1、.,1,實驗三、 小鼠骨髓染色體標本的 制備及觀察,李孝敬 基礎醫(yī)學樓A412 生科院辦公室 電話.,2,一、實驗目的,初步掌握（小鼠）骨髓細胞染色體標本的制備原理和方法 鞏固顯微鏡的操作技術 了解小鼠的染色體形態(tài)特征,.,3,二、實驗原理,染色體是組成細胞核的基本物質(zhì)，是基因的載體。染色體異常也稱染色體發(fā)育不全。目前已確認染色體病綜合征100余種，智力低下和生長發(fā)育遲滯是染色體病的共同特征。 21三體綜合征； 18三體綜合征、貓叫綜合征,.,4,18三體綜合征,.,5,二、實驗原理,染色體標本的觀察廣泛應用于一些疾病的臨床診斷中。例如白血病、惡性血液病等的診斷。 染

2、色體是染色質(zhì)在細胞分裂期的存在形式。 細胞分裂的中期，染色體在赤道板上排列清晰，是染色體觀察的最佳時期。,.,6,骨髓細胞 數(shù)量多且分裂旺盛，可直接進行染色體標本的制備。取材方便，操作簡單和無需無菌培養(yǎng)，是研究小型哺乳動物等染色體的常用方法。,人骨髓染色體抽取,.,7,怎樣才能制備一個好的染色體標本？ 獲得大量處于有絲分裂中期的細胞。 使細胞膜破裂，且染色體能夠完整并較分散的釋放出來。,.,8,秋水仙素處理：秋水仙素溶液可抑制紡錘體的形成，使正在分裂的骨髓細胞停止在細胞分裂中期，積累大量中期分裂相細胞。 低滲作用: 使細胞充分膨脹，減少染色體間的相互纏繞和重疊。 預固定：終止低滲作用，使細胞離

3、心時不易破裂，固定維持細胞形態(tài)結構。 高距離滴片：使細胞膜易于破裂，獲得中期染色體標本，在顯微鏡下觀察染色體的結構和數(shù)量。,.,9,三、實驗器材和試劑,1.器材 蠟盤、手術剪、小鑷子、平皿、注射器、10ml離心管、吸管、量筒、預冷載玻片、試管架、離心機、恒溫水浴鍋、顯微鏡、乙醚酒精、擦鏡紙 2、試劑 100ug秋水仙素液、 0.075 mol/L KCl 低滲液、 Giemsa染液,.,10,1.秋水仙素處理：選擇體重20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，與處死前4h，對其進行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。,四、實驗步驟,注意：剪去少量骨質(zhì)，避免骨髓細胞丟失；擦凈血跡和肌肉

4、細胞以免影響觀察；用0.075 mol/L KCl 收集足量細胞，反復沖洗直到股骨發(fā)白。,2.取材：頸椎脫臼法處死 取兩后肢股骨 紗布擦凈肌肉 剪去股骨兩頭，暴露骨髓腔 低滲液(5ml)沖洗至離心管內(nèi) 收集骨髓細胞,.,11,頸椎脫臼法處死小鼠,.,12,3. 低滲：用吸管吹打骨髓細胞使其分散，加入預溫37的低滲液至8ml,將離心管至37水浴鍋中，保溫至少30 min后取出，使細胞充分吸水膨脹。,低滲不足，則細胞膨脹不夠，滴片時細胞不破裂。 低滲過度，則細胞提前破裂，染色體觀察不全。 空氣吹打法：用吸管橡膠頭內(nèi)的空氣混勻液體。,.,13,4. 預固定：加1ml新配制固定液 混勻 1500r/m

5、in，5min 棄上清液。 固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需現(xiàn)配；離心需要配平。 作用：終止低滲；維持細胞的膨脹狀態(tài)；防止離心破裂,5. 固定、制細胞懸液：加固定液5ml 吹打混勻 固定15min 離心1500r/min，5min 棄上清，加固定液 0.20.4ml 吹打成細胞懸液，準備制片使用。,制備細胞懸液時，根據(jù)具體情況加固定液，以懸液呈現(xiàn)乳白色為宜。,.,14,6. 滴片：冰片傾斜30, 細胞懸液距離玻片30cm高，在不重疊位置滴12滴，用口吹散細胞，過火焰干燥。 注意：載玻片預冷、高度、吹散、不可使載玻片燙手。 7.染色：在玻片上滴幾滴Giemsa染液并鋪勻，810min，倒去染液，

6、晾干。（染色盤中進行） 8.小鼠染色體觀察： 低倍鏡、高倍鏡下尋找染色體分散的中期分裂相.,.,15,小鼠骨髓染色體 10 10,.,16,小鼠骨髓染色體 10 40,.,17,.,18,.,19,數(shù)目觀察：小鼠2倍體細胞染色體，數(shù)目2n=40條。其中19對為常染色體，一對為性染色體，染色體的核型分為4組。雄性 XY, 雌性XX,Y染色體最小。 形態(tài)特征觀察：端著絲粒染色體“U”“V”。,.,20,五、注意事項,1掌握好秋水仙素的濃度和處理時間； 2離心前需要配平； 3. 小鼠骨髓要沖洗干凈，以收集足夠的骨髓細胞； 3低滲處理是實驗成敗的關鍵，注意低滲時間； 4固定液要現(xiàn)配現(xiàn)用，固定要充分； 5載玻片要潔凈并預冷，滴片要有一定的高度； 6. 細胞懸液不能太稀，要呈乳白色； 7. 烤片時溫度