1、1,基因克隆的技術(shù)路線(xiàn),2,基因工程（上游）大體步驟,獲取目的基因,目的基因與載體連接,連接產(chǎn)物導(dǎo)入細(xì)胞,目的基因表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄PCR法 PCR法 直接調(diào)用法,各種質(zhì)粒 各種病毒 皆經(jīng)改造,原核細(xì)胞 真核細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 植物細(xì)胞,3,第一節(jié) 獲得目的基因,4,直接分離目的DNA 經(jīng)限制酶切割，電泳分離DNA片斷。 適用于獲得細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒等低等生物的基因片段。 真核生物的染色體DNA中含有內(nèi)含子序列，不適合于基因工程的需要。,5,2. cDNA文庫(kù),The cDNA library :contains only complementary DNA molecules synthesized

2、 from mRNA molecules in a cell. 以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)DNA。以此得到的某種細(xì)胞內(nèi)所有mRNA的cDNA，稱(chēng)為cDNA文庫(kù)。,6,3. RT-PCR,基本原理： 將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。,7,第二節(jié) 重組DNA分子的構(gòu)建,8,Link of cohesive end,粘末端連接,一.目的基因與載體的連接,9,Link of blunt end,平末端連接,10,平末端連接,Recombinant DNA,T4 DNA ligase,vector,1,11,平末端連接的缺點(diǎn) *more difficult

3、ligation 連接困難 *2-direction insertion 雙向插入 *self-reconnection 自身環(huán)化 *no easy way of retrieving the insert 重新篩選插入的片斷困難,12,vector,1,2,vector,1,2,A,A,B,A,B,平齊末端連接時(shí)，插入的方向是隨機(jī)的，稱(chēng)為雙向插入。會(huì)給后續(xù)的工作造成很多麻煩。,13,EcoRI,EcoRI,單酶切粘末端連接,14,單酶切粘末端連接的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)*Using the same one enzyme to cut 用同一種酶切 *Ligated easily and covenie

4、ntly 連接容易方便 缺點(diǎn)*Self-reconnection of vector 載體自身環(huán)化 *Inserted in two directions 雙向插入,15,單酶切粘末端的雙向插入,G CTTAA,AATTC G,AATTC G,G CTTAA,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,AATTC G,16,17,AATTCxxxxxxA GxxxxxxTTCGA,G AGCTT CTTAA A,GAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAA,ligase,雙酶切粘末端連接,EcoRI HindIII,EcoRI HindIII,18,雙酶切粘末端

5、連接的特點(diǎn),*Using the same two enzymes to cut *Ligated easily and conveniently *no self-reconnection of vector *Inserted in one direction 定向插入 缺點(diǎn) 操作比較麻煩。如果兩種酶要求的條件不同，需要進(jìn)行兩個(gè)階段的反應(yīng)。,19,幾種實(shí)驗(yàn)方法,利用相應(yīng)的技術(shù)方法，使實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。,20,Link of homopolymeric tails,添加同聚尾避免質(zhì)粒的自身環(huán)化,末端轉(zhuǎn)移酶,21,添加接頭，引入限制酶的切割 位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的酶切割。,22,野生型細(xì)菌具有針對(duì)外源

6、DNA的限制和修飾系統(tǒng)，會(huì)切割外源DNA分子。因此用于基因工程的受體菌，需經(jīng)篩選和人工改造。,第三節(jié) 重組子導(dǎo)入細(xì)胞,23,外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過(guò)程叫做轉(zhuǎn)化。 但不包括由病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)入 。常用的方法有兩種：,24,The first is a chemical method utilizing CaCl2 and heat shock to promote DNA entry into cells. 氯化鈣法 ：利用氯化鈣和熱休克使受體菌成為感受態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)外源 DNA的進(jìn)入。,25,宿主細(xì)胞與重組DNA在00C的氯化鈣溶液中孵育，快速轉(zhuǎn)入420C造成熱休克。經(jīng)此處理后的細(xì)胞“容易”接受

7、外源的DNA，一般叫做感受態(tài)細(xì)胞。,26,處理宿主細(xì)胞 低滲溶液熱休克 E.coli + 0.1M CaCl2 competent (E.coli) cells 被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,Low-osmosis makes cell expanding,0-4,Recombinant DNA + 42 ,Heat makes cell more expanding and membrane more permeable,27,處于感受態(tài)的細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有改變， 通透性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子易于進(jìn)入細(xì)胞。,28,其他處理受體細(xì)胞的方法,利用二甲基亞砜（DMSO）處理細(xì)胞 二巰基蘇糖醇（DTT）處

8、理細(xì)胞。 利用聚乙二醇（PEG）處理細(xì)胞。,29,When competent cells are mixed with DNA， some cells (actually, very few) become transformed: they acquire recombinant vector DNA.,Pseudo-positive,positive,30,第四節(jié) 重組子的篩選與鑒定,31,After transformation，only a few cells take up the plasmid DNA，and there only has one recombinant mol

9、ecule in one recipient cell(受體細(xì)胞)，so a method is needed for selecting those 轉(zhuǎn)化步驟后，轉(zhuǎn)進(jìn)重組質(zhì)粒的細(xì)胞是較少的。因此需要挑選出含有重組子的細(xì)胞。,32,Direct selection 直接篩選 Antibotic resistance 抗菌素抗性 Marker rescue selection 借助顏色篩選 In situ hybridization 原位雜交 Immunology selection 免疫篩選 Immunochemistry method 免疫化學(xué) Enzyme immunodetection

10、assay 酶免疫分析,33,質(zhì)粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)該抗性基因表達(dá)出可水解氨芐青霉素的酶，因而宿主細(xì)胞可在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長(zhǎng)。,利用抗生素抗性篩選,34,復(fù)制起點(diǎn),氨芐青霉素抗性基因,35,36,37,2.利用顏色篩選 插入失活現(xiàn)象,X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷,38,多克隆位點(diǎn),半乳糖苷酶的基因內(nèi)有多克隆位點(diǎn)，酶切插入外源DNA后，該基因無(wú)法表達(dá).,39,40,完整的LacZ基因內(nèi)，經(jīng)過(guò)改造加入了多克隆位點(diǎn)，但并不影響LacZ基因的表達(dá)。 當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，完整的LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)菌的有關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物共同組成有功能的半乳糖苷

11、酶，該酶把無(wú)色的X-gal切割成半乳糖和藍(lán)色的5溴4氯靛藍(lán)，使得菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。,41,表示外源基因插入編碼半乳糖苷酶的基因區(qū)段,42,43,44,藍(lán)色菌落 無(wú)插入序列,白色菌落 含插入序列,轉(zhuǎn)化菌具有氨芐青霉素抗性，可在 加有氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)。,45,使用含Amp+X-Gal的瓊脂糖平板篩選克隆，可能出現(xiàn)三種情況。 1 . 載體自身環(huán)化，產(chǎn)生藍(lán)色菌落； 2 帶有正確插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，不能生長(zhǎng)。,46,47,Blue colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pVector

12、 and express a functional alpha fragment from an intact LacZ alpha coding sequence. White colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pInsert and do not produce LacZ alpha fragment.,48,49,3. In situ hybridization 原位雜交 生長(zhǎng)在瓊脂糖平板上的菌落，可定點(diǎn)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加入放射性的探針（即帶有 放射性的與目的片斷互補(bǔ)的核酸片斷），與菌落雜交。

13、經(jīng)洗滌后的膜與X光膠片作用，挑選出陽(yáng)性克隆。,50,51,DNA hybridization,52,53,54,55,56,免疫法篩選,外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的蛋白質(zhì)，可與特異性的抗體結(jié)合。,57,利用抗體篩選 原理 目的基因編碼的蛋白質(zhì)作為抗原，用特異性抗體與之反應(yīng)，再根據(jù)顏色等變化，篩選出菌落。 方法 在瓊脂平板上的菌落，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，若某菌落帶有目的基因，并可表達(dá)該目的基因所編碼的蛋白質(zhì)，則加入該蛋白質(zhì)的特異抗體，可與該菌落結(jié)合，附著在濾膜上，不會(huì)被洗掉。該抗體可攜帶酶或熒光，易于檢測(cè)。,58,Screening with antibodies is used when cloned

14、 gene is expressed and antibodies recognizing the encoded protein are available.,59,第五節(jié) 基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定,60,基因表達(dá),基因表達(dá)指某基因在細(xì)胞中 轉(zhuǎn)錄為mRNA繼而翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。,61,研究基因表達(dá)的手段,1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白質(zhì)） 4、免疫組化 （蛋白質(zhì)）,62,1、RT-PCR,基本原理： 將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)PCR產(chǎn)物的 量，判斷基因表達(dá)的強(qiáng)度。,63

15、,2、Northern blot,標(biāo)記探針與膜固相RNA雜交。 根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱判斷表達(dá)量， 根據(jù)雜交信號(hào)位置判斷分子長(zhǎng)度。,雜交信號(hào),64,實(shí)驗(yàn)操作：,1）RNA提取 2）RNA電泳（分離不同長(zhǎng)度RNA) 3）轉(zhuǎn)膜 (形成固相RNA) 4）探針標(biāo)記（同位素/非同位素） 5）雜交 6）洗膜 7）顯影（放射性/酶促反應(yīng)）,65,Northern blot 特點(diǎn)：,因?yàn)闆](méi)有擴(kuò)增過(guò)程，Northern blot 的 結(jié)果可靠性高?？梢源_定未知基因的 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）長(zhǎng)度。,優(yōu)點(diǎn)：,缺點(diǎn)： 1、操作煩瑣 2、使用同位素可能污染環(huán)境 3、靈敏度低 4、對(duì)RNA質(zhì)量要求高,66,3、Western blot,標(biāo)記抗體與固定在膜