ICS

CCS

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXXXXX—XXXX

犬貓細(xì)小病毒PCR檢測(cè)方法

PCRDetectionMethodofCanineandFelineParvovirus

（征求意見(jiàn)稿）

在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)??發(fā)布

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提出。

本文件由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)歸口。

本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所、上?；`生物科技有限公司、東莞博盛生

物科技有限公司、北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

本文件主要起草人：梁瑞英、崔尚金、梁琳、湯新明、朱旭、王弋、劉昕、張啟龍

II

犬貓細(xì)小病毒PCR檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了PCR診斷技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)犬細(xì)小病毒、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（又稱貓細(xì)小病毒）

的通用PCR診斷技術(shù)。

本文件適用于檢測(cè)犬貓細(xì)小病毒核酸，適用于臨床樣品中不同型犬細(xì)小病毒和貓細(xì)小病毒的快速檢

測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19289實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范。

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4縮略語(yǔ)

CPV：犬細(xì)小病毒（CanineParvovirus）；

FPV：貓細(xì)小病毒（FelineParvovirus）；

PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）;

CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c:不同的犬細(xì)小病毒分型

5主要儀器

冰箱、臺(tái)式離心機(jī)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌器、PCR儀、單道微量移液器（0.1-2.5

μl，0.5-10μl，1-100μl，1-1000μl）、組織研磨器、水平電泳儀、紫外觀察燈或凝膠成像儀。

6試劑和材料

試驗(yàn)用水均為滅菌超純水，應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的要求、醫(yī)用棉簽、槍頭（10μl，200

μl，1000μl）、1.5mlEP管、0.2mlPCR管、dNTP（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L，

-20℃保存。）、PCR檢測(cè)引物序列及反應(yīng)液配方見(jiàn)附錄B。10%十二烷基硫酸鈉：配制參見(jiàn)附

錄A.1、蛋白酶K貯備液：配制參見(jiàn)附錄A.2、5×TBE電泳緩沖液：配制參見(jiàn)附錄A.3。

1

7實(shí)驗(yàn)步驟

7.1樣品的采集與處理

7.1.1血清樣品采集

懷疑細(xì)小病毒感染的犬貓，使用非抗凝管采集全血，詳細(xì)標(biāo)記，登記，室溫靜置30min~1h，放入

離心機(jī)并配平，4000r/min，離心5min，用移液器取離心后的上層血清至做好標(biāo)記的EP管，保存?zhèn)溆谩?/p>

7.1.2糞便或肛拭子樣品采集

使用糞便盒收集發(fā)生腹瀉的犬貓新鮮糞便，或使用棉拭子肛門(mén)轉(zhuǎn)圈采集糞便樣品加適量PBS(pH7.0)

或滅菌超純水,充分混勻后，10000r/min離心5min；取上層水加蓋，編號(hào)，保存?zhèn)溆谩?/p>

7.2核酸DNA提取

1）取樣品處理液465μl，加人25μl10%十二烷基硫酸鈉和10μl的20mg/mL蛋白酶K，56℃

水浴搖床上放置2h；

2）加入等量的飽和酚溶液500μl，振蕩混勻20s，12000g離心5min，取上清液；

3）加入等量的酚：三氯甲烷：異戊醇(25：24：1)，振蕩混勻20s，12000r/min，離心5min，

取上清液；

4）再加入等量的三氯甲烷：異戊醇(24∶1)，振蕩混勻20s，12000r/min離心5min，取上

清液；

5）最后加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻，12000r/min離心10min，棄上清；

6）室溫于燥后，加人30μl滅菌雙蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

7）另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提試劑盒進(jìn)行。

7.3PCR檢測(cè)

反應(yīng)體系見(jiàn)附錄B.2。按下述條件進(jìn)行擴(kuò)增:96℃預(yù)變性5min、（96℃30s、52℃30s、72℃45s，

重復(fù)此循環(huán)30次）72℃延伸10min。反應(yīng)完畢，取PCR反應(yīng)液進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

7.4結(jié)果判定

若待檢樣品可擴(kuò)增出大小為669bp的核酸片段（參考核酸序列見(jiàn)附錄C），則判定細(xì)小病毒核酸

陽(yáng)性；若待檢樣品未擴(kuò)增出核酸片段，同時(shí)加入的陰性對(duì)照（即核酸模板用滅菌水替代）成立，則判定

核酸檢測(cè)陰性。

2

附錄A

（資料性）

溶液配方

A.110%十二烷基硫酸鈉(SDS)

在45ml三蒸水溶解5g十二烷基硫酸鈉(電泳級(jí))，加熱至60℃溶解，用鹽酸調(diào)pH值至7.8，

加三蒸水定容至50ml。

A.2蛋白酶K貯備液(20mg/mL)

每升三蒸水中加人三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.21mg，乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg，十二

烷基硫酸鈉(SDS)5g，用鹽酸調(diào)pH值至7.8。取該溶液按每毫升加入20mg蛋白酶K，充分溶解后分裝。

A.35×TBE電泳緩沖液

每升三蒸水中加入三羥甲基氨基甲烷(Tris)54.0g，乙二胺四乙酸(EDTA)2.9mg，硼酸27.5g，

用5mol/L的鹽酸調(diào)pH值至8.0。

3

附錄B

（資料性）

引物序列、PCR反應(yīng)體系

B.1引物序列

B.1.1犬貓細(xì)小病毒核酸PCR檢測(cè)方法通用引物序列見(jiàn)表B.1。

表B.1引物序列

引物引物序列（5’-3’）犬貓細(xì)小病毒擴(kuò)增片段（bp）

上游GTAAGCTTCCAGGAGACTTT

669

下游GTAAGCTTCGTCGTGTTC

B.2PCR反應(yīng)液配方

B.2.1犬貓細(xì)小病毒核酸PCR反應(yīng)液配方見(jiàn)表B.2。

表B.2PCR反應(yīng)液配方

PCR反應(yīng)液組分反應(yīng)體系

10×PCRBuffer(withMg2+)5μl

TaqDNAPolymerase（5U/μL）0.5μl

dNTP（2.5mMeach）4μl(終濃度0.2mMeach)

上游引物（100mM）0.2μl(終濃度0.2μM)

下游引物（100mM）0.2μl(終濃度0.2μM)

待檢樣品DNA模板2.0μl（推薦0.1~1μg）

滅菌超純水（至終體積50μl）38.1μl

B.2.2注意事項(xiàng)

通常引物終濃度為0.2μM時(shí)可以獲得良好的檢測(cè)效果，可根據(jù)情況在0.1~1μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終

濃度。擴(kuò)增效率不高時(shí)，可提高引物濃度，發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度。

4

附錄C

（資料性）

擴(kuò)增核酸序列

AAGCTTCCAGGAGACTTTGGTTTGGTTGATAAAGAAGAATGGCCTTTAATATGTGCATGGTTAGT

TAAACATGGTTATGAATCAACCATGGCTAACTATACACATCATTGGGGAAAAGTACCAGAATGG

GATGAAAACTGGGCGGAGCCTAAAATACAAGAAGGTATAAATTCACCAGGTTGCAAAGACTTAG

AGACACAAGCGGCAAGCAATCCTCAGAGTCAAGACCAAGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGT

AGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAA

CAATCAAACCAACTTGGCGTTACTCACAAAGACGTACAAGCGAGTCCGACGTGGTCCGAAATAG

AGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGAACAATTGGAAGAAGATTTTCGAGACGACTTGGAT

TAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGTGTTAGTAAAGTGGG

GGGAGGGGAAAGATTTAATAACTTAACTAAGTATGTGTTTTCTTATAGGACTTGTGCCTCCAGGT

TATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGC

TGCAAAAGAACACGACGAAGCTTAC

_________________________________

5

目次

前言.......................................................................................................................................................................II

1范圍...................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...............................................................................................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.......................................................................................................................................................1

4主要儀器...........................................................................................................................................................1

5試劑和材料.......................................................................................................................................................1

6實(shí)驗(yàn)步驟...........................................................................................................................................................2

附錄A（資料性）溶液配方..............................................................................................................................3

附錄B（資料性）引物序列、PCR反應(yīng)體系..................................................................................................4

附錄C（資料性）擴(kuò)增核酸序列..........................................................................................................................5

I

犬貓細(xì)小病毒PCR檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了PCR診斷技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)犬細(xì)小病毒、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（又稱貓細(xì)小病毒）

的通用PCR診斷技術(shù)。

本文件適用于檢測(cè)犬貓細(xì)小病毒核酸，適用于臨床樣品中不同型犬細(xì)小病毒和貓細(xì)小病毒的快速檢

測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19289實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范。

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4縮略語(yǔ)

CPV：犬細(xì)小病毒（CanineParvovirus）；

FPV：貓細(xì)小病毒（FelineParvovirus）；

PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）;

CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c:不同的犬細(xì)小病毒分型

5主要儀器

冰箱、臺(tái)式離心機(jī)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌器、PCR儀、單道微量移液器（0.1-2.5

μl，0.5-10μl，1-100μl，1-1000μl）、組織研磨器、水平電泳儀、紫外觀察燈或凝膠成像儀。

6試劑和材料

試驗(yàn)用水均為滅菌超純水，應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的要求、醫(yī)用棉簽、槍頭（10μl，200

μl，1000μl）、1.5mlEP管、0.2mlPCR管、dNTP（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L，

-20℃保存。）、PCR檢測(cè)引物序列及反應(yīng)液配方見(jiàn)附錄B。10%十二烷基硫酸鈉：配制參見(jiàn)附

錄A.1、蛋白酶K貯備液：配制參見(jiàn)附錄A.2、5×TBE電泳緩沖液：配制參見(jiàn)附錄A.3。

1

7實(shí)驗(yàn)步驟

7.1樣品的采集與處理

7.1.1血清樣品采集

懷疑細(xì)小病毒感染的犬貓，使用非抗凝管采集全血，詳細(xì)標(biāo)記，登記，室溫靜置30min~1h，放入

離心機(jī)并配平，4000r/min，離心5min，用移液器取離心后的上層血清至做好標(biāo)記的EP管，保存?zhèn)溆谩?/p>

7.1.2糞便或肛拭子樣品采集

使用糞便盒收集發(fā)生腹瀉的犬貓