1、酶制劑技術(shù) 張曉靜,第四章 酶活力的測(cè)定 主講：張曉靜,第四章 酶活力的測(cè)定,第一節(jié) 酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)(略) 第二節(jié) 酶活力測(cè)定方法,張曉靜 2009.09,第二節(jié) 酶活力測(cè)定方法,一、酶活力 二、酶活力的測(cè)定,張曉靜 2009.09,一、酶活力,酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表示，兩者呈線性關(guān)系。酶反應(yīng)速率越大，酶活力越高，反之越低。 酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。在實(shí)際酶活性測(cè)定中一般以測(cè)定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。 酶活力的測(cè)定就是測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率。,1.概念,張曉靜 2009.09,一、酶活

2、力,酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力單位表示,即酶單位(activity unit，U)。 酶單位的定義：在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。這樣酶的含量就可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來(lái)表示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。 世界各地實(shí)際應(yīng)用的酶活力單位的定義各不相同。同一種酶往往有幾種不同的單位。 例如，1IUlmol/min；1Kat = 1mol/s,2.酶活力單位,張曉靜 2009.09,一、酶活力,酶活力的測(cè)定要在最適條件下進(jìn)行，即最適溫度、最適pH、最適底物濃度和最適緩沖液離子強(qiáng)度等，只有在最適條件下測(cè)定才能真實(shí)反映酶活力大小。 測(cè)定

3、酶活力大小時(shí)，通常要求底物濃度足夠大，測(cè)定底物濃度的變化在起始濃度的5以內(nèi)的速率，這樣可以保證所測(cè)定的速率是最初速率。此結(jié)果能比較可靠地反映酶的含量。,張曉靜 2009.09,一、酶活力,3.酶的比活力,酶的比活力代表酶的純度，通常用下式表示： 酶比活力= 酶活力單位數(shù)(U) / 蛋白質(zhì)量(mg) 有時(shí)也采用每克(g)酶制劑或每毫升(mL)酶制劑含有多少個(gè)活力單位來(lái)表示。 比活力的大小可用來(lái)比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力。比活力是酶學(xué)研究及生產(chǎn)中經(jīng)常使用的指標(biāo)。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,1.酶活力的測(cè)定步驟,要求酶活力的測(cè)定方法：快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。,酶活力測(cè)定均包括兩個(gè)階段：

4、首先要在一定的條件下，酶與其作用底物反應(yīng)一段時(shí)間，然后再測(cè)定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物變化的量。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,酶活力 的測(cè)定步驟, 底物, 反應(yīng)條件, 反應(yīng)時(shí)間, 底物或產(chǎn)物 變化量,選擇底物 配制底物溶液,確定酶促反應(yīng)條件：pH、溫度等,準(zhǔn)確計(jì)時(shí)并終止反應(yīng),運(yùn)用各種檢測(cè)技術(shù)，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定變化量,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,底物：根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。要求所使用的底物均勻一致，達(dá)到一定的純度。有些底物溶液要求新鮮配制，有些則可預(yù)先配制后置冰箱保存?zhèn)溆谩?反應(yīng)條件：據(jù)資料或試驗(yàn)結(jié)果，確定酶促反應(yīng)的溫度、pH等條件

5、。溫度可選在室溫(25)、體溫(37)、酶促反應(yīng)最適溫度或其他選用的溫度，一般在恒溫裝置內(nèi)進(jìn)行。pH應(yīng)是酶促反應(yīng)的最適pH，采用一定濃度和一定pH的緩沖溶液來(lái)保持。反應(yīng)條件一經(jīng)確定，在反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)盡量保持恒定不變。有些酶促反應(yīng)要求激活劑等其他條件，應(yīng)適量添加。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,底物或產(chǎn)物的變化量：反應(yīng)到一定時(shí)間，取出適量的反應(yīng)液，運(yùn)用各種生化檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定產(chǎn)物增加量或底物的減少量。為了準(zhǔn)確地反應(yīng)酶促反應(yīng)的結(jié)果，應(yīng)盡量采用快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法測(cè)出結(jié)果。,反應(yīng)時(shí)間：在一定條件下，將一定量的酶液與底物溶液混合均勻，適時(shí)記下反應(yīng)開(kāi)始的時(shí)間。反應(yīng)到一定時(shí)間及時(shí)終止反應(yīng)。終止酶

6、促反應(yīng)的方法要根據(jù)酶的特性、反應(yīng)底物或產(chǎn)物的性質(zhì)以及檢測(cè)方法等加以選擇。常用：加熱、添加酶變性劑、加入酸液或堿液、冰浴等。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,2.酶活力的測(cè)定方法,測(cè)定反應(yīng)液中物質(zhì)的變化量，可采用光學(xué)檢測(cè)法、化學(xué)檢測(cè)法等生化檢測(cè)技術(shù)。 一種酶可能有多種測(cè)定方法，要根據(jù)實(shí)際情況選用。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,1.分光光度法,2.熒光法,酶 活 力 的 測(cè) 定 方 法,3.同位素測(cè)定法,4.電化學(xué)方法,5.其他方法,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,1.分光光度法,分光光度法主要利用底物和產(chǎn)物在紫外光或可見(jiàn)光部分的光吸收度的不同，選擇一適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，

7、測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)進(jìn)行的情況。其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間和樣品，可檢測(cè)到nmol/L水平的變化。該方法可以連續(xù)地讀出反應(yīng)過(guò)程中光吸收的變化，已成為酶活力測(cè)定中一種重要的方法之一。幾乎所有的氧化還原酶都可以用此法測(cè)定。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,由于分光光度法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因此可以把一些原來(lái)沒(méi)有光吸收變化的酶反應(yīng)通過(guò)與一些能引起光吸收變化的酶反應(yīng)偶聯(lián)，使第一個(gè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成為第二個(gè)酶的具有光吸收變化的產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行測(cè)量。這種方法稱為酶偶聯(lián)測(cè)定法。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,2.熒光法,熒光法主要是根據(jù)底物或產(chǎn)物熒光性質(zhì)的差別來(lái)進(jìn)行測(cè)定。由于熒光方法的靈敏度往往比分光

8、光度法要高若干個(gè)數(shù)量級(jí)，而且熒光強(qiáng)度和激光的光源有關(guān)，因此在酶學(xué)研究中越來(lái)越多地被采用，特別是一些快速反應(yīng)的測(cè)定方法。 該法缺點(diǎn)：易受其他物質(zhì)干擾，有些物質(zhì)如蛋白質(zhì)能吸收和發(fā)射熒光，這種干擾在紫外區(qū)尤為顯著，故用熒光法測(cè)定酶活力時(shí)，應(yīng)盡可能選擇可見(jiàn)光范圍的熒光進(jìn)行測(cè)定。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,3.同位素測(cè)定法,用帶有放射性同位素標(biāo)記的底物經(jīng)酶作用后得到產(chǎn)物，通過(guò)適當(dāng)?shù)姆蛛x，測(cè)定產(chǎn)物的脈沖數(shù)即可換算出酶的活力單位。 已知六大類酶幾乎都可以用此方法測(cè)定。 通常用于底物標(biāo)記的同位素有3H、14C、32P、35S和131I等。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)靈

9、敏度極高，可直接用于酶活力的測(cè)定，也可用于體內(nèi)酶活性測(cè)定。特別是適用于低濃度的酶和底物的測(cè)定。 缺點(diǎn)：操作繁瑣，樣品需分離，反應(yīng)過(guò)程無(wú)法連續(xù)跟蹤，且同位素對(duì)人體有損傷作用。輻射猝滅會(huì)引起測(cè)定誤差，如3H發(fā)射的射線很弱，甚至?xí)患埼铡?張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,4.電化學(xué)方法,電化學(xué)方法包括：pH測(cè)定法和離子選擇電極法等。 pH測(cè)定法最常用的是玻璃電極，配合一高靈敏度的pH計(jì)，跟蹤反應(yīng)過(guò)程中H+變化的情況，用pH的變化來(lái)測(cè)定酶的反應(yīng)速率。也可以用恒定pH測(cè)定法，在酶反應(yīng)過(guò)程中，所引起的H+的變化用不斷加入堿或酸來(lái)保持其pH恒定，用加入的堿或酸的速率來(lái)表示反應(yīng)速率。用此法可以測(cè)定許多酯酶的活力。,張曉靜 2009.09,二、酶活力的測(cè)定,在使用離子選擇電極法測(cè)定某些酶的酶活力時(shí),用氧電極可以測(cè)定一些耗氧的酶反應(yīng)。如葡萄糖