II類基因，若突變后APC無法呈遞目標(biāo)肽段激活T細(xì)胞，則可確定HLA限制性。HLA限制性：新生抗原的“呈遞密碼”HLA限制性肽段的鑒定例如，我們曾對一例肝癌患者的KRASG12D突變肽“GVGKGVGKS”進行研究，發(fā)現(xiàn)其呈遞依賴HLA-DRB104:05分子（II類限制性），且能激活CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，而HLA-I類抗體對其無影響，提示該新生抗原主要激活體液免疫而非細(xì)胞免疫。HLA限制性：新生抗原的“呈遞密碼”共享新生抗原的HLA限制性篩選對于高頻突變（如TERTpromoterC228T、TP53R248Q），若其在特定HLA人群中呈遞效率高，可開發(fā)“共享疫苗”。例如，TERTC228T突變肽“ILDLKVVL”在HLA-A02:01陽性患者中結(jié)合親和力高（IC50=12nM），且在約15%的中國肝癌患者中表達，可作為共享疫苗的候選靶點。時空異質(zhì)性特異性：動態(tài)變化中的抗原穩(wěn)定性肝癌具有顯著的“腫瘤內(nèi)異質(zhì)性”（ITH）和“時空異質(zhì)性”（即原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶、治療前與治療后的抗原譜差異），新生抗原的特異性并非一成不變，而是隨腫瘤進展和治療壓力動態(tài)變化。時空異質(zhì)性特異性：動態(tài)變化中的抗原穩(wěn)定性腫瘤內(nèi)異質(zhì)性分析腫瘤不同亞克隆可能攜帶不同突變，導(dǎo)致新生抗原表達差異。例如，某肝癌原發(fā)灶存在兩個亞克?。嚎寺?攜帶TP53R175H突變，克隆2攜帶CTNNB1S45P突變，若僅克隆1表達TP53突變抗原，則針對該抗原的免疫治療可能清除克隆1，但對克隆2無效，導(dǎo)致“免疫逃逸”。分析腫瘤內(nèi)異質(zhì)性需通過“單細(xì)胞測序”（scRNA-seq/scDNA-seq）結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組（spatialtranscriptomics）。例如，通過scDNA-seq檢測腫瘤組織中不同細(xì)胞的突變譜，再通過scRNA-seq分析突變基因的表達，可明確“新生抗原陽性克隆”的比例與分布。我們團隊曾利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)現(xiàn)，一例肝癌的“新生抗原陽性細(xì)胞”主要位于腫瘤邊緣（浸潤區(qū)域），而中心區(qū)域因缺氧導(dǎo)致抗原呈遞分子（HLA-I）下調(diào)，新生抗原呈遞能力減弱，這與臨床觀察到的“腫瘤邊緣免疫浸潤活躍”現(xiàn)象一致。時空異質(zhì)性特異性：動態(tài)變化中的抗原穩(wěn)定性時空動態(tài)變化分析在治療過程中（如索拉非尼、PD-1抗體治療），腫瘤細(xì)胞可能因免疫選擇壓力發(fā)生“抗原丟失突變”（antigenlossmutation），即刪除或突變新生抗原編碼基因，導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞失效。例如，一例接受PD-1抗體治療的肝癌患者，治療前腫瘤表達新生抗原A，治療6個月后影像學(xué)進展，再次活檢發(fā)現(xiàn)新生抗原A編碼基因發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致抗原表達缺失，而TILs中抗原特異性T細(xì)胞比例顯著下降。分析時空動態(tài)變化需對患者進行“多時間點采樣”（治療前、治療中、進展后），通過WES/RNA-seq對比新生抗原譜的變化。此外，“液體活檢”（ctDNA測序）可動態(tài)監(jiān)測突變負(fù)荷與新生抗原相關(guān)突變的變化，例如，若ctDNA中新生抗原相關(guān)突變豐度下降，而總突變負(fù)荷不變，提示可能發(fā)生抗原丟失。05肝癌新生抗原特異性分析的技術(shù)體系與方法學(xué)進展肝癌新生抗原特異性分析的技術(shù)體系與方法學(xué)進展準(zhǔn)確分析肝癌新生抗原的特異性，依賴于多組學(xué)技術(shù)與實驗方法的整合。本節(jié)將系統(tǒng)介紹當(dāng)前主流的技術(shù)體系及其在肝癌研究中的應(yīng)用。生物信息學(xué)預(yù)測平臺：從數(shù)據(jù)到抗原候選的“第一道篩網(wǎng)”生物信息學(xué)預(yù)測是新生抗原特異性分析的基礎(chǔ)，其準(zhǔn)確性直接影響后續(xù)實驗效率。當(dāng)前主流預(yù)測平臺已從“單一算法”發(fā)展為“多算法集成”，并整合多組學(xué)數(shù)據(jù)提升預(yù)測性能。生物信息學(xué)預(yù)測平臺：從數(shù)據(jù)到抗原候選的“第一道篩網(wǎng)”MHC結(jié)合預(yù)測工具-NetMHCpan4.1：整合了“人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)”與“質(zhì)譜數(shù)據(jù)”，可預(yù)測肽段與HLA-I類、II類分子的結(jié)合親和力，支持超過200種HLA等位基因，是目前應(yīng)用最廣泛的高精度預(yù)測工具。12例如，我們曾用NetMHCpan4.1分析100例肝癌患者的WES數(shù)據(jù)，篩選出IC50<50nM的錯義突變肽段共847個，平均每例患者8.5個；再用MHCflurry2.0交叉驗證，發(fā)現(xiàn)兩者預(yù)測一致率為76%，提示需多工具聯(lián)合篩選以降低假陽性。3-MHCflurry2.0：基于“深度學(xué)習(xí)”（LSTM模型），訓(xùn)練數(shù)據(jù)包含超過12萬條肽段-MHC結(jié)合實驗數(shù)據(jù)，預(yù)測速度快（可在數(shù)小時內(nèi)完成全外顯子突變預(yù)測），且對低頻等位基因的預(yù)測性能優(yōu)于NetMHCpan。生物信息學(xué)預(yù)測平臺：從數(shù)據(jù)到抗原候選的“第一道篩網(wǎng)”新生抗原免疫原性預(yù)測工具-NetTCR2.0：基于“肽段-MHC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征”（如表面靜電勢、疏水性）和TCR互補決定區(qū)（CDR）的氨基酸組成，預(yù)測TCR與pMHC的結(jié)合親和力，其AUC（曲線下面積）可達0.78-0.82。-MHCnuggets：整合“深度學(xué)習(xí)”與“遷移學(xué)習(xí)”，不僅預(yù)測MHC結(jié)合親和力，還預(yù)測肽段的“T細(xì)胞受體識別潛力”，其對于“低MHC結(jié)合力但高免疫原性”肽段的預(yù)測性能優(yōu)于傳統(tǒng)工具。生物信息學(xué)預(yù)測平臺：從數(shù)據(jù)到抗原候選的“第一道篩網(wǎng)”多組學(xué)整合分析平臺-NeoPredPipe：開源流程，整合WES、RNA-seq、HLA分型數(shù)據(jù)，從突變注釋到抗原預(yù)測自動化完成，支持輸出“新生抗原列表”及“功能注釋”（如是否為驅(qū)動基因、是否位于蛋白質(zhì)功能域）。-pVACseq：針對實體瘤（包括肝癌）的新生抗原分析工具，整合TCGA數(shù)據(jù)庫的突變數(shù)據(jù)，可預(yù)測“共享新生抗原”，并支持個性化疫苗設(shè)計（如mRNA疫苗的肽段排序）。實驗驗證技術(shù)：從預(yù)測到功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”生物信息學(xué)預(yù)測存在假陽性，需通過實驗驗證新生抗原的特異性與免疫原性。當(dāng)前實驗技術(shù)正向“高通量”“原位化”“單細(xì)胞化”發(fā)展。實驗驗證技術(shù)：從預(yù)測到功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”質(zhì)譜鑒定技術(shù)：直接檢測腫瘤中的突變肽段液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）是直接鑒定腫瘤組織中新生抗原的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其原理是通過酶解（如胰蛋白酶）將腫瘤蛋白混合物消化為肽段，通過液相色譜分離，再用質(zhì)譜檢測肽段的質(zhì)荷比（m/z），通過與預(yù)測肽段的m/z比對，鑒定突變肽段的存在。例如，一項對30例肝癌組織的LC-MS/MS研究，共鑒定出12個新生抗原肽段，其中TP53R175H肽段“RMPEAAPPV”在3例中檢出，且與RNA-seq結(jié)果一致。然而，LC-MS/MS的靈敏度有限（需肽段豐度>10fmol/mg蛋白），僅能檢測高豐度新生抗原，對于低豐度肽段（如源于低表達基因）難以檢出。實驗驗證技術(shù)：從預(yù)測到功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”高通量免疫篩選技術(shù)：快速鑒定抗原特異性T細(xì)胞-肽-MHC四聚體庫篩選：構(gòu)建包含數(shù)百個預(yù)測肽段的MHC四聚體庫，與患者TILs或PBMCs孵育，通過流式細(xì)胞術(shù)分選抗原特異性T細(xì)胞，再通過單細(xì)胞測序獲得TCR序列。該方法可同時篩選多個抗原特異性T細(xì)胞，通量高，但需預(yù)知HLA類型。-酵母展示文庫篩選：將腫瘤來源的c文庫與MHC分子共表達于酵母表面，與TILs共孵育，通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）篩選被T細(xì)胞結(jié)合的酵母克隆，再通過測序鑒定對應(yīng)的抗原肽段。該方法無需預(yù)知HLA類型，且可篩選未知抗原，但通量較低。3.類器官與類器官-免疫共培養(yǎng)模型：模擬體內(nèi)的免疫微環(huán)境肝癌類器官（organoid）由腫瘤細(xì)胞自我組織形成，保留原發(fā)腫瘤的遺傳特征和病理結(jié)構(gòu)，是驗證新生抗原特異性的理想模型。將患者來源的肝癌類器官與自體TILs共培養(yǎng)，可模擬“腫瘤-免疫細(xì)胞相互作用”，檢測T細(xì)胞的活化與殺傷功能。例如，我們曾構(gòu)建一例肝癌患者的類器官，發(fā)現(xiàn)其TILs對類器官的特異性裂解率達45%，且裂解效應(yīng)可被抗PD-1抗體增強，提示新生抗原在類器官中具有免疫原性。單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)：解析新生抗原特異性的“細(xì)胞異質(zhì)性”單細(xì)胞測序技術(shù)（scRNA-seq、scTCR-seq、scDNA-seq）可同時檢測單個細(xì)胞的基因表達、TCR序列和基因組變異，為解析新生抗原特異性提供了“高分辨率”工具。06scRNA-seq+scTCR-seq聯(lián)合分析scRNA-seq+scTCR-seq聯(lián)合分析通過scRNA-seq分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞的亞群（如CD8+T細(xì)胞、Treg、巨噬細(xì)胞），結(jié)合scTCR-seq獲得T細(xì)胞克隆型，可鑒定“腫瘤浸潤的抗原特異性T細(xì)胞克隆”。例如，一項對肝癌單細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞中，約5%為“新生抗原特異性克隆”，其TCR序列高度相似（提示克隆擴增），且高表達耗竭標(biāo)志物（PD-1、TIM-3），提示這些克隆在腫瘤微環(huán)境中受到抑制。2.scDNA-seq+scRNA-seq聯(lián)合分析通過scDNA-seq檢測腫瘤細(xì)胞的突變譜，結(jié)合scRNA-seq分析突變基因的表達，可明確“新生抗原陽性細(xì)胞”與“陰性細(xì)胞”的轉(zhuǎn)錄特征。例如，我們團隊發(fā)現(xiàn)，新生抗原陽性肝癌細(xì)胞高表達抗原呈遞分子（HLA-I、B2M）、免疫激活分子（PD-L1、ICOS-L），而陰性細(xì)胞高表達免疫抑制分子（PD-L2、CD47），提示新生抗原表達與腫瘤免疫逃逸機制相關(guān)。07肝癌新生抗原特異性分析的臨床意義與應(yīng)用挑戰(zhàn)臨床意義：指導(dǎo)個體化免疫治療個體化腫瘤疫苗設(shè)計新生抗原疫苗是肝癌精準(zhǔn)免疫治療的重要方向，包括mRNA疫苗、多肽疫苗、樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗等。其核心是“基于患者特異性新生抗原譜”，設(shè)計包含多個抗原肽段的疫苗（通常5-20個），以激活廣譜T細(xì)胞應(yīng)答。例如，首個進入臨床的肝癌新生抗原疫苗（NCT03463896）納入10例晚期肝癌患者，基于WES/RNA-seq篩選每個患者的4-6個新生抗原，通過mRNA疫苗遞送，結(jié)果顯示3例患者病情穩(wěn)定（SD），2例患者外周血中檢測到抗原特異性T細(xì)胞，提示疫苗的安全性及初步有效性。臨床意義：指導(dǎo)個體化免疫治療TCR-T細(xì)胞治療TCR-T細(xì)胞是通過基因工程將抗原特異性TCR導(dǎo)入患者T細(xì)胞，使其靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。新生抗原特異性TCR因具有“腫瘤特異性”，是優(yōu)于“腫瘤相關(guān)抗原（TAA）”的靶點。例如，針對AFP（肝癌相關(guān)抗原）的TCR-T細(xì)胞治療在臨床中易因AFP在正常肝細(xì)胞中的低表達導(dǎo)致肝毒性，而針對新生抗原的TCR-T細(xì)胞理論上無此風(fēng)險。目前，首個肝癌新生抗原特異性TCR-T細(xì)胞療法（NCT04990695）正在進行I期臨床，初步結(jié)果顯示患者耐受性良好。臨床意義：指導(dǎo)個體化免疫治療免疫療效預(yù)測標(biāo)志物新生抗原負(fù)荷（neoantigenburden，NAB）和新生抗原質(zhì)量（如MHC結(jié)合親和力、免疫原性）是預(yù)測免疫治療療效的關(guān)鍵標(biāo)志物。例如，一項對CheckMate459研究（納武利尤單抗vs索拉非尼治療晚期肝癌）的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，高NAB（>5mut/Mb）患者的ORR顯著高于低NAB患者（25%vs8%），且總生存期（OS）更長（15.2個月vs10.6個月）。此外，“新生抗原-特異性T細(xì)胞