1、促紅生成素,1,目錄,1、促紅生成素的簡介 2、促紅生成素的作用原理 3、EPO 的應(yīng)用 4、用量用法 5、不良反應(yīng)及禁忌 6、臨床意義 7、 重組EPO 8、重組EPO的生物學(xué)活性檢測 9、檢驗方法 10、EPO的血清檢測 11、市場前景,2,促紅生成素的簡介,英文名稱：erythropoietinin; ：在哺乳動物腎臟和肝臟產(chǎn)生的一種分子質(zhì)量為46kDa的糖蛋白細胞因子 。能刺激幼稚紅細胞的增生，血紅蛋白化和紅細胞的成熟。 ：由腎臟分泌的調(diào)節(jié)紅系祖細胞生長的細胞因子。,定義1,定義2,3,人體內(nèi)約90%的促紅細胞生成素由腎臟產(chǎn)生, 對紅細胞的正常分裂、發(fā)育和成熟。起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用.,

2、4,促紅生成素的作用原理,EPO是促紅細胞生成素的英文簡稱。人體中的促紅細胞生成素是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進紅細胞生成。服用紅細胞生成素可以使患腎病貧血的病人增加血流比溶度（即增加血液中紅細胞百分比）。人體缺氧時，此種激素生成增加，并導(dǎo)致紅細胞增生。,5,EPO 的應(yīng)用,EPO興奮劑是根據(jù)促紅細胞生成素的原理人工合成，它能促進肌肉中氧氣運輸，從而使肌肉更有勁、工作時間更長.,6,在2008年北京奧運會中第一例的興奮劑檢查呈陽性的西班牙自行車選手瑪麗亞莫里諾，就是被發(fā)現(xiàn)使用使用促紅細胞生成素(EPO)，國際奧委會于2008年8月11日宣布取消其參賽資格。,應(yīng)用案例,7,EPO作

3、為興奮劑的使用,8,其它應(yīng)用,：促進新血管的形成和減少心肌 梗塞面積，控制細胞凋亡，進而保護以及組織免受缺氧、毒素及氧化應(yīng)激系統(tǒng)誘導(dǎo)損傷。 ：抑制細胞表面炎癥因子，降低正常細胞對炎癥效應(yīng)。 :作用于小腸內(nèi)膜表面EPO受體，促粘膜增生發(fā)育，繼而小腸對脂類 及氨基酸類物質(zhì)吸收功能。,1、對心臟的作用,2、抑制炎癥,3、抑制炎癥,9,用量用法,靜脈注射開始應(yīng)用較低劑量50100IU/kg，每周3次，如果在4周內(nèi)，網(wǎng)狀紅細胞計數(shù)、血細胞比容和血紅蛋白水平未見明顯增加，本品的劑量可遞增,10,不良反應(yīng)及禁忌,常見有血壓升高、心悸。偶見瘙癢感、皮疹及GOT或GPT值升高、惡心、嘔吐、眩暈、頭痛、發(fā)熱、血鉀

4、升高等。 血液透析不能控制動脈血壓升高的患者、鉛中毒及感染患者禁用，有藥物過敏者、變態(tài)反應(yīng)體質(zhì)者慎用。應(yīng)及時對用本品治療者的血壓進行監(jiān)測，必要時給抗高血壓藥物。應(yīng)注意血管栓塞情況，有時需增加肝素的劑量。必要時補鐵，使患者的轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度維持在20%以上,谷丙轉(zhuǎn)氨酶,天 冬 氨 酸 轉(zhuǎn) 氨 酶,11,1腎性貧血患者EPO水平較低，在進行治療過程中，往往通過注射EPO來提高體內(nèi)EPO水平進行治療，從而幫助病人增加紅細胞數(shù)量，此時EPO水平有所上升。 2其他貧血如缺鐵性貧血、巨細胞性貧血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治療，此時濃度也會有所升高 3. 生障礙性貧血和骨髓造血功能不全患者EPO

5、水平升高。,臨床意義,12,重組EPO 天然的 hEPO制品一般是從貧血病患者尿中提取的，所以藥源極為匱乏，不能滿足需要。因此，在20世紀80年代就開始rhEPO的研究，從胎兒肝中克隆出 人促紅細胞生成素基因, 并研制成功 重組人EPO。 目前國內(nèi)外在獲取EPO基因后，首選中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表達系統(tǒng)來表達生產(chǎn)重組人EPO。,13,重組人促紅素注射液（CHO細胞）,【商品名】益比奧 【規(guī)格】1萬國級單位/瓶 【生產(chǎn)廠家】沈陽三生制藥 【成分】重組人促紅素。輔料：人血白蛋白、氯化鈉、一水枸櫞酸、二水枸櫞酸三鈉,14,構(gòu)建基因組噬菌體文庫克隆EPO基因,血細胞 中提取基 因組DNA,篩選完整

6、EPO 基因的插 入片段,轉(zhuǎn)入CHO 中表達。,PCR方法 從基因組模板 中擴增EPO基 因片段為探針,BamH酶切,回收酶切片段,構(gòu)建基因組 噬菌體文庫,插入噬菌體 EMBL3載體,克隆,15,重組EPO的生物學(xué)活性檢測,正常功能狀況下，EPO的主要生物學(xué)性狀是增加紅細胞的產(chǎn)生，因此紅細胞數(shù)目的增多，血紅蛋白含量的增加及紅細胞壓積的改變，此三項指標可以用于反映EPO的體內(nèi)生物學(xué)活性，這也是比較特異性的檢測指標。,16,檢驗方法,可由SD大鼠來完成。其大致做法為：一周兩次，連續(xù)3周對實驗動物皮下注射rHuEPO；實驗對照組則同等劑量的生理鹽水，在實驗結(jié)束時，檢測實驗組與對照組紅細胞計數(shù)、血紅蛋

7、白含量及血球壓積，以確定rHuEPO的體內(nèi)生物學(xué)活性。,17,檢驗結(jié)果記錄,18,EPO的血清檢測,采用酶免檢測試劑盒檢測。,19,檢測原理,采用雙抗體夾心法檢測EPO。兩種不同的抗體，分別包被微孔板和標記HRP酶。當 標本中含有相應(yīng)的抗原時，會形成抗體-抗原-抗體-酶的復(fù)合物。未結(jié)合的物質(zhì)通過洗滌去除。加入顯色底物顯 色，通過測量顏色的變化來判斷標本中抗原的濃度。,20,酶聯(lián)反應(yīng),21,檢驗步驟,1 準備 (1).測試前將試劑盒組分置于室溫(18- 25)平衡30分鐘，測試后應(yīng)立即放回2-8保存。 (2).如果EPO濃度高于160mU/ml，稀釋后檢測。,22,2、反應(yīng) (1).取出所需要的

8、板條。 (2).分別向孔中加入50l標準品、質(zhì)控血清或標本。 (3).每孔中加入50l酶結(jié)合物。震動10-20秒混勻。 (4).37孵育30分鐘。 (5).扣除孔中液體，并用洗液洗滌5次。 (6).在干凈的紙巾或毛巾上拍干，盡量去除殘留的水分。,23,3、顯色 (1).每孔各加入1滴顯色底物A和B，置于室溫(18-25)避光顯色15分鐘。 (2).每孔加入1滴終止液，輕輕震動幾次混勻。 (3).在30分鐘內(nèi)，以630nm作為參考波長，測量450nm處的吸光度(A450)。,24,4，計算,（1).以標準品的吸光度為Y軸，濃度為X軸作圖。 （2).根據(jù)質(zhì)控血清和標本的吸光度值，從標準曲線上反算EPO的濃度。 （3).如果樣品經(jīng)過稀釋，在計算其濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。,25,曲線圖,26,1989年安進公司的第一個基因重組藥物Epogen獲得FDA的批準，1999年銷售值達到17.6億美元，2000年19.6億美元，2002年22.6億美元，2003年24.4億美元，成為名副其實的“重磅炸彈”基因藥物2001年，EPO（包括Arnesp）的全球銷售額達21.1億美元，2002