1、6多肽抗生素的研究概況多肽(Lipopeptide )又稱脂聯(lián)素肽(Acylpeptide )，是重要的抗菌肽，主要來源于細(xì)菌、酵母菌、真菌分泌的代謝產(chǎn)物，種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是由脂肪鏈和多肽鏈組成的具有父母結(jié)構(gòu)的微生物次代謝產(chǎn)物(脂肽一般來源于植物、動(dòng)物和微生物，而大多數(shù)脂肽來源于微生物，其中多來自細(xì)菌的脂肽。 在細(xì)菌中，多肽一般是克陽性芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。 1968年，Arima等首次在枯草芽胞桿菌株中發(fā)現(xiàn)脂肽系表面活性劑，呈晶狀，商品名為表面活性素(surfbactin ) (ARIMA，1968 )。 目前發(fā)現(xiàn)的抗菌多肽主要是表面活性素(surfactin )、芬西汀(Fengyci

2、n )、博霉素(iturin )、芽孢霉素(Bacillomycin )、抗霉素枯草菌(mycosubtilin )、磷脂抗生素(plip 脂質(zhì)肽分子由親水性肽鍵和親油的脂肪族烴鏈兩部分組成，脂質(zhì)肽分子中由多個(gè)氨基酸組成的肽鏈形成親水基，脂肪族烴鏈形成親油性。 由于其特殊的化學(xué)組成和雙親型分子結(jié)構(gòu)，多肽除了具有抗菌活性外，還具有生物表面活性劑的特性(Stein，2005 )。 脂肽在環(huán)境管理、醫(yī)藥、微生物采油等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景(Jitemdra，1997 )。 Banat，2003 )。6.1多肽抗生素的種類和結(jié)構(gòu)特性芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽的分子結(jié)構(gòu)由脂肪酸鏈和肽鏈兩部分組成，分子中多種氨

3、基酸構(gòu)成的肽鏈形成親水基，-羥基或氨基脂肪酸的烴鏈形成親油性基，是一種具有兩親性的生物表面活性劑。 其中親水性氨基酸通過肽鍵相互連接，并與脂肪族烴鏈上的羧基和-羥基或氨基結(jié)合形成環(huán)狀，因此抗菌脂肽一般為內(nèi)脂或酰胺鍵的環(huán)脂肽(劉向陽，2005； 呂應(yīng)年，2005年王，2004 )。 芽孢桿菌多肽抗生素主要包括三種類型：表面活性素(Surfactin )、類毒素(Iturin )、芬太尼(Fengycin )。6.1.1表面活性素(Surfactin )surftactin類群的脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)為1316個(gè)，具有LLDLLDL的手性七肽通過內(nèi)酯鍵與脂肪酸鏈的碳原子的-羥基結(jié)合，在水溶液中“鞍狀”地分

4、為分子。 該家族包括枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的表面活性素、芽胞桿菌產(chǎn)生的芽胞桿菌素在內(nèi)的芽孢桿菌表面活性劑(Pumilacidin )、濃縮劑(Esperin )中，Liehenyishin、Pumilacidin、Esperin主要是工業(yè)和環(huán)境管理(Meiji et al ) Yakimo et al .1995； Naruse et al .1990 )。 表面活性劑由-羥基脂肪酸和7個(gè)氨基酸殘基的肽組成，是肽鏈的第7位氨基酸上的羧基與脂肪酸的-羥基縮合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)肽系抗菌物質(zhì)(圖1-1 )。 Surfactin中，主要有7位氨基酸有Leu和Val兩種。 肽鏈中典型的氨基酸組成順序是(l-)

5、 Glu-(l-) leu-(d-) leu-(l-) val-(l-) ASP-(d-) leu-(l-) leu (kowalletal .1998； 楊世忠等，2004 )。 但是，其2位(Leu/Ile/Val )、4位(Val/Leu/Ile/Ala )、7位(Leu/Val/Ile )氨基酸的差異和脂肪酸鏈的長(zhǎng)度(C13C15 )的差異等也很多(劉日方向等，2005 )。 1991年，Baumgart提出了從Bacillus subtilis ATCC21332和Bacillus subtilis OKB105的培養(yǎng)液中提取的Surfactin為三種結(jié)構(gòu)相似物(Baumgart e

6、t al . 用二維H-NMR證明了具有1991 )的分別命名為Surfactin A、surfbactinb、surfbactinic，其中survitina為主要成分，其環(huán)狀肽鏈上的第7個(gè)氨基酸為L(zhǎng)eu、surfbactinb的第7個(gè)1992年Oka等采用優(yōu)化的高效液相色譜(HPLC )，首次成功分離了枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的6種表面活性素，發(fā)現(xiàn)了兩種具有不同脂肪酸取代物的新表面活性素。 1995年俄羅斯科學(xué)家研究了發(fā)酵液得到的5個(gè)Surfactin的結(jié)構(gòu)相似物，通過質(zhì)譜分析技術(shù)、化學(xué)修飾和二維核磁共振技術(shù)確定了其結(jié)構(gòu)。 之后的研究如表1-1 (Vater et al .2002 )所示，更正確

7、地測(cè)量了十幾種Surfactin的同族體(Kowall et al .1998 )。 Surfactin表現(xiàn)出抗病毒、抗腫瘤和支原體性及一定的抗細(xì)菌活性，其本身不具有抗真菌活性，但能增強(qiáng)其他多肽，特別是類毒素的抗真菌活性(Kim et al .2004 )。圖1-1 Surfactin的結(jié)構(gòu)圖Fig.1-1 Structure of surfactin結(jié)構(gòu)表l-1 surfactin同系物的種類table1-1stratsofsurfbactiniisoforms6.1.2發(fā)動(dòng)機(jī)Fengycins類群中，引擎(Fengycin )和磷脂(plipastatinAl，A2、B1、B2 )脂肪酸鏈

8、的碳鏈長(zhǎng)度一般為1418個(gè)，8個(gè)氨基酸為環(huán)，線狀部分為2個(gè)氨基酸和脂肪酸鏈(non 肽鏈中氨基酸組成順序是(l-) Glu-(d-) orn-(l-) Tyr-(d-) thr-(l-) Glu-(d-) ala (val )-(l-) pro-(l-) Gln-(d-) Tyr-(l-) ile，是肽鏈第十位ile上的羧基Ongena，2005 Sehneider，1999 )，圖1-2。 Fengycin抑制絲狀菌的生長(zhǎng)，對(duì)酵母和細(xì)菌不起作用(Vanittanakom et al .1986 )。 和Surfactin一樣有很多同系物，多與發(fā)酵液共存。 這些分為Fengycin A和Fen

9、gycin B兩種，當(dāng)多肽鏈的第6位有Ala時(shí)，屬于fengyein A的多肽鏈的第6位是Val時(shí)，F(xiàn)engyeinB(Wang J，2004； Steller S，1999； Deleu，2005 )。 2008年Das還發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌cMB26(B.thuringiensis CMB26 )具有與Fentorycin相似結(jié)構(gòu)的多肽抗生素(Kim et al .2004 )。 常見的fengycin同系物為表1-2(Stinson，2003； 高學(xué)文，2003 )。圖1-2 Fengycin A的結(jié)構(gòu)圖fig.1-2風(fēng)雪結(jié)構(gòu)表l-2 Fengycin同系物的種類表1-2 sortsoffen

10、gycinisoforms6.1.3伊枯草菌(Iturin )Iturin家族包括伊戈辛a、b、芽孢桿菌抗生素d、f、l、毒蕈堿和芽孢桿菌胃蛋白a、b、c (陳Franeoise et al .1984； Aicha et al .1982； Yoshio et al .1995 )，脂肪酸鏈的碳鏈長(zhǎng)一般為1417個(gè)，具有LDDLLDL手性的7個(gè)強(qiáng)極性氨基酸短肽的n末端氨基通過形成肽鍵的脂肪酸鏈的羧基連接(圖13 )。 其中最有代表性的Iturin A由含有C14C17的-氨基脂肪酸和7個(gè)氨基酸殘基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，7位的Ser的羧基和-氨基脂肪酸的氨基縮合而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Hiradate et

11、 al .2002； Besson et al .1978 )。 伊枯草菌具有強(qiáng)的抗真菌活性(Besson et al .1978 )，也有抑制細(xì)菌的作用。 Iturin的種類及其分子量如表l-3所示。 Iturin能很強(qiáng)地抑制植物病原真菌和細(xì)菌的一部分，還能抑制殺蟲作用。圖1-3 Iturin的結(jié)構(gòu)圖fig.1-3 it urin的結(jié)構(gòu)表l-3 Iturin同系物的種類表1-3 sorts of it urin iso forms6.2多肽抗生素的合成機(jī)制Lipmann于20世紀(jì)70年代首次展開了多肽生物合成的非核糖體機(jī)制分析，隨后克隆和分析了抗菌多肽合成的相關(guān)基因，結(jié)合全基因組測(cè)序的展開，

12、獲得了大量多肽抗生素合成和調(diào)控的遺傳信息(chen et al 。 總而言之，芽孢桿菌多肽類抗生素的合成受由合成基因、控制基因構(gòu)成的大基因簇控制，這些基因簇包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，它們的表達(dá)受到協(xié)調(diào)控制，類似主鏈結(jié)構(gòu)的多肽抗生素產(chǎn)物類似酶的活性存在于大功能蛋白質(zhì)的不同區(qū)域，或組織成酶的復(fù)合體，脂肽抗生素的合成相關(guān)基因如表1-4所示。 與核糖體合成的蛋白質(zhì)不同，非核糖體合成的多肽抗生素生物合成不需要以mRNA為模板，不需要攜帶工具tRNA，就能由多個(gè)多肽合成酶組成的巨大復(fù)合體nrps (non-ribosoomalpeptidesynthettase ) 是以稱為“多載流子硫鑄模機(jī)構(gòu)(Moham

13、ed，1997 )”的方式合成的； Saseha et al .2001 )。 NRPS是目前已知的分子量最大的酶，其作用是獨(dú)立于核酸模板的非核糖體機(jī)制，在模板的指導(dǎo)下，可以識(shí)別特定氨基酸，并將其直接結(jié)合形成多肽鏈。 各肽合成酶有一個(gè)或幾個(gè)模塊，各模塊是獨(dú)立的功能單元，由約1000個(gè)氨基酸殘基組成，負(fù)責(zé)在肽鏈中配合特定的氨基酸。 多肽合成酶的模塊序列決定了產(chǎn)物中氨基酸的序列順序，因此多肽合成酶既是多肽鏈合成的催化劑，也是多肽鏈合成的模板。 各模板負(fù)責(zé)反應(yīng)循環(huán)，主要識(shí)別選擇性基質(zhì)，將其活化為對(duì)應(yīng)的腺苷酸化合物，固定共享中間體，形成多肽鍵。 各模板在結(jié)構(gòu)上分為腺苷氧化域a、疏水化域t和縮合域c三個(gè)

14、域。 腺苷氧化結(jié)構(gòu)a域識(shí)別特定的基質(zhì)，負(fù)責(zé)用ATP激活基質(zhì)的疏水化域t，也稱為肽?；d體蛋白質(zhì)(PCP )的縮合結(jié)構(gòu)域c，負(fù)責(zé)固定反應(yīng)中間物的硫酯，第一模塊的氨基酸從其載體脫離， 進(jìn)而催化與第二模塊的氨基酸形成多肽鍵，新合成的多肽鏈將一個(gè)模塊向前移動(dòng)，直到脂肪多肽化合物形成為止。 芽孢桿菌以不同的模塊為模板，結(jié)構(gòu)域有機(jī)結(jié)合起作用，形成多種多樣的非核糖體肽。表1-4多肽抗生素合成相關(guān)基因tablel-5 lipopeptidessynthesase-related genes6.3多肽抗生素的應(yīng)用抗菌肽的應(yīng)用研究主要集中在農(nóng)業(yè)生物防治、食品工業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。農(nóng)業(yè)生物防治主要

15、是指脂質(zhì)肽應(yīng)用于植物病原菌的生物防治(高芬等2003； Vollenbroich，1997 )。 這是因?yàn)槎嚯牡目股仉m然具有廣譜的抗霉菌作用和一定的抗細(xì)菌作用，但其抗菌機(jī)制與一般的抗生素不同，在微生物的細(xì)胞膜上形成孔，使細(xì)胞內(nèi)容流通而死亡，或用二價(jià)陽離子抑制多種酶活性，不易產(chǎn)生耐藥性Deleu，2005 )。 多肽類是一種在自然界中容易分解、環(huán)保的制劑，在醫(yī)藥、植物病原菌的控制等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。 有些學(xué)者將抗菌脂肽的研究應(yīng)用于抑制植物病原真菌。 研究了枯草芽孢桿菌fmbJ產(chǎn)生的脂質(zhì)肽對(duì)點(diǎn)青霉AS3.4356的抑制活性，測(cè)定了抗菌光譜，進(jìn)行了桃的防腐試驗(yàn)。 在桃子防腐試驗(yàn)中，其防腐效率

16、達(dá)到76.5%，有良好的桃子防腐應(yīng)用前景。 Yu等人將Bacillus amyloliquefaciens產(chǎn)生的iturinA用于番茄絲狀菌的防治(Yu et al .2002 )。在食品行業(yè)的應(yīng)用主要以脂質(zhì)肽為食品防腐劑，進(jìn)行了大量的應(yīng)用研究。 食品安全和動(dòng)物食品安全取決于生產(chǎn)過程的各個(gè)環(huán)節(jié)，解決問題的一個(gè)關(guān)鍵是使用無污染、無殘留、無毒性副作用的食品添加劑。 抗菌多肽是一種小分子多肽，參與了生命過程，具有安全無毒性副作用的生物學(xué)特性(Zasloff，2002 )。多肽也可以用于環(huán)境保護(hù). 多肽作為表面活性劑，他們帶負(fù)電荷，能結(jié)合帶正電荷的金屬陽離子，能選擇性地去除土壤中的Pb、Zn、Cu等金

17、屬離子，其中Cu最容易去除。 文獻(xiàn)報(bào)道了芽孢桿菌產(chǎn)生的脂聯(lián)素，是比表面活性素更穩(wěn)定的陽離子性螯合劑(Catherine et al .2001 )。多肽抗生素也可以用于醫(yī)藥行業(yè)。 醫(yī)藥行業(yè)多肽的研究主要集中在動(dòng)物疾病的預(yù)防和人抗真菌藥、抗病毒藥、抗腫瘤藥、抗原蟲藥的研究(Hino et al .2001 )。 Rowley et al .2004； Boulanger et al .2004； 汪以真等，2004 )。脂肽類表面活性劑也可用于微生物采油方向。 由農(nóng)桿菌NK-X3產(chǎn)生的多肽類生物表面活性劑，在pH為412、鈣離子質(zhì)量濃度為4000 mg/L的條件下，有時(shí)在120 的高溫下會(huì)失去活性，這些特征有利于原油的采集和輸送(范立梅，2000； 梅建鳳，2001 )。 Bacillus subtilis ZW-3是大慶油田分離成大慶威等枯草芽孢桿菌的，代謝產(chǎn)生的肽表面活性劑具有優(yōu)異的乳化和降低油水界面張力的能力，能提高采