1、細(xì)菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)原理及操作注意事項(xiàng),中國(guó)最專業(yè)的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)健康檢測(cè)服務(wù)機(jī)構(gòu),1,PPT學(xué)習(xí)交流,*細(xì)菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)的意義 *建立無菌概念，了解無菌操作,*常規(guī)病原菌的分離流程 *病原菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)原理,*細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn) *細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng),1,2,3,2,PPT學(xué)習(xí)交流,意義,細(xì)菌分離鑒定實(shí)驗(yàn),超級(jí)耐藥菌,健康養(yǎng)殖,確診疾病,診療方案,3,PPT學(xué)習(xí)交流,建立無菌觀念,什么是無菌 無菌，指沒有活菌的意思，又是生物技術(shù)中的一個(gè)重要概念。只有在培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備等處于無菌的前提下，微生物接種后，才能實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)，最終得到所需的產(chǎn)品。,4,PPT學(xué)習(xí)交流,5,PPT學(xué)習(xí)交流,接種方法,

2、曲線劃線法、分區(qū)劃線法 傾注法、涂布法（細(xì)菌計(jì)數(shù)） 斜面接種法（生化鑒定、保存菌種） 穿刺培養(yǎng)法（生化鑒定、保存菌種） 液體培養(yǎng)基接種法,6,PPT學(xué)習(xí)交流,7,PPT學(xué)習(xí)交流,8,PPT學(xué)習(xí)交流,病原菌的分離鑒定,細(xì)菌分離培養(yǎng) 主要針對(duì)性用于臨床發(fā)病動(dòng)物組織臟器，糞便中的細(xì)菌時(shí)對(duì)某一種細(xì)菌的分離，通過分離，使細(xì)菌在平板中分散生長(zhǎng)，便于觀察單個(gè)菌落特性，也易挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行生化鑒定。,9,PPT學(xué)習(xí)交流,1.基本條件 （1）接種用具：棉簽、接種環(huán)、接種針、酒精燈 （2）培養(yǎng)箱：普通恒溫培養(yǎng)箱 （3）無菌室和超凈工作臺(tái) （4）培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂 2.接種方法 分區(qū)劃線法 用

3、棉簽先將標(biāo)本涂布在平板的第一區(qū)并作數(shù)次劃線，再在二、三區(qū)依次用接種環(huán)劃線。 每劃一個(gè)區(qū)域，應(yīng)將接種環(huán)燒灼一次，待冷卻后再劃下一區(qū)域。每一區(qū)域的劃分應(yīng)接觸線應(yīng)接觸上一區(qū)域的接種線23次，使菌量逐漸減少，以形成單個(gè)菌落。 劃線完畢，將平板加蓋，倒置，以適宜的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。,10,PPT學(xué)習(xí)交流,（2）液體培養(yǎng)基接種法（增菌法） 用棉簽或接種環(huán)挑取病料或菌落，在試管壁和液面交界處輕輕研磨，使菌團(tuán)混勻在液體培養(yǎng)基中。 （3）傾注平板法 主要用于水質(zhì)（飲水）的細(xì)菌計(jì)數(shù) 將滅菌生理鹽水適量稀釋（通常做10-1-10-4稀釋）的水質(zhì)1ml，置滅菌平皿內(nèi)，注入以滅菌溶化并冷卻至50左右的培養(yǎng)基15ml，混勻，

4、待冷卻后，倒置。于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基內(nèi)菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即可算出每毫升被檢物的細(xì)菌數(shù)。,11,PPT學(xué)習(xí)交流,大腸桿菌細(xì)菌分離,黑色帶有金屬光澤，圓形隆起,粉紅色或深紅色、圓形隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊；,12,PPT學(xué)習(xí)交流,沙門氏菌細(xì)菌分離,圓形、微凸、邊緣整齊、直徑在12 mm的小菌落，菌落無色透明、淡黃色透明或外周透明中心黑色,藍(lán)綠色或藍(lán)色菌落，產(chǎn)硫化氫菌株菌落中心帶黑色,13,PPT學(xué)習(xí)交流,實(shí)驗(yàn)室分離,鏈球菌在血液瓊脂中生長(zhǎng)為無色透明、圓形、光滑、隆起的露滴狀小菌落,巴氏桿菌在血瓊脂平板生長(zhǎng)為淡灰白色，閃光的露珠狀小菌落,14,PPT學(xué)習(xí)交流,形態(tài)學(xué)檢查,染色標(biāo)本

5、的檢查 通過對(duì)標(biāo)本的涂片及染色觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色特性，一及莢膜、鞭毛、芽孢、異染顆粒等結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的初步識(shí)別或診斷。 1.涂片：從肉湯或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理鹽水的玻片上，涂片厚薄適當(dāng)。 2.固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通過3次，加熱固定。 3.染色：滴加染液覆蓋菌膜。 4.脫色：乙醇是最常用的脫色劑，70%乙醇和無機(jī)酸脫色能力強(qiáng)。 5.復(fù)染：復(fù)染可使脫色的細(xì)菌重新著色。,15,PPT學(xué)習(xí)交流,常用的染色方法 革蘭氏染色法：最常用的一種染色方法 （1）染色步驟 結(jié)晶紫初染：結(jié)晶紫染色1.5min，水洗，甩干 碘液媒染：碘液染色2min，水洗，甩干 酒精脫色：9

6、5%乙醇脫色，2030s，脫色到無結(jié)晶紫為止，水洗，甩干 石碳酸復(fù)紅復(fù)染：石碳酸復(fù)紅染色1.5min ，水洗，吸水紙吸干。 （2）結(jié)果 革蘭氏陽(yáng)性藍(lán)紫色，革蘭氏陰性紫紅色。,16,PPT學(xué)習(xí)交流,大腸桿菌形態(tài)鑒定,17,PPT學(xué)習(xí)交流,沙門氏菌形態(tài)鑒定,18,PPT學(xué)習(xí)交流,巴氏桿菌形態(tài)鑒定,19,PPT學(xué)習(xí)交流,鏈球菌形態(tài)鑒定,20,PPT學(xué)習(xí)交流,葡萄球菌形態(tài)鑒定,21,PPT學(xué)習(xí)交流,病原菌的生化鑒定, 糖類發(fā)酵試驗(yàn) 原理：不同細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖類的酶，分解糖能力不同，產(chǎn)生代謝物不同，看細(xì)菌是否分解各類糖，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣。 葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn) 原理：又稱氧化/發(fā)酵試驗(yàn)，觀察細(xì)菌對(duì)葡萄糖

7、分解過程中是利用分子氧（氧化性），還是無氧酵解（發(fā)酵型），或不分解葡萄糖（產(chǎn)堿性） 三糖鐵試驗(yàn) 原理：三糖鐵用于觀察細(xì)菌對(duì)糖的發(fā)酵能力，以及是否產(chǎn)生硫化氫，可初步鑒定細(xì)菌的菌屬。,22,PPT學(xué)習(xí)交流,生化鑒定,23,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn), 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（AST，藥敏試驗(yàn)） 用于測(cè)試抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無抑制作用。常用最低抑菌濃度（MIC）表示，即體外能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。, 方法： 擴(kuò)散法（紙片法） 稀釋法（瓊脂稀釋法和液體稀釋法）,24,PPT學(xué)習(xí)交流,快速藥敏試驗(yàn)： 由病料直接涂布藥敏試驗(yàn)與病原菌分離同時(shí)進(jìn)行（16-24h），可根據(jù)藥敏結(jié)果初步進(jìn)

8、行治療。 前增菌法藥敏試驗(yàn)： 挑取組織培養(yǎng)后菌落，放于滅菌肉湯培養(yǎng)液中，涂抹進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)8-12h后觀察結(jié)果。 傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)： 耗時(shí)較長(zhǎng)（2-3天），對(duì)于一般養(yǎng)殖場(chǎng)定期監(jiān)測(cè)病原菌及其敏感性時(shí)，可以使用此方法。能較好地分離出病原菌，病原菌經(jīng)純培養(yǎng)后，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，得出的數(shù)據(jù)可以準(zhǔn)確反應(yīng)出病原菌對(duì)某一藥物的敏感性。,試驗(yàn)方法,25,PPT學(xué)習(xí)交流,（1）樣品處理： 用滅菌棉簽沾取組織內(nèi)部，然后打開裝有增菌液（營(yíng)養(yǎng)肉湯）的管子，使增菌液與棉簽充分混勻，蓋上蓋子，做好標(biāo)記，放入恒溫箱中37培養(yǎng)12-24小時(shí)，此肉湯菌液為前增菌液。 （2）細(xì)菌分離培養(yǎng)： 待取出裝有沾取病變組織滅菌棉簽的試管，觀察營(yíng)養(yǎng)

9、肉湯中的細(xì)菌變混濁。若變混濁，用接種環(huán)挑取菌液，無菌操作劃線接種于麥康凱瓊脂、SS瓊脂，37培養(yǎng)12-24h，觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，初步判定感染病原菌的類型。,操作過程,前增菌藥敏試驗(yàn),26,PPT學(xué)習(xí)交流,（3）涂板、貼紙片： 用滅菌棉簽沾取稀釋的培養(yǎng)液，在管壁清碰幾下，擠掉多余水分，均勻涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻，并貼上藥敏紙片，37倒置培養(yǎng) 8 - 18h，觀察結(jié)果。,操作過程,27,PPT學(xué)習(xí)交流,（4） 結(jié)果觀察、判定標(biāo)準(zhǔn),抑菌圈：用游標(biāo)卡尺從平板背面精確測(cè)量各個(gè)抑菌圈直徑（精確到0.01mm），抑菌圈的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。原料藥判定按抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)2010 成品藥判定標(biāo)準(zhǔn) ： 20 mm 極敏 15-20 mm 高敏 10-14 mm 中敏 10 mm 不敏 選藥原則：敏感而價(jià)格低的藥，實(shí)際的運(yùn)用 過程中應(yīng)交叉給藥，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生,28,PPT學(xué)習(xí)交流,29,PPT學(xué)習(xí)交流,30,PP