1、虞其紅,1,遺傳性血液病,血液與遺傳的關(guān)系是十分密切的，目前發(fā)現(xiàn)的遺傳性血液病已經(jīng)在百種以上，造血和淋巴組織系腫瘤中幾乎都是屬于染色體病和體細(xì)胞遺傳病。 在體細(xì)胞水平上遺傳物質(zhì)的 異常能擾亂細(xì)胞的正常生長發(fā)育及分化調(diào)節(jié)，從而誘發(fā)腫瘤。 在白血病中，多數(shù)是由染色體易位導(dǎo)致原癌基因的重排。 原癌基因重排可以導(dǎo)致癌基因的過量表達(dá)而致病，也可由于原癌基因與易位處的某一基因形成融合性基因而發(fā)生白血病。,2,發(fā)病情況 我國白血病發(fā)病率發(fā)病率：1-4/10萬，低于歐美。 ANLL 1.62/10萬，ALL 0.69/10萬，CML 0.36/10萬，CLL 0.05/10萬，急性比慢性多，成人急非淋多見，兒

2、童急淋多見，歐美慢淋多見。 易發(fā)人群-兒童及35歲以下成人。 死亡率：惡性腫瘤中 6位（男性） 8位（女性）。,3,白血病分類分形,據(jù)白血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程，將白血病分為急性白血?。ˋL）和慢性白血?。–L）兩大類。 根據(jù)主要受累的細(xì)胞系列將： AL分為：急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）和急性非淋巴細(xì)胞白血?。ˋNLL） 或急性髓性白血?。ˋML） CL分為：慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）、慢性淋巴細(xì)胞白血?。–ML）及少見類型的白血病，如毛細(xì)胞白血病（HCL）、幼淋巴細(xì)胞白血病（pLL）等。,4,隨著血液病在發(fā)病機理、診斷方法以及治療手段等方面的進展，急性白血病的診斷技術(shù)也有很大發(fā)展，急性白

3、血病的分型基本上分三個階段。,5,急性白血病分型的三個發(fā)展階段,FAB分型 1976（M）,MIC分型 1986（MIC）,WHO分型 2001（MICM）,6, 70年代（1976. Benne等）法、美、英7位學(xué)者 提出FAB分型，其后多次加以修改補充 70年代中用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)造血細(xì)胞表面抗原，對AL進行 免疫表型分析。 C hromosome分析90%AL有核型異常。 80年代提出MIC分型 (M：morphology, I: immunology, C:Cytogenetics) 近年 MICM（MIC+分子生物學(xué)）分型,7,急性白血病 （AL）,急性白血病是：造血干細(xì)胞的惡性克隆性

4、疾病，發(fā)病的骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞（白血病細(xì)胞）大量增殖并廣泛浸潤肝、脾、淋巴結(jié)等各種臟器，抑制正常造血。主要表現(xiàn)為貧血、出血、感染和浸潤等征象。 分類 國際常用的法美英（FAB）分類將AL分為ALL及ANLL（或 急性隨性隨性白血病AML）兩大類。這兩大類再分成多種亞型。 （一）急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）分型： FAB分型： ALL_L1原始淋巴細(xì)胞以胞體?。ㄖ睆?2m）而規(guī)則為特點， ALL_L2原始淋巴細(xì)胞則以大小不一，（直徑12m）和胞核形狀不規(guī)則見長， ALL_L3原始和幼淋巴細(xì)胞以大細(xì)胞為主，大小較一致，細(xì)胞內(nèi)有明顯空泡，胞漿嗜堿性，染色深。因與EB病毒感染有關(guān)故又稱Bu

5、rkitt細(xì)胞，在免疫表型上則為成熟型B細(xì)胞,8,另外，由于形態(tài)學(xué)分型為基礎(chǔ)的FAB分型具有一定的局限性，如：T、B淋巴細(xì)胞不能區(qū)分，沒有沒有提供染色體異常和基因重排等對發(fā)病機制、治療選擇和對預(yù)后判斷重要意義的信息。因此除形態(tài)學(xué)外還應(yīng)做免疫學(xué)分型。,急性淋巴細(xì)胞白血病（）的MIC分型： B系 1、早前B細(xì)胞型ALL（早前B-ALL） 2、前B細(xì)胞型（前B-ALL） 3、普通型ALL（） 4、成熟細(xì)胞型ALL（B-ALL） T系 早前T細(xì)胞型ALL（T-ALL） 成熟T細(xì)胞型ALL（T_ALL）,9,急性髓性白血?。ˋML）的FAB分型,AML共分8型如下： M0 急性髓細(xì)胞白血病微分化型 M1

6、 急性粒細(xì)胞白血病未分化型 M2 急性粒細(xì)胞白血病部分分化型 M3 急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL） M4 急性粒單核細(xì)胞白血?。ˋMML） M4Eo除上述M4型的各特點外，嗜酸性粒細(xì)胞在NEC5%。 M5 急性單核細(xì)胞白血?。ˋMoL） M6 紅白血?。‥L） M7 急性巨核細(xì)胞白血病,10,白血病染色體畸變與非隨機性,（一 ）集中傾向性 從理論上說，人類的24種染色體（常染色體加X和Y性染色體）以均等機會參與腫瘤的畸變，但現(xiàn)實的研究結(jié)果并非如此。腫瘤染色體畸變常是涉及其中部分的染色體，畸變分布不均，且?guī)в心撤N集中傾向（聚集現(xiàn)象）和 非隨機性 Mitelman曾對1266例一白血病為主的15種

7、腫瘤進行染色體畸變分析，可見腫瘤染色體畸變集中在第1、3、5、7、8、9、14、17、20、21、和22號染色體中，而第1、8和14號染色體則涉及78種腫瘤。 在腫瘤染色體重排的研究中，惡性腫瘤染色體重排分布和良性腫瘤染色體畸變均是非隨機性的。,11,（二）地域分布 研究地理分布的非隨機性，也可發(fā)現(xiàn)腫瘤染色體畸變發(fā)生率存在地區(qū)異質(zhì)性。 CML中，歐洲和日本+17的頻率高于澳大利亞與美國，日本+19的頻率是歐美的3倍； AML中，美國-5和-7的頻率比澳大利亞高2倍，而在日本則為罕見； 淋巴瘤14q+發(fā)生的頻率，在歐洲為47%，美國為83%； CLL的t(8；14)在歐洲為 67%,在美國則未見

8、。我國及東南亞較少見。 （三）年齡分布 11q23重排是嬰兒AML患者最常見的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，而在成人中的發(fā)病率僅為5%。 t(1；22)(p13p13)僅限于兒童M7，尤其是嬰兒患者。 -5、-7、i(17q)，完整的第8，11，13和14號染色體的三體，以及復(fù)雜核型均多見于年齡較大的患者。 t(15;17)t(8;21)t(6;9)t(6;16)t(3;5)等異常核型則常見于年輕患者。,12,（四）標(biāo)記染色體分布 在腫瘤染色體的檢測中，標(biāo)記染色體的分布也是非隨機的。 5q-常見于難治性貧血和治療相關(guān)AML和MDS 6q-在ALL中的發(fā)生率為20%，在淋巴瘤中的發(fā)生率為12%,在CLL、CG

9、L、AML及其他惡性腫瘤中少見。 7q-常見于所有的白血病，最常見的為AML 14q-主要見于淋巴系腫瘤，少見于其他惡性腫瘤。 t(8;14)在B系白血病和淋巴瘤中是特異的，其斷裂位點是專一的。 i(17q)為CML急性期的特征，少見于其他腫瘤。 20q-主要見于真紅細(xì)胞增多癥。 22q-則廣泛存在于白血病中。,13,骨髓染色體核型分析,腫瘤有超過600種染色體結(jié)構(gòu)異常的核型；絕大多數(shù)血液腫瘤都有非隨機的染色體畸變； 血液病: 急性非淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合征：63% 淋巴瘤：10% 實體腫瘤：27%,14,1。、由于腫瘤細(xì)胞在體外的增殖能力較差，

10、中期細(xì)胞數(shù)量少； 2、腫瘤細(xì)胞的染色體核型形態(tài)較差，難分析； 3、細(xì)胞毒性藥物的治療也會影響骨髓細(xì)胞培養(yǎng)成功率，最好是治療前的標(biāo)本進行培養(yǎng)；MPD中的骨髓抑制治療以及MDS中的支持治療也往往干擾細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果； 4、不同培養(yǎng)方式，檢出率不同，如t(15;17)類型的病例，需要進行24-48小時的培養(yǎng)才能得到結(jié)果。,技術(shù)難點,15,骨髓細(xì)胞染色體分析流程圖,骨髓細(xì)胞,骨髓培養(yǎng)基,24h,秋水仙胺5h,0.5h,16,染色體制備影響因素分析,1、培養(yǎng)基pH、濃度、小牛血清量及培養(yǎng)箱溫度的恒定是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。 2、適量秋水仙素、適宜的處理時機和時間,是獲得良好、足夠分裂相的條件。分裂相的多少和染色

11、體形態(tài)及帶型處理良好與否均受其影響。 3、低滲處理是獲得分散良好的分裂相的關(guān)鍵步驟 ,低滲過度或不足都會造成染色體形態(tài)不良的結(jié)果。 在低滲處理時期細(xì)胞十分嬌嫩 ,并且表面發(fā)黏 ,低滲細(xì)胞混勻時 ,吹打要適宜 ,避免細(xì)胞破碎及粘團 ,另外不要將細(xì)胞吸到吸管上部及離心管上部 ,避免細(xì)胞丟失。,17,4、固定技術(shù)是制備良好分散的染色體的重要步驟。 若染色體分散不良 ,可適當(dāng)加大冰乙酸含量 ,其同時有改善由于低滲處理不夠或固定不充分所造成的缺陷 ,但過量會造成染色體形態(tài)變化和影響分帶結(jié)果。 染色體形態(tài)不良與加固定液速度有關(guān) ,加第一次固定液快或過快 ,可造成飄帶樣染色體。 5、固定液每次使用必須新鮮配

12、制 ,否則將會形成酯類 ,從而影響固定效果。 6、滴片是染色體制備中影響染色體形態(tài)的關(guān)鍵一步。 首先是載玻片要非常干凈,否則會影響染色體的分散和分帶效果。 其次是滴片的距離、制片的方式都會影響染色體分期效果?？酒臏囟?、時間與染色體形態(tài)和分帶有關(guān)。不宜溫度過高和烤片時間過長。,18,常用染色體帶紋顯示方法,R-banding,G-banding,G（Giemsa）帶：Giemsa顯帶，經(jīng)典方式，常用于臨床 R（Reverse）帶：與G顯帶帶紋相反，可觀察染色體的末端缺失,19,染色體閱片的七大影響因素,1、染色體分裂指數(shù)低 2、染色體形態(tài)不理想 3、染色體形態(tài)偏長 : 4、染色體形態(tài)偏短 5、

13、染色體分帶不良 6、染色背景不良 7、培養(yǎng)失敗,20,白血病類型的細(xì)胞遺傳學(xué)表現(xiàn),由于絕大多數(shù)白血病患者都有非隨機的染色體畸變，它們對于白血病的診斷分型、預(yù)后估計、治療方案的選擇乃至發(fā)病機制的研究都有極為重要的價值。 盡管染色體改變的種類繁多，但具有四種基本特征： 獲得性： 克隆性 原發(fā)性和繼發(fā)性 平衡性和不平衡性,21,獲得性,獲得性：白血病染色體畸變?yōu)楹筇飓@得而非先天遺傳。許多研究表明，如同卵雙生子之一患CGL，ph染色體不見于其健康的孿生同胞；白血病患者所生子女通常缺乏同樣的白血病和核型異常的證據(jù)；白血病患者其染色體畸變通常不見于皮膚和結(jié)締組織。,22,克隆性,克隆性：是指來自同一個惡性

14、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一群白血病細(xì)胞具有相同的染色體異常,23,原發(fā)性和繼發(fā)性,原發(fā)性和繼發(fā)性：原發(fā)性畸變是指發(fā)生于疾病早期，與白血病的發(fā)生有關(guān)，和白血病的細(xì)胞學(xué)，免疫學(xué)有關(guān)。因而對白血病有分類和標(biāo)志性的意義并決定其生物學(xué)特征的一類異常。 繼發(fā)性畸變：指病程中由于克隆衍化所致的異常，它雖和疾病的發(fā)生無關(guān)，但卻賦予疾病更加惡性的特征,24,平衡性和不平衡性,平衡性和不平衡性： 平衡性畸變是指白血病患者的染色體異常，常表現(xiàn)為染色體的結(jié)構(gòu)重排，如相互易位或者是倒位，而無DAN含量的改變； 非平衡性畸變是指染色體異常常表現(xiàn)為整條染色體或部分的增加或丟失，而有DAN含量的改變。,25,26,1、染色體數(shù)目異常,(1

15、).多倍體 (2).非整倍體,27,2、染色體結(jié)構(gòu)異常,（1）缺失 （2）插入 （3）倒位 （4）易位,（5）重復(fù) （6）環(huán)狀染色體 （7）等臂染色體 （8）雙著絲粒染色體,28,29,30,31,32,33,常見結(jié)構(gòu)異常的符號及含義,34,一、慢性粒細(xì)胞白血?。–ML） Ph染色體：ph染色體是9和22號染色體易位后的der(22) t(9;22)(q34;q11) .Ph染色體見于全部的髓系細(xì)胞、一部分B系細(xì)胞和極少數(shù)的T系細(xì)胞。這表明是多能造血干細(xì)胞突變所致的克隆性疾病。 由于號染色體長臂上的斷裂點是變化的，因而導(dǎo)致種不同大小的染色體： 型（最大），斷裂點位于.； 型（大），斷裂點位于.

16、； 型（中等），斷裂點位于； 型（最小），斷裂點位于. 其中前兩型少見，后兩型較多見,白血病類型的細(xì)胞遺傳學(xué)表現(xiàn),35,2、Ph易位的類型,變異易位 隱匿易位,典型易位t(9;22)(q34;q11),36,CML t(9;22)(q34;q11),37,CML 不典型Ph易位,38,慢粒慢性期的染色體改變,46,t(9;22),t(9;22), -Y;+8;+Ph,39,CML t(9;22),-Y,40,慢粒急變期的染色體改變及其意義,20%保持46,t(9;22)不變 80%除t(9;22)外出現(xiàn)額外異常，依次為2Ph、+8、i(17q)、+19、+21等 少數(shù)病例Ph染色體可和t(8;

17、21)、t(15;17)、inv(16)或inv(3)同時存在 額外異常比臨床血液學(xué)急變征象早出現(xiàn)2-4個月 無額外異常組 80%對治療有反應(yīng)，MS 5.7個月 部分細(xì)胞有額外異常組 50%對治療有反應(yīng)，MS 4.9個月 全部細(xì)胞有額外異常組成 30%對治療有反應(yīng),MS 2.5個月,41,慢粒的細(xì)胞遺傳學(xué)分型,Ph-bcr+ 50%,Ph-bcr- 50%,Ph-,Ph+,42,二、慢淋的染色體變化,43,+12 1/3染色體異常CLL 數(shù)目異常 +3（6%） +18（5%） B細(xì)胞慢淋 14q+ 25%染色體異常CLL t(11;14)(q13;q32) t(14;19)(q32;q13)

18、結(jié)構(gòu)異常 del(13q) 20%染色體異常CLL i(17q) 6q- T細(xì)胞慢淋 inv(14)(q11q32),44,CLL +12,45,CLL 13q-,i(17q),46,CLL +7,t(8;22),11q-,+mar2,47,T-CLL inv(14),48,三、急非淋/急髓白血病的染色體改變,染色體異常檢出率50%-80%，最高達(dá)93%，檢出率高低主要與方法學(xué)有關(guān)，其次與地理環(huán)境及種族的差異有關(guān) 原發(fā)性核型異常分兩大類 和FAB亞型相關(guān)，特異性染色體重排 和FAB亞型 不相關(guān)，大多為數(shù)目異常 初診時核型異常在CR時消失，復(fù)發(fā)時再現(xiàn) 部分病例由于核型演化產(chǎn)生繼發(fā)性異常,49,A

19、NLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排1,50,AML-M2 t(8;21)(q22;q22),-Y,51,AML-M2 t(8;21),-Y,52,AML-M2 t(8;21),9q-,-Y,53,AML-M2 94,XXXX,+4,+4,t(8;21)X2,54,t(8;21)(q22;q22),-Y t(15;17),55,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排2,56,AML-M3 t(15;17),57,AML-M3 +8, t(15;17),58,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排3,59,16 倒位 inv(16)(p13q22),60,AM

20、L-M4Eo +8,inv(16),61,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排4,62,AML-M5a t(6;11),63,AML-M5a t(9;11),64,AML-M5a t(11;19),65,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排5,66,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排6,67,AML-M2 t(6;9),68,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排7,69,AML-M2 t(7;11),70,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排8,71,AML-M4 t(16;21),72,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的

21、特異性染色體重排9,73,AML-M1(M2,M4,M7)inv(3)(q21q26),74,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排10,75,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排11,76,AML-M2 t(2;12),77,ANLL/AML和FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排12,78,ANLL/AML 中和FAB亞型不相關(guān)的核型異常,+8(8%)、-7/7q-(7%)、+21(1-2%)、+11(1%)、+13(1%) +11顯示干/祖細(xì)胞表型（HLA-DR和CD34陽性），分子水平上可見MLL外顯子2-8的串聯(lián)重復(fù)，治療效果差，僅獲短暫首次CR +13者白血病細(xì)胞常同時表達(dá)髓系和T系抗原，特別多見于M0和M1型，原始細(xì)胞呈手鏡樣或小原淋樣細(xì)胞，CR率低，MS9.5個月,79,AML-M4 +8,80,AML-M2 +11,