1、實(shí)驗(yàn)二 柱色譜法分離甲基橙和亞甲基藍(lán)硅膠粘合薄層板的鋪制 指導(dǎo)老師 黃紅霞,色譜法是分離純化和鑒定有機(jī)物的重要方法之一。 色譜法可分為柱色譜、紙色譜、薄層色譜、氣相色譜及高效液相色譜等類(lèi)型。,思考題： 1、色譜法的基本原理? 2 、柱色譜與薄層色譜之間有怎樣的區(qū)別與聯(lián)系 3 、如何選擇洗脫劑？ 4 、裝柱時(shí)，應(yīng)該注意哪些問(wèn)題？ 5、 色譜柱一般的直徑和高度比例是多少? 6 、柱色譜分為幾類(lèi)?分別用什么作吸附劑? 7、 常用的三氧化二鋁吸附劑分為幾種? 8、 吸附劑在使用前必須如何處理? 9、 被分離樣品的量與吸附劑用量之比是多少? 10、 洗脫時(shí)要注意些什么 ?,柱色譜：1905 年俄科學(xué)家茨

2、維持首次采用裝有碳酸鈣的柱子，分離葉綠素獲得成功而創(chuàng)立了柱色譜法。 分類(lèi)：常用的有吸附色譜和分配色譜兩類(lèi)。前者常用氧化鋁或硅膠為吸附劑。后者以硅膠、硅藻土等為支持劑，以吸收大量的液體為固定相。（答1）當(dāng)加入洗脫劑時(shí)，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下流動(dòng)，繼續(xù)洗脫時(shí)，吸附能力弱的組分隨溶劑首先流出。在連續(xù)洗脫過(guò)程中，不同組分或不同色帶就能分別收集，從而達(dá)到分離純化的目的。,柱色譜與薄層色譜之間的區(qū)別與聯(lián)系（答2）,薄層色譜和柱色譜不同點(diǎn)：固定相的形狀和展開(kāi)劑的移動(dòng)方向 薄層色譜和柱色譜相同點(diǎn)：在分離原理上基本相同。,3、柱色譜（柱層析） （1）在薄層色譜的基礎(chǔ)上，進(jìn)行混合物的

3、分離 （2）分類(lèi)：吸附型（Al2O3、硅膠G等作吸附劑） 分配型（硅藻土、纖維素等作支持劑）（答6） （3）吸附柱色譜 1）吸附劑：一般采用表面積很大，經(jīng)過(guò)活化的多孔 性或粉狀的固體 氧化鋁（酸性、中性、堿性）3種（答7） a、用前應(yīng)純化并在105-110活化0.5h，于烘 箱中自然冷卻 (答8) b、吸附劑用量 被分離樣品的量與吸附劑用量之比 被分離樣品：吸附劑量=1：30-40或100倍(答9）,2）樣品： 3）洗脫劑：溶劑的結(jié)構(gòu)與吸附能力的關(guān)系 化合物的吸附性與它們的極性成正比即 極性大吸附力強(qiáng)，后洗脫。 洗脫劑的選擇（答3） 第一，先極性小的，再極性大的 可以是單一溶劑，也可是混合溶劑

4、 第二，溶劑純度要高并經(jīng)干燥過(guò)的 4）色譜柱的裝填分為： 干法和濕法兩種（今天用濕法） 柱高和柱直徑之比=7.5 ：1（答5）,常用洗脫劑的極性：,石油醚 環(huán)己烷 四氯化碳 甲苯 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚乙酸乙酯 丙酮 乙醇甲醇 水 乙酸,裝柱時(shí)應(yīng)該注意的問(wèn)題（答4）,裝柱時(shí)應(yīng)該注意均勻，不能有氣泡，裂縫，否則樣品可能順縫隙流動(dòng)而不吸附，影響樣品的分離，應(yīng)用質(zhì)軟的物體如吸耳球等輕輕敲擊柱身，促使吸附劑裝填緊密，排除氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上端平整，無(wú)凹凸面,洗脫時(shí)應(yīng)注意：（答10） （1）向柱內(nèi)加入95%乙醇溶液洗脫（可以通過(guò)注射器沿管壁或安裝滴液漏斗）在恒壓或加壓條件下進(jìn)行洗脫?？刂屏鞒鏊俣?

5、滴/秒。逐漸出現(xiàn)色層帶分離。 （2）第一色層帶到達(dá)色譜柱底部時(shí)，立即用錐形瓶收集第一色層的溶液，直到其完全被洗出?！咀⒁狻肯疵摃r(shí)切勿使溶劑流干！ （3）然后，改用水溶液作為洗脫劑，當(dāng)?shù)诙珜訋У竭_(dá)色譜柱底部時(shí)，立即收集第二色層的的溶液，直到其完全被洗出。 （4）用量筒分別量取所分離出來(lái)的兩種溶液的體積后，倒入指定的回收瓶中。 （5）分離結(jié)束后，應(yīng)先讓溶劑盡量流干，然后倒置，用吸耳球從活塞 向管內(nèi)擠壓空氣，將吸附劑從柱頂擠壓出。使用過(guò)的吸附劑倒入垃圾桶里。,實(shí)驗(yàn)二 柱色譜法分離甲基橙和甲基藍(lán),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 了解柱色譜的分離原理。 2掌握柱色譜法的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。,二、實(shí)驗(yàn)原理,甲基橙和亞甲基

6、藍(lán)均為指示劑,它們的結(jié)構(gòu)式如下所示:,甲基橙,亞甲基藍(lán),由于甲基橙和亞甲基藍(lán)的結(jié)構(gòu)不同,極性不同,吸附劑對(duì)它們的吸附能力不同,洗脫劑對(duì)它們的解析速度也不同,極性小、吸附能力弱、解析速度快的亞甲基藍(lán)先被洗脫下來(lái)，而極性大、吸附能力強(qiáng)、解析速度慢的甲基橙后被洗脫下來(lái)，從而使兩種物質(zhì)得以分離。本實(shí)驗(yàn)以中性氧化鋁為吸附劑，95%乙醇作為洗脫劑，先洗出亞甲基藍(lán)，再用蒸餾水作洗脫劑把甲基橙洗脫下來(lái)。,三、儀器和試劑,1.儀器 錐形瓶、玻璃漏斗、色譜柱 2.試劑 中性氧化鋁、石英砂、乙醇（95%）、 甲基橙、亞甲基藍(lán),四、裝置圖,裝柱,洗脫,五、實(shí)驗(yàn)步驟,裝柱： （1）取一支色譜柱，在柱子的收縮部塞一小團(tuán)脫

7、脂棉花將色譜柱垂直固定在鐵架臺(tái)上，關(guān)閉活塞 (2) 填固定相：向柱中加入已經(jīng)潤(rùn)濕的 Al2O3（7g Al2O3+95%乙醇拌勻）至柱體積的1/2 （3）用洗耳球敲打柱身使氧化鋁裝填緊密，打開(kāi)活塞，用小錐型瓶承接, 控制滴速為1 滴/秒,裝完后在上面加一層石英沙（約5mm）。操作時(shí)要注意吸附劑始終不能露出液面。,實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）,加樣：當(dāng)乙醇液面剛好流至石英砂平面相切時(shí)，立刻關(guān)閉活塞，向柱內(nèi)滴加10滴甲基橙和亞甲基藍(lán)的混合物（乙醇溶液），打開(kāi)活塞。 洗脫：待液面降至石英砂層時(shí)用少量95%乙醇洗下附在管壁的色素（少量多次），然后用95%乙醇作為洗脫劑，控制流速（約為1滴/秒），當(dāng)亞甲基藍(lán)色帶洗出時(shí)

8、，更換錐形瓶收集洗脫液，直至洗脫液無(wú)色。更換錐形瓶，并改用蒸餾水繼續(xù)洗脫，用另外的錐形瓶收集，直到甲基橙全部被洗脫下來(lái)。,六、注意事項(xiàng),1、吸附劑的選擇和活化 2、洗脫劑的選擇： 對(duì)未知樣品先用極性小的溶劑洗脫， 再用極性大的溶劑洗脫 3、裝柱的技術(shù)：松緊度 4、吸附劑的用量： 5、柱高：柱子太高洗脫慢,思考題 （1）裝柱不均勻或有氣泡，裂縫，將會(huì)造成什么后果？如何避免？ （2）極性大的組分為什么要用極性較大的溶劑洗脫？ （3）在氧化鋁柱子上若分離下列各組混合物，哪一個(gè)組分先被洗脫下來(lái)？,和,和,完！,硅膠粘合薄層板的鋪制,薄層色譜基本原理 薄層色譜（Thin Layer Chromatogr

9、aphy）常用TLC表示，它是將固定相均勻地涂在薄板（如玻璃板）上，依靠毛細(xì)作用力或重力，使流動(dòng)相通過(guò)固定相的一種色譜。,特點(diǎn)： 快，需十至幾十分鐘，同時(shí)展開(kāi)多個(gè)試樣。 試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單，對(duì)試樣限制少。 載樣量比較大，適用于制備。 儀器簡(jiǎn)單，操作方便。 分離能力較強(qiáng)。 靈敏度較高。,薄層色譜法的主要類(lèi)型和吸附色譜原理,吸附薄層色譜法 原理：組分在薄層板上吸附、解吸附、 再吸附、再解吸附的過(guò)程。 吸附系數(shù)不等實(shí)現(xiàn)分離。 一般極性強(qiáng)的組分K大，Rf值??；極性弱的組分 K小，Rf值大。 分配薄層色譜法,吸附薄層色譜的吸附劑,吸附劑 硅膠：多孔性微粒，表面帶有硅醇基，呈弱酸性。 原理：硅醇基(吸附中心)與極性基團(tuán)形成氫鍵（吸附性）。 組分與硅醇基形成氫鍵（被吸附）的能力不同而分離。 應(yīng)用：酸性和中性物質(zhì)的分離，如有機(jī)酸酚類(lèi)、醛類(lèi)等 硅膠活度與含水量的關(guān)系：含水量高，活性級(jí)高，活度低。 活化：加熱至105左右，除去吸附水提高活度。（注意溫度不可過(guò)高）,操作步驟