第五章PCR技術(shù)及原理（4學(xué)時(shí)）研究生課程KaryMullisresearchscientistinthe1980sataCaliforniabiotechnologycompanycalledCetus

co-winnerof1993NobelPrize

第一節(jié)PCR的原理各種型號(hào)的PCR儀聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國(guó)科學(xué)家穆利斯提出的一種體外DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)基礎(chǔ)：體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶（IIIIII）拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB

引物dNTPMg2+5’

3’5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

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TemplateDNA5

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一、PCR基本工作原理Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y=2n

(n為循環(huán)次數(shù))PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng)是不是cycles越多越好？模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組分三、PCR的反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C根據(jù)PCR反應(yīng)，能否設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)易PCR儀？簡(jiǎn)易的PCR反應(yīng)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸四、PCR技術(shù)的特點(diǎn)1、高度靈敏性；2、高度特異性；3、樣品廣泛的適應(yīng)性；4、操作簡(jiǎn)單。1、高度的靈敏性PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍；

30輪循環(huán)后，擴(kuò)增量達(dá)100萬個(gè)拷貝（109拷貝）。2、高度的特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。所謂特異性：只擴(kuò)增引物之間的DNA！（1）在高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源性。（2）引物長(zhǎng)度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。引物設(shè)計(jì)原則

5’端照抄，3’端互補(bǔ)。引物的快速設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)舉例GCAATATGGCGATCGAT········CATACGTTACGGCATAATCCGACTA?如何快速設(shè)計(jì)1對(duì)引物，將紅色區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增出來？3、適用樣品的廣泛性既可是DNA，也可是RNA；既可是純化的，又可是粗制的；既可是新鮮組織，也可是陳舊樣品；既可是細(xì)胞(刮片細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、血細(xì)胞），又可是體液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。4、操作簡(jiǎn)便易行

PCR擴(kuò)增，只需數(shù)小時(shí)，就可以擴(kuò)增出大量的DNA片段，可用于檢測(cè)基因組中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。五、幾種重要的PCR衍生技術(shù)1、不對(duì)稱PCR技術(shù)；2、反向PCR技術(shù)；3、多重PCR技術(shù)；4、引物標(biāo)記PCR技術(shù)；5、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)?！?.1、不對(duì)稱PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，其最佳比例一般是0.01∶0.5μM。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板；制備雜交探針；基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究。

高濃度引物低濃度引物2、反向PCR(reversePCR)

用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶3、多重PCR在同一PCR體系中加入若干對(duì)PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。多重PCR常用來檢測(cè)同一基因的多個(gè)外顯子的缺失，或檢測(cè)缺失設(shè)置內(nèi)對(duì)照。用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物12341234DMD：人類肌營(yíng)養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對(duì)應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強(qiáng)度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失DMD基因外顯子缺失的檢測(cè)在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣本中多個(gè)不同序列的靶片段。4、LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、熒光素等對(duì)ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測(cè)目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷?？赏瑫r(shí)檢測(cè)多種基因成分。病毒1病毒2病毒3病毒4標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物5、錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對(duì)的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增。PCR的局限：需了解靶基因片段兩測(cè)的序列對(duì)于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC6、PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測(cè)探針信號(hào)可用于基因芯片的制作原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR，Is－PCR）是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位和檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。7、原位PCR操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)8、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針，檢測(cè)RNA病毒、分析基因表達(dá)等。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：以隨機(jī)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物。以oligo(dT)作為引物，mRNA3`末端polyA尾與之互補(bǔ)。以人工合成的隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴(kuò)增。reversetranscription逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增cDNART-PCR9、熒光定量PCR（real-timePCR)通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CEA基因拷貝數(shù)

CEA基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌，尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá)，因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄本，而在正常成人體內(nèi)極少表達(dá)。正常成人體內(nèi)CEA基因表達(dá)胃腸癌腫瘤組織中CEA基因的表達(dá)在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時(shí)，外周血中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用靈敏、特異的技術(shù)檢測(cè)到這些腫瘤細(xì)胞中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。10、基因的體外誘變

11、增效PCR（boosterPCR）當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增。消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成產(chǎn)物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15~20個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充引物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。12、巢式PCR（nestPCR）此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。13、差異顯示PCR（differentialdisplay）一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。差異顯示RT-PCR(DifferentialdisplayRT-PCR)5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后進(jìn)行非變性（中性）聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個(gè)核苷酸的改變即可造成DNA單鏈構(gòu)象的改變，進(jìn)而導(dǎo)致電泳速率變化，從而檢測(cè)出基因突變。14、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR-SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP）PCR-SSCP分析原理示意

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

↓

變性

↓

單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓

12345

自顯影

↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

.

解鏈構(gòu)像DNA原理過程PCR-SSCP過程用PCR-SSCP技術(shù)發(fā)現(xiàn)我第一例

LDH遺傳變異病例病例

21歲男性：

LDH：75U/L(參考范圍：110-240U/L)其余指標(biāo)均正常在三年的調(diào)查期間，LDH活力始終處于較低水平，在48-85U/L之間經(jīng)排除其它原因，如血中的抑制劑的存在、藥物的影響等可能因素外，我們懷疑可能有遺傳性的LDH變異。根據(jù)計(jì)算紅細(xì)胞中H、M亞基的比值，初步斷定為H亞基變異，采用合成的7對(duì)引物，分別擴(kuò)增LDH基因中的7個(gè)外顯子，然后用SSCP電泳法與正常人對(duì)照，發(fā)現(xiàn)變異發(fā)生在外顯子4上，由此證明該病人的長(zhǎng)期低酶活力是有基因變異引起的。六、PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用人類疾病的發(fā)生，常涉及到內(nèi)源基因的改變和外源基因的侵入。前者可引起各種遺傳性疾病或腫瘤；后者如細(xì)菌、病毒、寄生蟲等感染機(jī)體，把它們的基因也帶入人體。不論其致病是否由基因所致，也不管其基因是否整合到人體基因組中，只要病原體存在，機(jī)體就會(huì)有其核酸存在，因此PCR及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展為臨床診斷提供了行之有效的方法。1.目的基因的克隆2.基因的體外突變3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列測(cè)定5.基因突變分析大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因1、基因克隆5’5’BamHIBamHIBamHIBamHI2、基因檢測(cè)A’內(nèi)源性病變基因正常人A病人病原微生物基因正常人(-)病人(+)3、遺傳病的診斷

基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白鏈合成不平衡A正常人病人正常病人ASO探針法ACTGASO探針正常病人PCR-ASO檢測(cè)基因點(diǎn)突變:主是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段,然后用人工合成的含突變位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子

4、惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）PCR-RFLP法：限制性內(nèi)切酶Ras基因突變限制性內(nèi)切酶正常突變電泳HLA系統(tǒng)基因分型PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-SSP5、基因配型PCR-SSP12345678PCR12345678引物特異性（序列特異性引物-PCR技術(shù)）6、基因鑒定女性男性Y引物PCR男性女性7、甲基化特異性MS-PCRDNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要部分，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起重要作用。如在一般正常的細(xì)胞中，基因調(diào)控區(qū)CpG島處于非甲基化狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，這些區(qū)域往往呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。

TATA盒

CAAT盒

GC盒

增強(qiáng)子

結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列將DNA先用亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的PCR。在MS-PCR中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為甲基化特異性的引物（primerⅠ），一對(duì)為非甲基化的引物（primerⅡ），進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，最終可以確定研究DNA片段部位的甲基化情況。

MethylationspecificPCR,MS-PCR模板甲基化處理：Na2SO3

C-U需設(shè)計(jì)特異性甲基化引物G:C/A:U

3’GGACGTAGA5’甲基化引物5’---CCTGCATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCCG---5’5’GCGCATGGC3’

3’AAACATAAA5’非甲基化引物5’---UUTGUATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------AUGUGATUU---5’5’TACACATAA3’7、法醫(yī)學(xué)分析個(gè)體識(shí)別、親緣鑒定方法：PCR-RFLPDNA遺傳指紋

PCR-ASOPCR-VNTR多態(tài)性

PCR-SSCP

線粒體DNA測(cè)序PCR-VNTR多態(tài)性檢測(cè)PCR；電泳檢測(cè)（VNTR：數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列）父’父子母DNAfragments

comparedafterelectrophoresisCrimesceneSuspect1Suspect2PCR現(xiàn)嫌1嫌2嫌38、DNA多態(tài)性DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：

DNA區(qū)域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上形式,對(duì)基因沒有影響,稱為DNA多態(tài)。群體中每個(gè)個(gè)體（體細(xì)胞）的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100~500bp就有一個(gè)是不相同的，它們多位于內(nèi)含子序列中，表型并沒有改變，這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)。除一卵雙生子外，沒有兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA是完全相同的。常用做遺傳分析中的標(biāo)記---遺傳標(biāo)記DNA分析中常用的多態(tài)性標(biāo)記有3類1）RFLP