1、,第16章 組織工程,本章主要內(nèi)容 1.組織工程及其三要素 2.組織工程技術(shù)路線 3.組織工程反應(yīng)器 4.組織工程產(chǎn)品,本節(jié)主要問(wèn)題,種子細(xì)胞、組織工程材料、影響因子,16.1 組織工程及其三要素,1. 定義,組織工程(Tissue Engineering) ：是利用生命科 學(xué)、醫(yī)學(xué)、工程學(xué)原理與技術(shù)，單獨(dú)或組合地利 用細(xì)胞、生物材料、細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)或器官 再生的一門技術(shù)。 20世紀(jì)80年代提出概念。,Joseph P. Vacanti,John Homans Professor of Surgery at Harvard Medical School,Robert Langer,Pro

2、fessor of Chemical and Biomedical Engineering at MIT,2. 組織工程三要素,1.種子細(xì)胞,2.支架材料,3.影響因子,（一）種子細(xì)胞,1.定義,種子細(xì)胞(Seed cell)：是組織修復(fù)或再生的細(xì)胞材料。 2.來(lái)源,（1）干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞。,（2）功能細(xì)胞：組織來(lái)源的體細(xì)胞。 3.特點(diǎn),容易獲得和體外培養(yǎng)、遺傳穩(wěn)定。 4.問(wèn)題,（1）同種、異種細(xì)胞存在免疫排斥等問(wèn)題。,（2）干細(xì)胞潛在的理想種子細(xì)胞，誘導(dǎo)分化技術(shù)有待完善。 （3）多種類型細(xì)胞協(xié)調(diào)增殖、分化。,以骨為例,1-細(xì)胞,成骨細(xì)胞：合成ECMs、礦物質(zhì)、 膠原，組裝成新骨

3、,破骨細(xì)胞：分泌酶使ECMs、礦物 質(zhì)、膠原被吸收,軟骨細(xì)胞：合成ECMs構(gòu)成軟骨 干細(xì)胞,2-支架,羥基磷灰石Ca5(PO4)3OH，HA、,膠原纖維,3-生長(zhǎng)因子,骨形態(tài)發(fā)生蛋白,（二）支架材料,1.定義,組織工程支架材料是 指替代細(xì)胞外基質(zhì)使 用的生物醫(yī)學(xué)材料材 料。,纖維支架材料,細(xì)胞外基質(zhì),(extracellular matrixc, ECM ),（1）定義：動(dòng)物細(xì)胞合成并分泌到胞外、分布在細(xì) 胞表面或細(xì)胞之間的大分子。,（2）分布：結(jié)締組織中ECM含量較高。,（3）組成：構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的大分子包括：膠原、 非膠原糖蛋白、彈性蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖四大 類。,（4）功能：,1）E

4、CMs提供細(xì)胞所需的力學(xué)和化學(xué)信息，是細(xì)胞發(fā) 揮功能的環(huán)境；對(duì)細(xì)胞群體有支持、保護(hù)的作用。 2）ECMs對(duì)細(xì)胞形態(tài)、遷移、增殖、分化有調(diào)節(jié)作用 。,2.特點(diǎn),（1）生物相容性：生物醫(yī)學(xué)材料引起宿主反應(yīng) 和產(chǎn)生有效作用的能力。,（2）生物降解性：材料完成支架的作用后能被 降解，降解速率與細(xì)胞生長(zhǎng)速率相互協(xié)調(diào)。 （3）合適的三維立體結(jié)構(gòu)。,（4）加工性與一定的機(jī)械強(qiáng)度。 （5）良好的消毒性能。,3.分類,有機(jī)材料與無(wú)機(jī)材料、天然材料和人工合成材料 、單一材料和復(fù)合材料。,（1）有機(jī)材料,1）天然高分子材料,膠原、殼聚糖、透明質(zhì)酸等。,A蛋白類,膠原（Collagen）,膠原是細(xì)胞外最重要的水不溶性

5、纖維蛋白, 是 構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架，是胞外基質(zhì)重要的 結(jié)構(gòu)蛋白。,根據(jù)組成的氨基酸與聚合度不同有10種。具 有高度纏繞的螺旋結(jié)構(gòu)的纖絲，由纖絲與其 他基質(zhì)分子相互作用達(dá)到組織需要的強(qiáng)度、 彈性。,成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì) 胞等合成或分泌，分布于各個(gè)部位。,B多糖類,殼聚糖（Chitosan）,甲殼質(zhì)的基本單位是乙酰葡萄糖胺，它是由10003000 個(gè)乙酰葡萄糖胺殘基通過(guò)p1，4糖甙鏈相互連接而成聚合 物，是節(jié)肢動(dòng)物角質(zhì)內(nèi)的主要結(jié)構(gòu)多糖。,殼聚糖是甲殼質(zhì)的部分脫乙?；a(chǎn)物，具有陽(yáng)離子性 質(zhì)，因此可以吸引糖胺聚糖、蛋白聚糖等帶負(fù)電荷的大,分子聚集在支架內(nèi)，即利于收集組織液中的生長(zhǎng)因

6、子。,透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid,HA）,透明質(zhì)酸是由N-已酰氨基 葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的 重復(fù)結(jié)構(gòu)組成的線形多糖 結(jié)構(gòu)。,在結(jié)締組織中比較豐富。 透明質(zhì)酸可高度水化，對(duì) 組織的水分平衡和關(guān)節(jié)的 潤(rùn)滑有重要作用，已經(jīng)在 整形外科中被廣泛采用。 保護(hù)及潤(rùn)滑細(xì)胞，在化妝 品、美容行業(yè)廣泛使用。,2）合成高分子材料,聚乳酸（Polylacticacid，PLA）,聚羥基乙酸 （Polyglycolicacid，PGA）,聚羥基丁酸（Polyhydroxybutyrate,PHB）等。,（2）無(wú)機(jī)材料,氧化鋁陶瓷、碳纖維、生物陶瓷、羥基磷灰石、合金 等，主要用于人工骨、人工肌腱、人工關(guān)

7、節(jié)等。,例如：鈷、鈦、鋼鐵基合金金屬材料組成人工髖關(guān)節(jié)的 股骨頭、膝關(guān)節(jié)的股骨髁的表面，超高分子聚乙烯材料 組成人工髖關(guān)節(jié)的髖臼股份、人工膝關(guān)節(jié)的脛骨平臺(tái)部 分，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥用于人工關(guān)節(jié)假體與骨組 織的固定。,（3）復(fù)合材料,復(fù)合材料：由兩種或兩種以上不同物理化學(xué)性質(zhì)的材 料復(fù)合而成的新材料，一般由基體材料和增強(qiáng)材料組 成。,包括無(wú)機(jī)材料、有機(jī)材料、天然材料與合成材料間的 組合。,例如：羥基磷灰石-甲殼素、羥基磷灰石-PLA、聚乳酸 （Polylactic acid,PLA）-聚羥基乙酸（Polyglycolic acid,PGA）：PLGA等。,聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）,

8、（三）影響因子,細(xì)胞對(duì)外部環(huán)境產(chǎn)生的應(yīng)答是通過(guò)感知某種化學(xué)信號(hào)或 物理刺激，并將之傳遞到細(xì)胞核中，促發(fā)或者抑制基因 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞的增殖與分化由各種因子調(diào)節(jié)。,1.物理因子,主要是應(yīng)力的作用：,流體切應(yīng)力（Flow shear stress）：由血流對(duì)血 管壁施加的力。體外可采用常流和脈動(dòng)流循環(huán)裝 置調(diào)節(jié)切應(yīng)力大小。,張應(yīng)力（Tensile stress）： 體內(nèi)有心臟搏動(dòng)， 肌肉收縮等張應(yīng)力?？刹捎脧椥耘菽蚣徔椌W(wǎng)等 載體材料模擬體內(nèi)的張應(yīng)力。,2. 細(xì)胞生長(zhǎng)因子,細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Cell growth factor）主要是指在細(xì)胞間傳 遞信息、對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)功能的一些多肽。,轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)

9、因子-（Transforming growth factor-,TGF- ）： 一種分泌型的多功能蛋白，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分 化與細(xì)胞外基質(zhì)分泌，參與炎癥和組織的修復(fù)。,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP) ： 1965年于脫礦化骨的骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的，因其能誘導(dǎo)骨、軟骨 形成而得名。,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth,factor,FGF）：是不含糖的分子量為16KD的單鏈 多肽，因能促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)而得名。由于對(duì) 血管也有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，又稱為血管生長(zhǎng)因子 ?？梢哉T導(dǎo)血管化、骨形成并促進(jìn)神經(jīng)再生。,表皮生長(zhǎng)因子（Epiderm

10、al growth factor,EGF） ：是由53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。是表皮細(xì)胞 和間充質(zhì)細(xì)胞的一種有效的促分裂劑。能促進(jìn)傷 口愈合，在體外可以刺激角化細(xì)胞分裂，在體內(nèi) 促進(jìn)上皮的再生。,神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (Nerve growth factor,NGF) 為神經(jīng)細(xì)胞特 異性分泌的營(yíng)養(yǎng)蛋白，是具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)神經(jīng)元及促進(jìn) 突起生長(zhǎng)等生物學(xué)功能的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。對(duì)中樞及 周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、修復(fù)、再生和功能特 性均有重要的調(diào)控作用。,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF） 因 最初被發(fā)現(xiàn)可剌激肝細(xì)胞合成DNA而得名，是由728個(gè)氨 基酸殘基組成的

11、多肽單鏈。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子是目前已知 生物活性最廣泛的生長(zhǎng)因子之一，能刺激多種上皮和內(nèi) 皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂、運(yùn)動(dòng)，能促進(jìn)腎小管形態(tài)發(fā)生， 在腎臟的發(fā)育、再生中具有較強(qiáng)的作用。,生長(zhǎng)因子研究與制備,骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ BMPs）,1965年美國(guó)首先從骨基質(zhì)中分離出骨形態(tài)發(fā)生蛋 白，經(jīng)過(guò)25年才得以純化。隨后克隆了相關(guān)基因。 原位狀態(tài)下以ng/g骨基質(zhì)劑量釋放足以促發(fā)骨修復(fù)， 人工基質(zhì)需要mg/g劑量才能促發(fā)骨修復(fù)，因此成本 非常高。,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BMP基因轉(zhuǎn)染到骨髓細(xì)胞中，再 將其種植在礦化基質(zhì)上，達(dá)到骨修復(fù)的目的。,16.2 組織工程技術(shù)路線,移植 組織器官 再生,原位修復(fù) 替換,種子細(xì)胞 支

12、架材料 信號(hào)分子、生長(zhǎng)因子,（1）,（2）,（3）,（一）細(xì)胞接種,浸漬法：將經(jīng)預(yù)濕處理材料置于細(xì)胞懸浮液中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞接種。,沉淀法：將細(xì)胞液緩慢逐滴滴加到已經(jīng)預(yù)濕的支架材料上，放置 培養(yǎng)箱中2-4小時(shí)，待細(xì)胞充分粘附后緩慢加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。,凝膠法：將高密度細(xì)胞懸浮液與多種物質(zhì)如膠原、藻酸納、幾丁 質(zhì)等按照一定工藝復(fù)合形成凝膠，細(xì)胞均勻地分布于凝膠內(nèi)。,吸附法：將已預(yù)濕的支架材料置于培養(yǎng)皿中細(xì)胞懸液中或用滴管 將細(xì)胞液滴加在材料上，然后利用負(fù)壓使細(xì)胞吸附在材料上。,（二）細(xì)胞因子的控制釋放,1.在支架材料構(gòu)建時(shí)使細(xì)胞因子結(jié)合在支架材料 內(nèi)部，并能緩慢釋放。,2.包埋或者微囊化是目前控制細(xì)胞生長(zhǎng)因

13、子釋放 的一個(gè)重要方法,16.3 組織工程生物反應(yīng)器,1.微重力旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器,（1）轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器：一般由兩個(gè) 內(nèi)外同心圓柱組成。內(nèi)柱由半透膜構(gòu)成 ，氣體可通過(guò)膜交換。內(nèi)外柱之間充以 連續(xù)灌注的培養(yǎng)介質(zhì)。將細(xì)胞與培養(yǎng)液 置入內(nèi)、外圓柱體。整個(gè)裝置可以繞內(nèi) 軸旋轉(zhuǎn)，離心力與重力平衡，為細(xì)胞生 長(zhǎng)提供一個(gè)微重力環(huán)境。,普通培養(yǎng)條件下只能呈二維貼壁生長(zhǎng)的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)出三維增殖與分化形 成有功能的組織塊。,（2）流體應(yīng)力生物反應(yīng)器,模擬人體血管應(yīng)力環(huán)境而設(shè)計(jì)的用于體外構(gòu)建組織工程 化血管的裝置。,主要由可以通過(guò)循環(huán)液體的硅膠管、壓力傳感器、蠕動(dòng) 泵、儲(chǔ)液罐、電磁閥等組成?？赏ㄟ^(guò)形成有波動(dòng)的

14、液流 并能控制流量來(lái)模擬體內(nèi)血管的應(yīng)力環(huán)境。,16.4 組織工程應(yīng)用,1. 組織工程皮膚,中國(guó)每年燒傷、潰瘍等皮 膚疾病1500萬(wàn)人，需要 皮膚移植的約350萬(wàn)，需 4億立方厘米。,人工表皮、復(fù)合人工皮,A 表皮,B 表皮網(wǎng)狀 棘,C 真皮乳頭 D 真皮,E 皮下組織 F 毛發(fā),組織工程皮膚技術(shù)路線,構(gòu)建步驟,（1）種子細(xì)胞與培養(yǎng)液,成纖維細(xì)胞：DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青 霉素、鏈霉素等。,表皮角質(zhì)形成細(xì)胞：DMEM+Ham F-12培養(yǎng)基、 表皮生長(zhǎng)因子等。,（2）支架材料,聚羥基乙酸（PGA）。,（3）構(gòu)建成纖維細(xì)胞-PGA復(fù)合物,酶法消化收集真皮成纖維細(xì)胞，接種在PGA上， 加入

15、培養(yǎng)液培養(yǎng)。,（4）接種表皮角質(zhì)形成細(xì)胞在前面的復(fù)合物 上，更換表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)5天左右。,（5）雙層皮膚成熟,將復(fù)合物放在可滲透膜上，進(jìn)行氣-液界面培養(yǎng)， 促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的進(jìn)一步分化。,再培養(yǎng)1周，形成含真皮和表皮兩層結(jié)構(gòu)的組織 工程化皮膚。,難題 ：,1.血管化：血管生成是指內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)筑的毛細(xì)血 管分支和伸展。血管生成有助于損傷組織的修復(fù)。 2.毛囊、汗腺等再生。所以美容慎用。 3.排異性。,我國(guó)人造皮膚2007年第四軍醫(yī)大學(xué)開(kāi)發(fā)成功，進(jìn) 入臨床階段。,二 神經(jīng)修復(fù)工程,神經(jīng)遠(yuǎn)端軸突和髓鞘崩潰時(shí)，大量吞噬細(xì)胞 侵入，一方面清除軸突髓鞘的碎屑，另一方 面刺激原來(lái)處于休眠狀態(tài)的

16、雪旺細(xì)胞,(Schwann cellSC)分裂和增生，并沿著每 一根神經(jīng)纖維的神經(jīng)內(nèi)膜和基底膜排列成柱 狀，形成一個(gè)潛在的管道（即Buengner氏細(xì) 胞帶）；再生軸突通過(guò)Buengner氏細(xì)胞帶， 伸延到終末器官，恢復(fù)其功能。最后產(chǎn)生髓 鞘，形成為有髓神經(jīng)纖維。,（一）種子細(xì)胞,雪旺細(xì)胞(Schwann cellSC)：SC形成能引 導(dǎo)再生軸突生長(zhǎng)的Buengner氏細(xì)胞帶，并能 分泌多種細(xì)胞因子調(diào)控再生軸突生長(zhǎng)。,（二）支架材料,目前比較常用的生物材料是聚 羥基乙酸(polyglyeolic acidPGA)和聚乳酸,(polylactic acidPLA)。 制成直線的絲狀有利于SC排列

17、 成線狀，為形成Buengner氏細(xì) 胞帶制造有利條件。,此外材料要及時(shí)降解，讓位給 成長(zhǎng)的有髓神經(jīng)。,（三）生物人工肝,生物人工肝（Bioartificial liver）由肝 細(xì)胞、專用反應(yīng)器和體外循環(huán)系統(tǒng)三 大部分組成，是將患者的血槳在體外 循環(huán)代謝的一種輔助裝置。,由許多空心的纖維毛細(xì)管集束組成， 肝細(xì)胞在毛細(xì)管外空間培養(yǎng)或者粘附 在微載體上培養(yǎng)，患者血槳通過(guò)泵循 環(huán)進(jìn)入毛細(xì)管，這樣肝細(xì)胞和血槳間 分子可以自由交換，肝細(xì)胞吸收氧和 營(yíng)養(yǎng)物，脫除血槳中的有害、有毒物 質(zhì)，并將肝細(xì)胞代謝物質(zhì)傳輸至血槳 內(nèi)輸送回體內(nèi)。,提供肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子在體 外維持正常功能。,最新進(jìn)展,成體干細(xì)胞

18、再生角膜：, .html,干細(xì)胞培育人心臟組織：, html,組織工程問(wèn)題與挑戰(zhàn),1.干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù) 2.種子細(xì)胞分離與培養(yǎng) 3.接種支架材料的方法 4.支架材料的設(shè)計(jì)與優(yōu)化,5.細(xì)胞因子的釋放、與支架材料相結(jié)合的設(shè)計(jì)，種 子細(xì)胞表達(dá) 6.血管化,7.復(fù)雜性：多細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)、分化控制 8.體外組織器官再生機(jī)理有待揭示 。,再 生,鳳凰(Chinese,phoenix/phoenix)：雄的叫鳳 ，雌的則叫凰。象征祥瑞。 神話中說(shuō)，鳳凰每次死后， 會(huì)周身燃起大火，然后其在 烈火中獲得重生，并獲得較 之以前更強(qiáng)大的生命力，稱 之為“鳳凰涅磐”。,蚯蚓被截為兩截以后，斷面上肌肉組織快速溶 解，然

19、后形成新的細(xì)胞團(tuán)。這時(shí)，血液中所含的 白細(xì)胞也會(huì)同時(shí)集中在切面上，形成特殊的栓 塞，從而使傷口快速閉合。,中胚層細(xì)胞還具有十分強(qiáng)的分化能力，快速移動(dòng) 至傷口切面上來(lái)，在切面上形成一個(gè)個(gè)結(jié)節(jié)狀的 凸起，就被稱為再生芽。,同時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的消化道、血管，以及神經(jīng)系統(tǒng) 等組織的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)許多分裂，快速地向再生芽 里不斷生長(zhǎng)，切面上就會(huì)快速地再生出另外一個(gè) 頭來(lái)，并且另一端也會(huì)自然生出一條尾巴來(lái)。,器官移植,圣經(jīng)中，上帝始造天地耗時(shí)七日，在第六日 里用泥土按自己的形狀捏成個(gè)泥人，然后吹了一 口仙氣于其中，亞當(dāng)便有了生命。,上帝造了亞當(dāng)之后，讓他當(dāng)世間萬(wàn)物的主宰，還 給他建了個(gè)園子，取名為伊甸園（Eden），其意 為“樂(lè)事，愉快”。,取其第七肋骨塑成女狀，再吹之以仙氣，遂成夏 娃（意即“賦予生命”）。,亞當(dāng)與夏娃,荷馬伊利亞特中，描繪了一 個(gè)叫做凱米拉（Chimera）的怪 獸：獅頭、羊身、蛇尾，并且背 部及尾部又分別伸出一羊頭和蛇 頭。在現(xiàn)代移植學(xué)中，凱米拉一 詞譯為嵌合體。,丹麥童話 美人魚(yú)（安徒生）,