1、.,1,生命科學(xué)進(jìn)展,羅曉霞,.,2,中心法則,生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能，基因功能的具體體現(xiàn)者就是蛋白質(zhì)。,前言：,.,3,蛋白質(zhì)相互作用,蛋白質(zhì)可以通過某種方式與蛋白質(zhì)，核酸或其他分子之間發(fā)生相互作用而形成一定形態(tài)的蛋白復(fù)合物。,多亞基蛋白復(fù)合體,酶-底物,抗原-抗體,.,4,研究蛋白質(zhì)相互作用的重要意義,絕大多數(shù)疾病都是由特定蛋白質(zhì)相互作用所致。對200種蛋白質(zhì)及2000種組合結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析后，發(fā)現(xiàn)其中三分之一的蛋白質(zhì)相互組合會導(dǎo)致疾病；容易導(dǎo)致疾病的蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)結(jié)合以后也將變得十分活躍，致使發(fā)病和病情惡化。,蛋白質(zhì)相互作用和識別在諸如DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋

2、白質(zhì)的合成與分泌，生物催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、新陳代謝、信號傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種重要的生命過程起著重要的作用。,蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。,.,5,每一種蛋白質(zhì)不是孤立存在于細(xì)胞中，而是與其它蛋白質(zhì)或核酸或其他小分子一起進(jìn)行相互作用來行使其功能，從而使得細(xì)胞中所有蛋白質(zhì)形成一個相互作用的網(wǎng)絡(luò)，同時功能相同和相似的蛋白質(zhì)在一起組成相關(guān)的功能模塊，以完成相關(guān)的生理功能。,蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),.,6,蛋白質(zhì)相互作用的檢測和分析方法,一，酵母雙雜交系統(tǒng)，Yeast Two-Hybrid System；,二，噬菌體表面展示技術(shù) ，Phage Dis

3、play；,1. 谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀，GST-pull down；,三，基于親和層析的蛋白質(zhì)相互作用研究平臺,2. 免疫共沉淀，Co-immunoprecipitation；,3. 親和印跡，Ligand blot。,.,7,一，酵母雙雜交系統(tǒng) Yeast Two-Hybrid System,1989年Field 和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法，以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性特點為基礎(chǔ)的。,Stelzl 等(2005)和Raul 等(2005)則先后分析了人腦組織、人已知ORF中大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。,Rain 等(2001)用該法繪制了人類胃腸道病原

4、菌Helicobacter pylori 的大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用圖譜。,隨后，Giot 等(2003)和Li 等(2004)在果蠅和線蟲中也成功地研究了大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用。,.,8,酵母激活因子 GAL4：N端：147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, BD)， C端：113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activation domain, AD)。 GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 組成部分：（1）與B

5、D融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個或多個報告基因的宿主菌株。,酵母雙雜交系統(tǒng)工作原理,.,9,酵母雙雜交實驗流程,.,10,酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用范圍,檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用； 確定蛋白質(zhì)相互作用功能區(qū)域位點； 篩選與靶蛋白發(fā)生相互作用的未知蛋白。,.,11,不需分離和標(biāo)記靶蛋白，采用高拷貝和強啟動子的表達(dá)載體使雜合蛋白過量表達(dá)，避免蛋白質(zhì)純化過程； 檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，真實反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況； 敏感度高，可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用； 可進(jìn)行高通量篩選；

6、成本低，無需特殊的檢測設(shè)備。 基因型和表型相聯(lián)系，可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。,酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點,.,12,限于檢測定位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)間相互作用； 假陽性：本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能的蛋白；cDNA反向插入； 融合蛋白可能會影響蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功能。 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性,.,13,二，噬菌體表面展示技術(shù) Phage Display,噬菌體：感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。,.,14,1985年Smith 證實噬菌體fd基因組能通過基因工程的手段進(jìn)行改造。 1988年P(guān)armley 將已知抗原決定簇與噬菌體P N端融合呈現(xiàn)在其表面。 1990年McCaf

7、ferty 用噬菌體展示技術(shù)篩選溶菌酶的單鏈抗體成功使噬菌體展示技術(shù)進(jìn)入一個廣泛應(yīng)用的時代。 一系列噬菌體文庫的構(gòu)建噬菌體展示技術(shù)煥發(fā)出了新的生命力。,噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展簡史,.,15,利用固相支持物上的抗體或受體，采用親和篩選法從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合篩選分子的目的噬菌體。,在噬菌體pIII和p衣殼蛋白N端插入外源待篩基因編碼的蛋白或cDNA文庫，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面；,外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，其編碼基因可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來。,噬菌體表面展示技術(shù)原理,.,16,噬菌體表面展示操作流程,構(gòu)建cDNA文庫，使外源基因與外殼蛋白基因融合，導(dǎo)入噬

8、菌體,Display,Bind to antigen,Wash to remove unbound phage,Elute,Amplify,Analyze,Detect,Elisa,噬菌體展示技術(shù)一般要經(jīng)過多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫中含量很低的與配基特異作用的蛋白質(zhì)。,.,17,大規(guī)模篩選與特異抗體或受體相互作用的未知蛋白質(zhì)； 研究抗體或受體與抗原或底物的結(jié)合位點； 可用于構(gòu)建隨機多肽庫、抗體庫和蛋白文庫； 研究新型多肽藥物、疫苗和抗體； 可研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用的生物學(xué)過程； 非蛋白小分子與蛋白相互作用的研究； 酶作用底物的分析。,噬菌體表面展示應(yīng)用范圍,.,18,應(yīng)用范圍非常廣；

9、可用于高通量篩選； 可研究含量很低的與配體特異作用的蛋白質(zhì)； 可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。,噬菌體表面展示優(yōu)點,需要標(biāo)記的抗體或配體來檢測結(jié)合情況； 外源蛋白大小受到限制，不能研究大分子量蛋白質(zhì)的相互作用； 原核表達(dá)體系中外源蛋白質(zhì)無法正確折疊或修飾； 融合蛋白可能會影響到蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)或生物活性。,噬菌體表面展示缺點,.,19,1. 谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(GST-pull down),三、基于親和層析的蛋白質(zhì)相互作用研究平臺,2. 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),3. Ligand blot,基本原理是將一種蛋白質(zhì)或抗體固定于某種基質(zhì)上（如Seph

10、arose，NC膜或PVDF膜等），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來，然后對其進(jìn)行分析鑒定。,.,20,1. 谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(GST-pull down),1988年smith等利用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白，從此GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了極大的推廣。,GST-pull down方法是將誘餌蛋白質(zhì)和GST標(biāo)簽融合表達(dá)。一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液培育，之后利用谷胱甘肽瓊脂糖球珠將融合蛋白:目的蛋白復(fù)合物沉

11、淀下來，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或質(zhì)譜鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。,.,21,GST,X,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,細(xì)胞裂解物,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,X,Y,GST-pull down篩選未知的結(jié)合蛋白,設(shè)置GST對照，排除GST的影響,Y,Y,Y,Y,Bind,Wash to remove unbound protein,Elute,Analyze,Bind,.,22,GST-pull down驗證兩個已知蛋白的相互作用,GST,X,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,純化的Y蛋白,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,+,+,GST,純

12、化的Y蛋白,GST,Y,Y,Y,Bind,Wash to remove unbound protein,Detect,Bind,Bind,.,23,不需要制備抗體來檢測結(jié)合情況； 不需要對誘餌蛋白進(jìn)行標(biāo)記，避免了使用同位素等危險物質(zhì)；,GST-pull down的優(yōu)點,GST-pull down的缺點,2. 假陽性。蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用； 有時會檢測到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。,該方法只適用于確定體外的相互作用；,3. 融合蛋白可能會影響蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功能。,.,24,原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被

13、保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。之后純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。,2. 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),.,25,Binding,wash,elution,細(xì)胞裂解物,Detection,免疫共沉淀技術(shù)流程,.,26,檢測是在生理條件下進(jìn)行，可以真實地體現(xiàn)在生命過程中蛋白質(zhì)之間的相互作用； 可進(jìn)行大規(guī)模的篩選； 可檢測依賴于修飾的蛋白質(zhì)之間的相互作用; 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。,免疫共沉淀技術(shù)的優(yōu)點,免疫共沉淀技術(shù)的缺點,靈敏性不高。不能檢測和分析低表達(dá)量的蛋

14、白之間的相互作用； 假陽性。受免疫球蛋白的干擾容易產(chǎn)生假陽性；需要制備高質(zhì)量抗體。 以終產(chǎn)物為檢測對象，檢測不到瞬間有相互作用的蛋白質(zhì)；,.,27,3. 親和印記，Ligand blot,將PAGE膠上分離好的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測哪種蛋白能與標(biāo)記的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后通過顯影或顯色反應(yīng)信號確定相互作用蛋白，最后通過質(zhì)譜對其進(jìn)行鑒定。,.,28,誘餌蛋白的標(biāo)記技術(shù),PNAS, 2007,JBC, 2005,FEBS J, 2008,樣品蛋白的分離和固定技術(shù),Ligand blot的應(yīng)用,BBRC, 2007,.,29,1. 轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白質(zhì)復(fù)性，不能完全恢復(fù)到天然狀態(tài)；,Li

15、gand blot技術(shù)的缺點,2. 需要對蛋白進(jìn)行標(biāo)記或要制備抗體；,2. 靈敏度不高，很難鑒定分離低表達(dá)量的相互作用蛋白；,2. 實驗在體外進(jìn)行，很難鑒定修飾的蛋白或蛋白復(fù)合體。,Ligand blot技術(shù)的優(yōu)點,1. 操作簡便，尤其是對于在變性條件下也能發(fā)生相互作用的蛋白的鑒定和驗證；,2. 可鑒定靶蛋白與受體的結(jié)合位點。,.,30,Outline,Regulatory RNAs in Bacteria Discovery of sRNA Target of sRNA Prediction sRNA in Bacillus cereus group,.,31,Regulatory RNAs

16、 in Bacteria,Riboswitches CRISPR sRNAs (small RNAs),.,32,Riboswitches,位于所調(diào)節(jié)的mRNA的5端 與所調(diào)節(jié)的mRNA一起轉(zhuǎn)錄 通過改變RNA的結(jié)構(gòu)來影響轉(zhuǎn)錄或翻譯 由兩部分組成：aptamer region，結(jié)合配體； expression platform，改變RNA結(jié)構(gòu) 能感應(yīng)氨基酸，核苷酸，金屬離子等小分子，也能感應(yīng)細(xì)胞組分（如特殊的tRNA），還能感應(yīng)溫度等環(huán)境因素,.,33,Riboswitches的響應(yīng)配體的作用方式,通過改變mRNA的結(jié)構(gòu)影響轉(zhuǎn)錄或翻譯,Waters and Storz ,Cell, 2009,

17、.,34,Riboswitches響應(yīng)溫度的作用方式,低溫時，SD序列與ASD序列配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度升高時， 莖環(huán)結(jié)構(gòu)解開，露出SD序列,Henkin, Genes Dev., 2008,.,35,CRISPR結(jié)構(gòu)與功能,CAS gene:CRISPR-associated gene 功能多數(shù)未知，但往往具有DNA 或RNA結(jié)合domain，解螺旋酶 Domain，內(nèi)切酶或者外切酶domain Leader sequence：大概550bp左右 Repeated DNA：24-47bp，重復(fù)2-249 次 Spacer：26-72bp,Waters and Storz ,Cell, 20

18、09,.,36,CRISPR介導(dǎo)的phage抗性,Sorek et al., Nat. Rev. Microbiol., 2008,.,37,sRNA,sRNAs that Modulate Protein Activity Cis-encoded base pairing sRNA Trans-encoded base pairing sRNA Extend of sRNA,.,38,sRNAs that Modulate Protein Activity,大腸桿菌中作用的例子,Waters and Storz ,Cell, 2009,.,39,Cis-encoded base pairing sRNA,具有獨立的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子，沒有ORF 一般由目標(biāo)mRNA的互補鏈編碼，直接位于ORF的互補鏈或者operon的中間 與目標(biāo)mRNA某區(qū)域完全配對 目前大部分來源于噬菌體，質(zhì)粒