1、透射電鏡的生物 樣品制備技術,分為兩類： 透射電鏡樣品的基本制備技術 超薄切片技術 負染技術 生物樣品特殊制樣技術,超薄切片技術,概念: 指制備厚度低于100nm的切片技術。 特點： 是透射電鏡生物樣品制備技術中最常見、最基本的技術； 是其他技術方法的基礎； 程序長、操作較復雜、精細。,生物醫(yī)學樣品的特點：,1、樣品多樣化，包括組織、細胞、微生物及生 物大分子。 2、含水量多、質地軟、脫水時容易皺縮變形。 3、機械程度低，對電子束轟擊的耐受力差。 4、多由低原子序數(shù)的元素組成，故導電性能差。 5、樣品形態(tài)對試劑的PH值及溫度較敏感,主要步驟,取材 固定 脫水 浸透及包埋 切片 染色,一.取材

2、從人體、動植物、細胞和微生物的培養(yǎng)物中選取電鏡觀察材料的過程。 在活體取材時要做到： 快離體12min內放入固定液 準取材部位要準，有代表性 小1mm1mm1mm大小，太小時結構少，太大時固定不充分結構保存不好 輕動作要輕，器械要鋒利 冷0 4 ，器械、容器、固定液均需預冷,二.固定,目的 盡可能保存組織和細胞在生活狀態(tài)下的結構 使細胞內的各種成分固定下來，避免在以后 的沖洗和脫水等步驟中溶解和流失 防止細胞內酶活性造成的細胞自溶 防止外界微生物侵入繁殖而產生腐敗致使細 胞的超微結構遭受破壞,方法 物理方法 快速冷凍法 干燥法 化學方法 浸泡固定法 原位固定法 灌流固定法,常用固定劑,戊二醛(

3、Glutaraldehyde，GA) 無色透明液體，pH=4，使用濃度為2.54，使用溫度4。 優(yōu)點 穿透能力強 能較好地保存蛋白質、碳水化合物的結構及酶的活性 固定保存時間長(4可達數(shù)周至數(shù)月) 缺點 組織反差不好 對脂類無固定作用 固定后標本要充分沖洗,鋨酸(Osmium tetroxide Os4),淡黃色塊狀結晶，使用濃度14，使用溫度4。 優(yōu)點 對蛋白質和脂類有較好的固定作用 可避免組織塊收縮或膨脹 可產生明顯的反差,鋨酸(Osmium tetroxide Os4),缺點 分子量大，穿透能力差 對碳水化合物和酶固定效果不好 固定時間較長易引起組織變脆 有強烈的刺激味對角膜、鼻粘膜有毒

4、性作用 光熱作用時易發(fā)生變化,多聚甲醛(Paraformaldehyde),白色粉末，使用濃度為4 優(yōu)點 對組織的浸透力強 保存抗原性物質，多用于免疫電鏡技術中 缺點 高濃度時可使組織結構流失，多不單獨使用,常用緩沖液,用于配制固定液和漂洗 0.2M磷酸鹽緩沖液:較常用 0.2M二甲砷酸鹽緩沖液:用于電鏡細胞化學,浸泡固定法,是將所取樣品直接放入預冷固定液內固定的方法，適用于大多數(shù)組織器官。最常用的是戊二醛、鋨酸雙重固定。 操作步驟: 前固定： 2.5%-4%戊二醛 4 1-2h或數(shù)月 漂洗：用配固定液的緩沖液 4 2-4h 中間換3次 后固定：1%鋨酸 4 1.5-2h（培養(yǎng)細胞 30min

5、） 漂洗： 蒸餾水 4 10min,原位固定法,多用于解剖關系比較復雜、質地柔軟或對缺氧比較敏感的組織。以保證器官的血液供給，避免缺血造成的組織損傷或自溶。 操作步驟 在動物麻醉后保持血液供應的條件下，邊解剖邊在取材的部位局部滴加固定液，直至組織達到適當?shù)挠捕葹橐恕?灌流固定法,指通過血液循環(huán)途徑，將固定液灌注到組織器官內，進行固定后再取材的方法。常用于對缺氧敏感，死后變化快的組織器官，如中樞神經系統(tǒng)、心臟、胃腸道、視網膜和腎臟等。也可用于所取組織的種類較多以及解剖關系比較復雜、難以滲透的組織器官。 包括全身灌流固定法（適用于小動物）和器官灌流固定法（適用于大動物）。,操作步驟（以全身灌流固定

6、法為例） 麻醉要進行灌流的動物,將動物固定于實驗臺上,打開胸腔暴露心臟,將針頭刺入左心室，剪開右心耳以引出血液和灌流液。用注射器或輸液器緩慢注入37 、0.9%NaCl,直至內臟血色消失或流出液無血色為止,注入4 固定液，待組織變硬后取材。,體外培養(yǎng)細胞的固定,單層細胞固定 懸浮細胞固定 加入融化的2%瓊脂或BSA增加粘附性。 離心。,三.脫 水,目的 將組織內部游離的水分脫凈，有利于浸透和包埋 常用脫水劑 乙醇:使組織收縮較小，但與包埋劑的互溶 性差 丙酮:可溶解脂類，與包埋劑的互溶性好， 但易使組織變脆,脫水步驟,從低濃度至高濃度系列脫水 50% 酒精 4 1015min 70% 酒精 4

7、 1015min或過夜 80% 酒精 室溫 1015min 90% 酒精 室溫 1015min 95% 酒精 室溫 1015min 95%酒精：95%丙酮（1：1）室溫 1015min 95%丙酮 室溫 1015min 無水丙酮 室溫 40min 中間換一次,四.浸透及包埋,浸透：目的是使包埋劑逐漸取代脫水劑滲透到組織細胞中。因包埋劑與脫水劑不相溶，需用一種既能與脫水劑相溶，又能與包埋劑相溶的物質進行轉換，常用的轉換劑為環(huán)氧丙烷。 包埋：目的是讓包埋劑完全浸透到組織細胞內部，使組織具有一定的硬度、彈性和韌性，能夠承受切片時的各種壓力，以便制備超薄切片.,常用的包埋劑,具有低黏度、親和性強和優(yōu)良

8、的切割性能，切片透明度高，組織結構保存好，并能耐受電子束的轟擊及在低溫下聚合的特點。 環(huán)氧樹脂Epon812(進口) 滲入組織容易，對細胞結構保存好，較常用。 丙烯酸酯（acrylic resin) 618(國產),Lowcryl K4M： 為低溫水溶性包埋劑，較常用。特點是低溫下(-35 )可保持低黏度；在紫外光（波長360nm）下可聚合。聚合后可在常溫下切片；能較好地保持組織結構和抗原性及植物凝血素結合部位，減少背景非特異性染色，故多用于免疫細胞化學的包埋后染色。 包埋劑配方（K4M) K4M(單體） 8.65g 交聯(lián)劑 1.35g 引發(fā)劑 50mg,LR white: 為混合的丙烯酸單體

9、，對脂類溶解度低，保存膜結構較好，可耐受電子束轟擊，因而可不做支持膜。熱聚合60 ；冷聚合-25 ，加速劑協(xié)助聚合。,包埋方法,1.常規(guī)包埋方法 適用于大多數(shù)組織塊及細胞團 浸透 環(huán)氧丙烷 室溫 20min 環(huán)氧丙烷:包埋劑 1:1 室溫 40-60min 包埋劑 室溫 3h 包埋 將樣品放入包埋板或膠囊內 放好標簽 充填滿包埋劑 聚合(使包埋劑變硬) 35 12h 45 12h 55 12h,2.原位包埋法,適用于組織塊中數(shù)量少的特殊結構，如：運動終板；冷凍切片、半薄切片及單層培養(yǎng)細胞的某些結構的觀察. 1、組織塊：前固定后用振動切片機切成50-100m的厚片，顯微鏡下選出含有所需結構的厚片

10、進行漂洗。經過1%鋨酸后固定，乙醇及丙酮系列脫水，環(huán)氧樹脂浸透，把厚片鋪于載玻片上，將頂端平整的廢包埋塊安在切片的特定部位上，60 聚合后修塊，常規(guī)切片及染色。,2 、切片及單層培養(yǎng)細胞（需要在玻片上進行）： 在光鏡下選出所需觀察的部位，在玻片反面用筆做好標記。前固定、漂洗、后固定，脫水及浸透同常規(guī)包埋方法，但各步驟時間可適當縮短。在玻片有標記處的正面位置滴上包埋劑，將頂端平整的廢包埋塊壓在其上，于60 聚合硬化。將粘有包埋塊的玻片置于90 熱板上加溫10s，取下包埋塊修塊，超薄切片及電子染色。,五.切片,目的：制備厚度小于100nm的切片 準備工作: 1.復膜載網 支持膜 formvar膜

11、火棉膠膜 碳膜 用于負染技術 支持網 銅網 常用 不銹鋼網、鎳網、鉑網（組化用）,2.制刀,3.修塊 目的是去除組織塊周圍多余的包埋介質，便于切片。 半薄切片: 目的是確定所要觀察的準確部位，厚度為0.51m，用甲苯胺蘭染色顯示。,超薄切片:采用超薄切片機 操作步驟: 包埋塊固定 刀固定 水槽加水 切片 選片 撈片,切片帶彎曲可能原因及解決辦法,支持膜的制作,支持膜是一種能支持觀察樣品的膜，厚度約20nm。性能良好的支持膜應具備： 1.較高的透明度 2.在電鏡下無可見結構 3.與所支持的各種樣品不發(fā)生化學反應,方華膜、碳膜、火棉膠基底碳膜、硝化纖維素基底碳膜、微篩膜等,支持膜的制作,方華膜（方

12、華的化學成分是聚乙烯醇縮甲醛，為淡黃色粉末）：準備-附膜-漂膜-撈膜,支持膜的制作,碳膜：觀察高分辨率的樣品及某些懸浮液對方華膜有溶解作用時需用碳膜。碳膜的機械性能及化學性能較好，減少熱漂移。噴膜-漂膜擺網-撈膜,切片的厚度可根據干涉色來判斷。 暗灰色調 40nm 灰色 40-50nm，較薄，易被電子 束擊破 銀白色 60-70nm，最常用 金黃色 70-80nm 紫色為 90nm以上，較厚，細節(jié)結 構不清,超薄切片質量好壞指標 樣品結構保存良好，結構細膩，無丟失。 切片厚薄均勻，厚度在60-90nm之間。表面無皺折、刀痕、震顫等缺陷。 樣品反差良好，無染色沉淀。 支持膜厚度適中，觀察時不產生

13、漂移和破裂。,六.電子染色,利用重金屬鹽類選擇性地與生物樣品中不同結構成分相結合，來提高結構成分散射電子的能力，從而增加圖像反差的染色，又稱為正染色。 常用的染色劑: 0.5醋酸雙氧鈾 可使核酸、蛋白質、結締組織纖維的反差增強。 0.10.4檸檬酸鉛 可使膜結構、脂類的反差增強。,正染色,TEM樣品： 超薄切片厚度要均勻 無震顫 無刀痕 無染色污染 反差適當,負染技術,指利用重金屬鹽類與結構背景相結合，增加背景電子散射能力，使背景呈黑色，樣品結構變亮。,染色劑 磷鎢酸（PTA） pH 6.7-7 染色步驟 復膜載網滴樣品-滴染1-2min用濾紙吸去染液觀察 優(yōu)點 適用于懸浮液的樣品（細菌、病毒

14、、其他微生物、大分子、分離細胞器） 操作快速、簡便 樣品用量少 圖像結構反差好,小結：（超薄切片） 1.取材:要求部位準確,塊小,時間短,低溫,器械鋒利,減小機械損傷. 2.固定:戊二醛固定時間可以適當延長,一般不要超過一周,期間要更換一次固定液,且要保持低溫固定,充分清洗后再進行鋨酸固定1-2小時,時間一定不要太長. 3.脫水:鋨酸固定后經過充分清洗,進行酒精梯度脫水,一般50%,70%,80%,95%,無水酒精, 4.樣品侵透,包埋.一定要保持干燥,侵透徹底. 5.聚合:由室溫到高溫梯度升溫聚合.如35度,45度,60度順序. 6.超薄切片:切片機性能,片厚度,撈片,載網質量都需要注意. 7.電子染色:過程中一定要避免一切污染.,注意事項 （負染）,樣品濃度要適中 樣品要不含雜質 樣品的pH值要與染液pH值一致 掌握滴染時機（樣品要未完全干燥時） 負染樣品觀察時，加速電壓要適當,物鏡光闌要小，反差較好，照相要快.,Fig. 1. The labelling results of colloidal gold probe. A: colloidal gold, B: labeled colloidal gold (showing the protein halo around the labeled