1、植物種質(zhì)資源的離體保存,Beans(Phaseolus spp.),種質(zhì)（germplasm）是指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞直接傳遞給子代并決定固有生物性狀的遺傳物質(zhì)。 植物種質(zhì)資源（又稱品種資源、遺傳資源或基因資源）是生物多樣性的重要組成部分，是選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗?。ㄏx）、抗逆新品種的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物技術(shù)研究取之不盡的基因來源。 種質(zhì)資源越多，其多樣性越豐富，改良品種或選育新品種的潛力就越大。未來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在很大程度上取決于對(duì)種質(zhì)資源的占有量和利用程度，故保持生物多樣性有重要意義。 據(jù)估計(jì)，由于自然災(zāi)害和生態(tài)條件惡化，植物物種以平均每天一個(gè)種的速度消失，物種一旦滅絕，人類將永遠(yuǎn)失去利用它的機(jī)會(huì)

2、。 目前，全世界有56萬(wàn)種植物的生存受到不同程度的威脅。因此，搜集和保存種質(zhì)資源已受到世界各國(guó)的重視。,種質(zhì)保存（germplasm conservation）是指利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，借以保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性，并且有強(qiáng)的生活力，能通過繁殖將其遺傳特性傳遞下去。 植物種質(zhì)資源保存的方式有原生境保存（in situ conservation）和非原生境保存（ex situ conservation）。 原生境保存是指在原來的生態(tài)環(huán)境中，就地進(jìn)行繁殖保存種質(zhì)，如建立自然保護(hù)區(qū)或保護(hù)小區(qū)，甚至保護(hù)點(diǎn)等途徑來保護(hù)作物及經(jīng)濟(jì)林木的野生近緣植物物種； 非原生境保存

3、是指種質(zhì)保存于該植物原生態(tài)生長(zhǎng)地以外的地方，包括異地保存（種質(zhì)圃或植物園保存）、種質(zhì)庫(kù)（種子）保存、離體（試管）保存等。,原生境保存和異地保存固然有其明顯的重要性，但要保存大量種質(zhì)，則需耗費(fèi)巨大的人力、物力和土地，在實(shí)際中很難實(shí)施，而且易受自然災(zāi)害、蟲害和病害的侵襲，造成植物種質(zhì)資源的喪失。以種子的形式保存時(shí)，所占的空間較小，并且能夠保存很多年，種子容易干燥、包裝，便于運(yùn)輸?shù)揭N中心和基因庫(kù)。 種子保存存在的限制因素：種子生活力隨貯存期的延長(zhǎng)會(huì)逐漸喪失；無(wú)性繁殖的植物（如蘋果、柑橘、甘薯、馬鈴薯等）難于采用種子保存；采用無(wú)性繁殖來保持其優(yōu)良性狀的植物（如許多果樹），用種子繁殖后代會(huì)發(fā)生變異；頑

4、拗型種子植物（芒果、椰子、油棕和咖啡等）因其種子不易干燥脫水和低溫貯藏，不宜用種子保存或保存難度很大；有些植物種質(zhì)是不產(chǎn)生種子的，如臍橙、香蕉等；易遭自然災(zāi)害襲擊而使種質(zhì)資源丟失。,種質(zhì)資源離體保存（germplasm conservation in vitro）是指對(duì)離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長(zhǎng)的處理措施使之保存，在需要時(shí)可重新恢復(fù)其生長(zhǎng)，并再生植株的方法。 離體種質(zhì)保存有以下優(yōu)點(diǎn)： 所占空間少，節(jié)省人力、物力和土地； 有利于國(guó)際間的種質(zhì)交流及瀕危物種（endangered species）搶救和快繁； 需要時(shí)，可以用離體培養(yǎng)方法很快大量繁殖

5、； 避免自然災(zāi)害引起的種質(zhì)丟失。,上世紀(jì)70年代以來，人們把冷凍生物學(xué)（cryobiology）和植物離體培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來，發(fā)展了離體種質(zhì)資源冷凍保存（freezing conservation in vitro）或超低溫保存（cryopreservation）技術(shù)。 隨著離體種質(zhì)保存技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，已經(jīng)或正在建立離體保存庫(kù)。如國(guó)家種質(zhì)徐州甘薯試管苗庫(kù)保存甘薯1400份，國(guó)家種質(zhì)克山馬鈴薯試管苗庫(kù)保存馬鈴薯900份。,離體保存方法：常溫限制生長(zhǎng)保存、低溫保存和超低溫保存。,第一節(jié) 植物種質(zhì)資源的常溫限制生長(zhǎng)保存,一、常溫限制生長(zhǎng)保存的概念 在正常條件下的組織培養(yǎng)不適合種質(zhì)保存。因?yàn)樵谶@種

6、條件下，材料生長(zhǎng)很快，需經(jīng)常進(jìn)行轉(zhuǎn)接。不僅使保存工作量加大費(fèi)用升高，也導(dǎo)致在轉(zhuǎn)接中污染和由取樣的隨機(jī)性造成基因資源的丟失。 因此，理想的保存方法是使培養(yǎng)物處于無(wú)生長(zhǎng)或緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)下抑制植物的生長(zhǎng)，減少繼代次數(shù)，達(dá)到長(zhǎng)期保存目的。需要時(shí)可以迅速恢復(fù)正常生長(zhǎng)。抑制生長(zhǎng)的外植體可以是莖段、莖尖及愈傷組織。,二、常溫限制生長(zhǎng)保存的方法和原理,（一）高滲保存法 高滲保存法是指通過提高培養(yǎng)基的滲透壓，減少離體培養(yǎng)物從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分和水分的量，減緩生理代謝過程，從而減緩生長(zhǎng)速度，達(dá)到抑制培養(yǎng)物生長(zhǎng)的保存方法。（繼代培養(yǎng)間隔時(shí)間可延長(zhǎng)到1年） 方法：1）提高蔗糖濃度：10%左右，就可達(dá)到抑制培養(yǎng)物生長(zhǎng)的目的

7、。由于蔗糖是組培中最常用的碳源和能源，提高滲透壓的同時(shí)又對(duì)材料生理代謝產(chǎn)生不利的影響。 2）添加惰性物質(zhì)：如甘露醇、山梨醇等都是優(yōu)良的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，這樣可以使其限制離體培養(yǎng)物生長(zhǎng)的作用維持更久。一般用4%6%甘露醇處理培養(yǎng)基，或用2%3%蔗糖加2%5%的甘露醇混合處理。 3）增加培養(yǎng)基中瓊脂的用量來提高滲透壓，降低培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率。,常溫限制生長(zhǎng)保存的方法有：提高滲透壓、添加生長(zhǎng)延緩劑或抑制劑、干燥、降低氣壓、改變光照條件等。,二、常溫限制生長(zhǎng)保存的方法和原理,（二）生長(zhǎng)抑制劑保存法 在離體種質(zhì)保存中使用植物生長(zhǎng)抑制劑可以延緩或抑制離體培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)繼代時(shí)間以達(dá)到離體保存種質(zhì)的目的。 生

8、長(zhǎng)抑制劑保存法是指在培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)抑制劑或延緩劑如ABA、青鮮素、矮壯素（CCC）、B9、多效唑、烯效唑等。 如在培養(yǎng)基中加入510mg/L ABA，使馬鈴薯等茄屬植物的外植體繼代培養(yǎng)間隔期延至1年以上。李維等（1993）利用B9和CCC使葡萄試管苗繼代周期由3個(gè)月變?yōu)?年。多效唑可使小麥和馬鈴薯的繼代周期延長(zhǎng)，同時(shí)使試管苗粗壯、移栽成活率提高。,常溫限制生長(zhǎng)保存的方法有：提高滲透壓、添加生長(zhǎng)延緩劑或抑制劑、干燥、降低氣壓、改變光照條件等。,（三）常溫限制生長(zhǎng)的其他保存法 1低壓保存法 通過降低培養(yǎng)容器內(nèi)氧分壓或改變培養(yǎng)環(huán)境的氣體狀況，能抑制離體培養(yǎng)物細(xì)胞的生理活性，延緩衰老，從而達(dá)到離體保

9、存種質(zhì)的目的。 低壓保存方法：降低氣壓和降低氧分壓。 降低氣壓是通過降低培養(yǎng)物周圍的大氣壓而起作用，其結(jié)果是降低了所有氣體分壓，使培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度降低。 降低氧分壓是在正常氣壓下，向培養(yǎng)容器中加進(jìn)氮?dú)獾榷栊詺怏w，使其中氧分壓降低到較低水平，從而達(dá)到抑制生長(zhǎng)的目的。 20世紀(jì)80年代，Bridgin等在煙草離體莖尖和愈傷組織保存時(shí)采用了此方法，把培養(yǎng)容器內(nèi)可利用的氧氣降低到60%，6周內(nèi)培養(yǎng)物生長(zhǎng)量減少了60%80%。,（三）常溫限制生長(zhǎng)的其他保存法 2饑餓法 即從培養(yǎng)基中減去某種或幾種營(yíng)養(yǎng)元素，或者降低某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，或者略微改變培養(yǎng)基成分，使培養(yǎng)植株處于最小生長(zhǎng)階段。 通過調(diào)整培養(yǎng)基的養(yǎng)

10、分水平（l/2MS、l/4MS），可有效地限制細(xì)胞生長(zhǎng)。如菠蘿組培苗在l/4MS培養(yǎng)基上保存1年，小苗存活率達(dá)到100%。,第二節(jié) 植物種質(zhì)資源的低溫保存,一、低溫保存的概念 植物種質(zhì)資源的低溫保存(low temperature conservation)是指用離體培養(yǎng)的方式在非凍結(jié)程度的低溫下（一般為19）保存種質(zhì)的方法。低溫保存種質(zhì)資源具有方法簡(jiǎn)單、存活率高的特點(diǎn)。 二、低溫保存的原理 在植物的生長(zhǎng)條件中，溫度是一個(gè)重要的因素。植物要生長(zhǎng)必需有適宜的溫度，溫度降低以后，植物的生長(zhǎng)速度就會(huì)受到抑制而減慢，老化程度延緩，因而延長(zhǎng)了繼代的時(shí)間間隔而達(dá)到保存種質(zhì)的目的。,三、低溫保存的方法,植物

11、對(duì)低溫的耐受力不僅取決于基因型，也與它們的起源和生長(zhǎng)的生態(tài)條件有關(guān)。在低溫保存植物培養(yǎng)物過程中，正確選擇適宜低溫是保存后高存活率的關(guān)鍵。 溫帶植物保存的最適低溫在06，如馬鈴薯、蘋果、草莓及大多數(shù)草本植物。 熱帶植物保存的最適低溫為1520。如木薯、甘薯。 葡萄植株在9條件下，每年轉(zhuǎn)換一次新鮮培養(yǎng)基，可以保存15年之久，而常溫條件下需要13個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。 Galay(1969)在2m2實(shí)驗(yàn)室面積上保存800個(gè)葡萄品種，而在田間需1公頃土地。草莓在低溫下保存72個(gè)月，存活率達(dá)100%。,第三節(jié) 植物種質(zhì)資源的超低溫保存,一、種質(zhì)資源超低溫保存概述 植物超低溫種質(zhì)保存是指將植物的離體材料經(jīng)過一定的

12、方法處理后在超低溫（一般是指液氮溫度，196）條件下進(jìn)行保存的方法。 超低溫下保存材料的細(xì)胞物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，這不僅能夠保持生物材料的遺傳穩(wěn)定性，也不會(huì)喪失其形態(tài)發(fā)生的潛能（保持其再生能力），已成為長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源及珍貴實(shí)驗(yàn)材料的一個(gè)重要方法。,迄今為止，已對(duì)100多種植物材料進(jìn)行了超低溫保存，涉及保存的材料有原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、體細(xì)胞胚、胚、花粉、莖尖（根尖）分生組織、芽、莖段和種子等。 植物離體材料的超低溫保存是長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源的理想方法。組織培養(yǎng)物的超低溫保存可以節(jié)約大量的人力、物力和土地，克服長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)導(dǎo)致的再生能力喪失，也便于國(guó)際間種質(zhì)資源的交流。

13、,二、種質(zhì)資源超低溫保存的原理,在液氮中植物細(xì)胞與組織的代謝活動(dòng)停止、不發(fā)生遺傳變異；當(dāng)解凍后，細(xì)胞重新恢復(fù)生長(zhǎng)能力。,三、超低溫保存的基本程序 基本程序包括：植物材料（培養(yǎng)物）的選取、材料的預(yù)處理、冷凍處理、冷凍貯存、解凍處理、細(xì)胞活力和變異評(píng)價(jià)、再培養(yǎng)等。其中最重要的環(huán)節(jié)是冷凍和解凍處理。,（一）超低溫保存材料的選取,在超低溫離體保存種質(zhì)中，已經(jīng)研究或應(yīng)用過的植物材料或培養(yǎng)物主要有三類：愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體；花粉和花粉胚；莖尖、腋芽原基、胚、幼齡植物。 超低溫保存離體種質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用中，需考慮培養(yǎng)物的再生能力、變異性和抗凍性。選擇遺傳穩(wěn)定性好、容易再生和抗凍性強(qiáng)的離體培養(yǎng)物作為保存材

14、料是超低溫保存離體種質(zhì)成功的關(guān)鍵。 莖尖、腋芽原基、胚、幼齡植株等有組織結(jié)構(gòu)的離體材料，是理想的離體保存材料因?yàn)槠溥z傳穩(wěn)定性好，易于再生，且細(xì)胞體積小，液泡小，原生質(zhì)稠密、含水量較低，細(xì)胞質(zhì)較濃，比含有大液泡的愈傷組織細(xì)胞更抗凍。,（二）材料預(yù)處理,目的：使材料適應(yīng)將要遇到的低溫，提高自由水含量低的新細(xì)胞的生成，避免冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)大的冰晶的形成，提高細(xì)胞的成活率和再生能力。 方法：對(duì)超低溫保存的離體培養(yǎng)物進(jìn)行加速繼代、提高培養(yǎng)基滲透壓、加入冷凍防護(hù)劑和低溫預(yù)處理。 預(yù)處理時(shí)間：一般為34周。 1加速繼代 加速繼代培養(yǎng)以提高新分裂細(xì)胞的比例。因?yàn)樾路至训募?xì)胞小，胞內(nèi)自由水含量少，在冷凍過程中細(xì)

15、胞內(nèi)不易形成大冰晶，細(xì)胞不易受害。 2提高培養(yǎng)基滲透壓 用甘露醇、山梨醇和蔗糖等提高培養(yǎng)基滲透壓，以提高培養(yǎng)組織和細(xì)胞的滲透壓來提高抗寒力。如在含8%蔗糖的改良MS液體培養(yǎng)基振蕩預(yù)培養(yǎng)6d，紅豆杉愈傷組織在超低溫保存后細(xì)胞活力可保持最高。,3添加冷凍防護(hù)劑 冷凍防護(hù)劑在溶液中能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的水合作用，提高溶液的黏滯性，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免遭凍害。用冷凍防護(hù)劑對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理可明顯提高細(xì)胞的存活率和再生能力。 常用的冷凍防護(hù)劑：5-8% 二甲基亞砜（DMSO)、甘油、10%脯氨酸。糖類、PEG、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。 DMSO是最好的防護(hù)劑。 有時(shí)常把幾種冷凍防護(hù)劑混合使用，降低冷凍防護(hù)劑的毒性，

16、提高細(xì)胞存活率和再生能力。,（二）材料預(yù)處理,4低溫預(yù)處理 低溫預(yù)處理是將離體培養(yǎng)物置于一定的低溫環(huán)境中（04），使其接受低溫鍛煉，細(xì)胞內(nèi)可溶性糖及其類似的具有低溫保護(hù)功能的物質(zhì)積累，束縛水/自由水比值增大，原生質(zhì)的黏度、彈性增大，代謝活動(dòng)減弱，提高其抗寒能力。 如蘋果離體根尖的超低溫保存，要保存的離體根尖應(yīng)先在4下鍛煉45周。有的植物可以逐漸降溫培養(yǎng)，使超低溫保存成活率大大提高。旺盛分裂的細(xì)胞和經(jīng)過冬季鍛煉的植物組織都具有較強(qiáng)的抗寒能力，如早期胚胎和冬眠芽。,（二）材料預(yù)處理,（三）降溫冷凍及超低溫保存,1傳統(tǒng)的降溫冷凍方法 傳統(tǒng)的超低溫冷凍保存方法是通過預(yù)培養(yǎng)、冷凍保護(hù)劑處理、降溫速度和轉(zhuǎn)

17、移溫度等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，創(chuàng)造合適的保護(hù)性脫水程度，實(shí)現(xiàn)超低溫保存種質(zhì)資源。 從降溫方式來看，超低溫冷凍保存方法有快速冷凍法、慢速冷凍法、兩步冷凍法和逐級(jí)冷凍法等幾種。,1傳統(tǒng)的降溫冷凍方法,（1）快速冷凍法：將保存材料從0或其它預(yù)培養(yǎng)溫度直接投入液氮中保存。其降溫速度在1000/min以上。 適于材料：高度脫水的植物材料（如種子、花粉、球莖或塊根等）、經(jīng)過冬季的低溫鍛煉抗寒性較強(qiáng)的木本植物的枝條和芽。 原理：細(xì)胞內(nèi)的水分在降溫冷凍過程中，14010是冰晶形成和增長(zhǎng)的危險(xiǎn)溫度區(qū)，在140以下，冰晶不再增長(zhǎng)，快速冷凍法就是利用了在液氮中溫度驟然降低到最低點(diǎn)（196），使細(xì)胞內(nèi)水分迅速通過冰晶生成的危險(xiǎn)溫

18、度區(qū)，產(chǎn)生的玻璃化狀態(tài)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生破壞作用，從而減輕或避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰所造成的危害。,1傳統(tǒng)的降溫冷凍方法,（2）慢速冷凍法：在冷凍保護(hù)劑存在下，以0.110/min降溫速度從0降到70，接著浸入液氮中進(jìn)行冷凍保存。 這樣可以使細(xì)胞內(nèi)的水分有充足的時(shí)間流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而使細(xì)胞內(nèi)的水分減少到最低限度，避免細(xì)胞內(nèi)形成冰晶；同時(shí)又能防止因溶質(zhì)含量增加引起的“溶液效應(yīng)”的毒害。 適合材料：大多數(shù)植物離體種質(zhì)的保存，即使是體積較大、液泡大、含水量較高的植物材料，也可以用此法保存得到較好的保存效果。慢速冷凍法需要配備程序降溫器，技術(shù)系統(tǒng)昂貴。,1傳統(tǒng)的降溫冷凍方法,（3）兩步冷凍法：慢速冷凍和快速冷凍

19、結(jié)合起來的一種冰凍方法。在冷凍保護(hù)劑存在下，先用慢速冷凍法（降溫速度0.14/min）降到轉(zhuǎn)移溫度（一般為7040），在此溫度下平衡0.52 h，使細(xì)胞達(dá)到保護(hù)性脫水狀態(tài)；然后投入液氮中迅速冷凍。目前，大多采用0.54/min的降溫速度降到40，然后投入液氮保存。Brison等（1995）用兩步法保存兩個(gè)桃砧木品種離體培養(yǎng)的莖尖，再生率達(dá)到69%和74%。 （4）逐級(jí)冷凍法：材料經(jīng)保護(hù)劑在0預(yù)處理后，依次經(jīng)過10、15、23、40、70等溫度處理，在每級(jí)溫度上停留一定時(shí)間（約5min），然后浸入液氮。 甘蔗愈傷組織在0的冷凍防護(hù)劑（10%DMSO0.5mol/L山梨醇）中預(yù)處理3040min，

20、接著以1/min的降溫速度從0降到40，停留13h，投入液氮中保存，半年后仍可再生大量植株。,2玻璃化保存法,液體固化方式：形成尖銳的冰晶；進(jìn)入無(wú)定形的非晶體（玻璃化）狀態(tài)。 玻璃化（vitrification）是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w（玻璃態(tài)）的固化過程。 玻璃化法超低溫保存種質(zhì)資源就是將生物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護(hù)劑處理使其快速脫水后直接投入液氮，使生物材料和玻璃化保護(hù)劑發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。此間水分子沒有發(fā)生重排，不形成冰晶，也不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積的變化，因而不會(huì)由于細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰造成機(jī)械損傷或溶液效應(yīng)而傷害組織和細(xì)胞，保證快速化凍后細(xì)胞仍有活力。 特點(diǎn)：與傳統(tǒng)的超低溫保存方法相比，玻璃化法

21、操作簡(jiǎn)單、重演性好，避免了一些種質(zhì)的冷敏感問題，并且在復(fù)雜的組織和器官的超低溫保存方面有較好的應(yīng)用潛力，因而是一種較理想的超低溫保存方法。但由于PVS（plant vitrification solution）保護(hù)劑濃度很高，對(duì)材料毒害性極大，因此需嚴(yán)格控制脫水過程及冰凍保護(hù)劑的滲透性。,3包埋脫水法超低溫保存,包埋脫水法（encapsulation-dehydration method）是將包含有樣品的褐藻酸鈉溶液滴向高鈣溶液，因褐藻酸鈣的生成而固化成球狀顆粒，然后將包埋后含有保存材料的藻酸鈣小珠在含有高濃度蔗糖的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，使樣品獲得高的抗凍力和抗脫水力后，結(jié)合適當(dāng)?shù)拿撍徒禍胤绞剑?/p>

22、后浸入液氮中保存。 特點(diǎn)：與玻璃化法相比，包埋脫水法采用高濃度的蔗糖預(yù)處理樣品，對(duì)低溫保護(hù)劑敏感的植物樣品有著很大的應(yīng)用潛力。包埋脫水法也不需要昂貴、復(fù)雜的降溫設(shè)備，降溫過程不甚嚴(yán)格；同時(shí)避免了玻璃化中二甲基亞砜等高濃度保護(hù)劑對(duì)材料可能造成的損害；樣品易于操作，被保存樣品體積可以比較大；樣品可獲得較高的抗凍力，使保存后的樣品不經(jīng)愈傷組織直接成苗，降低了遺傳變異的可能。,4包埋玻璃化法超低溫保存,包埋玻璃化法(encapsulation-vitrification method)是包埋脫水法與玻璃化法的結(jié)合，克服了玻璃化法和包埋脫水法的缺點(diǎn)。 基本操作程序：預(yù)培養(yǎng)和包埋玻璃化溶液脫水液氮保存化凍

23、恢復(fù)培養(yǎng)。,5其它保存方法,（1）干燥法：干燥法是利用無(wú)菌空氣流、真空、干燥硅膠飽和溶液表面的氣相等對(duì)樣品進(jìn)行脫水，然后快速將樣品投入液氮凍存。 （2）預(yù)培養(yǎng)法：預(yù)培養(yǎng)法是將保存材料在含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，以誘導(dǎo)脫水，然后將脫水材料浸入液氮進(jìn)行保存。該方法主要用于合子胚和頂端分生組織的保存。 （3）預(yù)培養(yǎng)干燥法：此方法是預(yù)培養(yǎng)法和干燥法結(jié)合的冷凍保存方法。材料先在含冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，并進(jìn)行干燥，然后浸入液氮保存。有些研究者用高濃度鹽溶液和壓縮空氣流處理，使要保存的材料脫水干燥。,（四）解凍,解凍是將液氮中保存的材料取出，使其融化，以便進(jìn)一步恢復(fù)培養(yǎng)。解凍的速度是解凍

24、技術(shù)的關(guān)鍵，可分為快速解凍和慢速解凍兩種方法。超低溫冷凍材料解凍時(shí)，再次結(jié)冰的危險(xiǎn)區(qū)域是6050。從理論上講，可借助迅速的解凍速度通過此溫度區(qū)，從而避免細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰。 1快速解凍法：快速解凍法是把冷凍的材料取出后，迅速放入3540（該溫度下解凍速度一般為500700/min）溫水浴中解凍，并小心搖動(dòng)，待材料中的冰晶完全融化為止。 由于此法融冰的速度快，細(xì)胞內(nèi)的水分來不及再次形成冰晶就已完全融化，因而對(duì)細(xì)胞的損傷較輕。,2慢速解凍法：把材料置于0或23的低溫下慢慢融化。少數(shù)超低溫保存的材料只有采用慢速解凍才能存活，如木本植物的冬眠芽，因其在慢速冷凍的過程中，經(jīng)受了一個(gè)低溫鍛煉過程，細(xì)胞內(nèi)的水分

25、已最大限度地滲透到細(xì)胞外，若解凍速度太快，細(xì)胞吸水過猛，細(xì)胞膜就會(huì)受到強(qiáng)烈的滲透沖擊而破裂，進(jìn)而導(dǎo)致材料死亡。,（四）解凍,解凍時(shí)應(yīng)注意問題,選擇快速解凍還是慢速解凍，不僅與材料的特性有關(guān)，也與材料原來冷凍速度有關(guān)。一般來說： 冷凍速度超過15/min，解凍時(shí)宜采用快速解凍，否則應(yīng)采用慢速解凍。 液泡小和含水量少的細(xì)胞（如莖尖分生組織）可采用快速解凍方式，而對(duì)于液泡大和含水量高的細(xì)胞，脫水處理后的干凍材料以及木本植物的冬眠芽則宜用慢速解凍法。 試管中的冰一旦溶解，就應(yīng)該將試管轉(zhuǎn)移到20水浴中，并盡快洗滌和再培養(yǎng)，以免造成再傷害。 樣品在凍存前如果加入了冷凍保護(hù)劑，解凍后一般要洗滌若干次，盡量清

26、除材料表面和組織內(nèi)部的冷凍保護(hù)劑，以減少其毒害作用。 最常用的洗滌方法是用含1.2mol/L蔗糖溶液的培養(yǎng)基洗滌1020min（25），也可用含1.52.0mol/L山梨醇的培養(yǎng)液洗滌。 而有些材料洗滌后反而存活率降低，如對(duì)解凍后的玉米細(xì)胞重新培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不清除保護(hù)劑比清除的存活率高。其原因可能是在沖洗時(shí)，細(xì)胞在冷凍過程中滲漏出來的某些重要活性物質(zhì)也被沖洗掉了。,（五）再培養(yǎng),由于冷凍與解凍的傷害，凍后細(xì)胞在生理與結(jié)構(gòu)上都不同于未冷凍的細(xì)胞，因此適于兩種細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基成分是不同的。 為提高再培養(yǎng)時(shí)的存活率，對(duì)冷凍保存后的材料重新培養(yǎng)時(shí)，需要一些特殊的條件。例如： 為了減少再培養(yǎng)中的光抑制，利

27、于離體材料恢復(fù)生長(zhǎng)，凍存的材料解凍洗滌后一般先在黑暗或弱光下培養(yǎng)12周，再轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)。 再培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基一般是與保存前的相同，但有時(shí)需將大量元素或瓊脂含量減半，有時(shí)則在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白、赤霉素和活性炭等成分以利于恢復(fù)生長(zhǎng)。,（六）超低溫保存后細(xì)胞或組織活力檢測(cè),超低溫保存植物種質(zhì)資源，其目的是要長(zhǎng)期保持植物具有高的活力、存活率以及遺傳穩(wěn)定性，能通過繁殖將其遺傳特性傳遞下去。因此，對(duì)冷凍保存后細(xì)胞活力、存活率以及遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)是非常重要的。 細(xì)胞活力的檢測(cè)一般采用TTC還原法、FDA染色法、伊凡藍(lán)染色法等。由于染色法是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的化合物反應(yīng)表現(xiàn)出的顏色變化來測(cè)定酶的活性，從而檢測(cè)細(xì)胞的活力，因此，不能全面反映細(xì)胞重新生長(zhǎng)狀況及其保存效果。細(xì)胞的再生長(zhǎng)才是最終檢驗(yàn)細(xì)胞活力的唯一可靠方法。存活率是檢測(cè)保存效果的最常用的指標(biāo)。 目前對(duì)超低溫保存材料的遺傳變異情況的檢測(cè)方法很多: 形態(tài)學(xué)觀察是最簡(jiǎn)便、最直觀的方法； 細(xì)胞學(xué)則可通過核型分析或原位雜交