ICS：67.100.10

中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)：X16T/SSFS

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/SSFS0001—XXXX

乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的測(cè)定

高效液相色譜法

(征求意見(jiàn)稿)

DeterminationofIgGinmilkanddairyproducts-Liquid

chromatographymethod

20XX-XX-XX發(fā)布20XX-XX-XX實(shí)施

上海市食品學(xué)會(huì)發(fā)布

T/SSFS0002-20XX

乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的測(cè)定

高效液相色譜法

1范圍

本文件規(guī)定了乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的高效液相色譜測(cè)定方法。

本文件適用于液態(tài)乳、乳制品及有乳蛋白來(lái)源的固體飲料。

2原理

根據(jù)親和色譜和凝膠過(guò)濾色譜的原理，在磷酸鹽緩沖液條件下免疫球蛋白IgG與ProteinG配基結(jié)合，

在pH3.0冰乙酸溶液條件下洗脫免疫球蛋白IgG，通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。

3試劑和材料

注：除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1試劑

3.1.1氫氧化鈉（NaOH）。

3.1.2甘氨酸鹽酸鹽（C2H5NO2·HCl）。

3.1.3鹽酸（HCl）。

3.1.4氯化鈉（NaCl）。

3.1.5冰乙酸（CH3COOH）。

3.1.6磷酸二氫鈉（NaH2PO4）：優(yōu)級(jí)純。

3.1.7磷酸氫二鈉（Na2HPO4）：優(yōu)級(jí)純。

3.2試劑配制

1

T/SSFS0002-20XX

3.2.1淋洗液（0.05mol/LpH6.5磷酸鹽緩沖溶液）：稱取4.11g磷酸二氫鈉，2.23g磷酸氫二鈉，

加水800mL溶解并定容至1L，使用1moL/L氫氧化鈉調(diào)整pH至6.5，搖勻過(guò)膜備用。

3.2.2洗脫液（pH3.0冰乙酸溶液）：準(zhǔn)確吸取3mL冰乙酸定容至1L水中，再使用1moL/L氫氧化

鈉調(diào)pH至3.0，搖勻過(guò)膜備用。

3.2.3流動(dòng)相：稱取0.91g磷酸二氫鈉，1.76g磷酸氫二鈉，8.77g氯化鈉，加水800mL溶解，用1moL/L

氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0，定容至1L，搖勻過(guò)膜備用。

3.3標(biāo)準(zhǔn)品

免疫球蛋白IgG，純度≥95%。

3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.4.1免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0mg/mL）：準(zhǔn)確稱取10.0mg免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10mL

容量瓶中，用洗脫液（3.2.2）溶解并定容，-20保存，有效期15天。

3.4.2免疫球蛋白IgG系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液（3.4.1）0.05mL、0.10mL、0.20mL、

0.50mL、1.0mL并用洗脫液（3.2.2）定容至1mL，配制成免疫球蛋白IgG濃度分別為50.0μg/mL、

100.0μg/mL、200.0μg/mL、500.0μg/mL和1000.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用前配制。

4儀器和設(shè)備

4.1pH計(jì)：測(cè)量精度±0.03。

4.2天平：感量0.001g、0.0001g和0.00001g。

4.3震蕩器。

4.4高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。

4.5固相萃取柱：SelectCoreProteinG親和柱,1mL，或者其他等效凈化柱。

4.6低溫冷凍離心機(jī)：≥10000r/min。

4.7固相萃取裝置。

5分析步驟

2

T/SSFS0002-20XX

5.1試樣制備及處理

稱取液態(tài)奶5~15g（精確到0.001g）、奶粉1~5g（精確到0.001g）或者量取液態(tài)奶5~15mL（精確

到0.01mL）置50mL離心管中，用淋洗液（3.2.1）適量溶解，常溫充分振蕩提取5分鐘，將溶液轉(zhuǎn)移

到50mL容量瓶中，用少量淋洗液（3.2.1）至少洗滌2次，定容至刻度，然后將溶液轉(zhuǎn)入離心管中，于

4℃10000r/min離心10min，去除脂肪，重復(fù)操作1次，澄清液備用。

5.2凈化

SelectCoreProteinG親和柱，依次使用5.0mL水、10.0mL淋洗液（3.2.1）平衡，精密移取5.1項(xiàng)

下提取液10.0mL上樣至固相萃取柱上，待樣液完全流出后，再用5.0mL淋洗液（3.2.1）淋洗，棄去

全部流出液。最后用4.0mL洗脫液（3.2.2）洗脫，收集全部洗脫液，并用洗脫液（3.2.2)定容至5.0mL，

并過(guò)0.22μm濾膜，供高效液相色譜檢測(cè)分析用。

5.3色譜參考條件

色譜柱:BioCoreTMSEC-3004.6×250mm，5μm，或性能相當(dāng)者；

流動(dòng)相:150mmol/L氯化鈉溶于20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中（pH7.0）(3.2.3)；

流速：0.5mL/min；

柱溫：30℃

檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；

進(jìn)樣量：10μL。

注：建議色譜柱使用前通過(guò)對(duì)照品和空白分析比對(duì)進(jìn)行殘留測(cè)試。如遇到復(fù)雜基質(zhì)樣品無(wú)法達(dá)到分離效

果，建議可以改用300mm的SEC色譜柱達(dá)到更好的分離效果。

5.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

本法采用外標(biāo)法定量。將免疫球蛋白IgG系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3.4.2）分別注入高效液相色譜儀中，

測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算直線回歸方程。

5.5樣品測(cè)定

試樣液經(jīng)高效液相色譜儀分析，測(cè)得峰面積，采用外標(biāo)法通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

6結(jié)果計(jì)算

3

T/SSFS0002-20XX

按式（1）計(jì)算免疫球蛋白IgG的含量。

..........................................................................................................(1)

式中：

X——試樣中免疫球蛋白IgG的含量，單位為毫克每百克或者毫克每百毫升，mg/100g或mg/100mL；

c——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中免疫球蛋白IgG的濃度，單位為微克每毫升，μg/mL；

m——試樣的稱樣量，單位克，g；或者毫升，mL；

V——定容體積，單位毫升，mL；

以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

8檢出限及定量限

本方法的檢出限：當(dāng)取樣量為10g或10mL時(shí)，檢出限為0.75mg/100g或0.75mg/100mL。

本方法的定量限：當(dāng)取樣量為10g或10mL時(shí)，定量限為2.5mg/100g或2.5mg/100mL。

4

T/SSFS0002-20XX

附錄A

（資料性）

色譜圖

圖1免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

_________________________________

5

T/SSFS0002-20XX

前言

本文件按照GB/T1.1的編寫(xiě)規(guī)則起草。

本文件中附錄A為資料性附錄。

本文件由上海市食品學(xué)會(huì)提出并組織實(shí)施。

本文件由上海市食品學(xué)會(huì)歸口。

本文件起草單位：光明乳業(yè)股份有限公司、華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)北京有限公司、納譜分析技術(shù)（蘇州）

有限公司、山東悟空儀器有限公司。

本文件主要起草人：董立雅、劉振民、張鋒華、張勇、王惠玉、蘇永紅、茹曉、范維、崔芳、任艷、

曹小紅、朱旭東、侯玉、程子健、任璐、于鵬。

聲明：本文件的知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬于上海市食品學(xué)會(huì)，未經(jīng)上海市食品學(xué)會(huì)同意，不得印刷、銷售。任

何組織、個(gè)人使用本標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展認(rèn)證、檢測(cè)等活動(dòng)應(yīng)經(jīng)上海市食品學(xué)會(huì)批準(zhǔn)授權(quán)。本文件的某些內(nèi)容可能

涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件承諾執(zhí)行單位：光明乳業(yè)股份有限公司華東中心工廠、上海乳品四廠有限公司、南京光明乳

品有限公司、浙江省杭江牛奶公司乳品廠、成都光明乳業(yè)有限公司、武漢光明乳品有限公司、廣州光明

乳品有限公司、北京光明健能乳業(yè)有限公司

I

T/SSFS0002-20XX

乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的測(cè)定

高效液相色譜法

1范圍

本文件規(guī)定了乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的高效液相色譜測(cè)定方法。

本文件適用于液態(tài)乳、乳制品及有乳蛋白來(lái)源的固體飲料。

2原理

根據(jù)親和色譜和凝膠過(guò)濾色譜的原理，在磷酸鹽緩沖液條件下免疫球蛋白IgG與ProteinG配基結(jié)合，

在pH3.0冰乙酸溶液條件下洗脫免疫球蛋白IgG，通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。

3試劑和材料

注：除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1試劑

3.1.1氫氧化鈉（NaOH）。

3.1.2甘氨酸鹽酸鹽（C2H5NO2·HCl）。

3.1.3鹽酸（HCl）。

3.1.4氯化鈉（NaCl）。

3.1.5冰乙酸（CH3COOH）。

3.1.6磷酸二氫鈉（NaH2PO4）：優(yōu)級(jí)純。

3.1.7磷酸氫二鈉（Na2HPO4）：優(yōu)級(jí)純。

3.2試劑配制

1

T/SSFS0002-20XX

3.2.1淋洗液（0.05mol/LpH6.5磷酸鹽緩沖溶液）：稱取4.11g磷酸二氫鈉，2.23g磷酸氫二鈉，

加水800mL溶解并定容至1L，使用1moL/L氫氧化鈉調(diào)整pH至6.5，搖勻過(guò)膜備用。

3.2.2洗脫液（pH3.0冰乙酸溶液）：準(zhǔn)確吸取3mL冰乙酸定容至1L水中，再使用1moL/L氫氧化

鈉調(diào)pH至3.0，搖勻過(guò)膜備用。

3.2.3流動(dòng)相：稱取0.91g磷酸二氫鈉，1.76g磷酸氫二鈉，8.77g氯化鈉，加水800mL溶解，用1moL/L

氫氧化鈉溶液調(diào)pH