1、第五章細(xì)胞球培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)(plant cell culture )是在離體條件下培養(yǎng)植物的個(gè)別細(xì)胞球或小的細(xì)胞球塊使之增殖的技術(shù)，根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模進(jìn)行了：小規(guī)模培養(yǎng)和大量培養(yǎng)的培養(yǎng)方式：的懸浮培養(yǎng)、單細(xì)胞球培養(yǎng)等根據(jù)需要生成物：進(jìn)行了變異誘導(dǎo)的細(xì)胞球培養(yǎng)和二次生產(chǎn)1 .單細(xì)胞球分離2 .懸浮培養(yǎng)3 .單細(xì)胞球培養(yǎng)技術(shù)4 .植物細(xì)胞球的大規(guī)模培養(yǎng)和次生產(chǎn)物生產(chǎn)1 .單細(xì)胞球分離從完整的植物器官分離培養(yǎng)組織中分離單細(xì)胞球1 .從完整的植物器官中分離單細(xì)胞球葉是分離單細(xì)胞的最佳材料機(jī)械法酶解法1-1、機(jī)械法第一、1-2、酶解法、 Takebe等人(1968 )發(fā)現(xiàn)，通過果膠酶處理可分離大量的葉肉細(xì)胞

2、，2、可從培養(yǎng)組織中分離出單細(xì)胞球、莖，步驟： (1)愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生，(2)愈傷組織反復(fù)傳代，使組織增殖，提高愈傷組織的稀疏度，搖床用于振動(dòng)，(3) (Suspension culture )用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)愈傷組織，選擇建立懸浮培養(yǎng)物、15ml medium/1g、120rpm culture、transfer1tiiii的合適的培養(yǎng)基：高濃度荷爾蒙激素濃度，特別是生長(zhǎng)素、水解作用干酪素、Pro、Gln等必要的加成物質(zhì)。 世代重疊，得到均勻稀疏的愈傷組織。 二、細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)、一、細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)的概念和意義懸浮培養(yǎng)是將單個(gè)游離細(xì)胞球或小細(xì)胞球塊懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖的技術(shù)。、Shak

3、er for suspension culture，Culture wheel，1、細(xì)胞球可不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞球群，適合大規(guī)模培養(yǎng)。 2 .可以提供大量比較均勻的細(xì)胞球，為研究細(xì)胞球的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。 細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用，三.細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)的方法1，對(duì)于用培養(yǎng)基愈傷組織調(diào)制的懸浮細(xì)胞球培養(yǎng)的培養(yǎng)基，優(yōu)選用原愈傷組織傳代時(shí)的培養(yǎng)基除去瓊脂。 為了提高細(xì)胞球的分散度，需要調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素與分裂素的比率。 2、培養(yǎng)細(xì)胞球的起始密度和細(xì)胞球數(shù)(1)最低有效密度的概念懸浮細(xì)胞球培養(yǎng)中，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞球能夠增殖的最小接種量稱為最低有效密度或臨界起始密度。 最低有效密度因培養(yǎng)材料、原種培養(yǎng)條件、

4、原種保存時(shí)間長(zhǎng)度、培養(yǎng)基成分而異，但一般為104105細(xì)胞球/ml，(2)細(xì)胞球計(jì)數(shù)可保證細(xì)胞球培養(yǎng)的最低有效密度，計(jì)數(shù)細(xì)胞球游離后分離的單細(xì)胞球，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。 (3)生細(xì)胞球測(cè)定除了測(cè)定細(xì)胞球密度外，以生細(xì)胞球率為測(cè)定開始密度的參考生細(xì)胞球率(%)=(5視野中的生細(xì)胞球數(shù)/5視野中的細(xì)胞球總數(shù)) *100%，生細(xì)胞球的測(cè)定方法a、冰乙酸酯熒光素(FDA )染色法FDA本身沒有熒光，無極性，可通過原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)入后，由于受到活的細(xì)胞球內(nèi)脂肪酶分解，產(chǎn)生熒光的極性物質(zhì)螢光素，不能自由進(jìn)入原生質(zhì)體膜，在落射熒光顯微鏡下觀察熒光有活力，相反沒有活力。 具體操作：取0.5ml細(xì)胞球混懸劑

5、裝入小試管，加入FDA溶液使最后濃度達(dá)到0.01%，混合，在室溫下作用5min，用落射熒光顯微鏡觀察。b、酚藏紅花染色法先配制0.1%酚藏紅花溶液，溶劑為培養(yǎng)液。 檢查時(shí)取一滴漂浮的細(xì)胞球放在載玻片上，滴下0.1%酚紅花黃，蓋上玻璃罩，染成紅色的是死亡的細(xì)胞球，無色的是活著的細(xì)胞球。3、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞球數(shù)增殖變化、細(xì)胞球生長(zhǎng)各時(shí)期特征：延遲(延遲) :細(xì)胞球分裂少，其長(zhǎng)度與接種量大小和傳代原種細(xì)胞球所處的生長(zhǎng)期有關(guān)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞球數(shù)增加， 生長(zhǎng)速率不變的直線成長(zhǎng)期：細(xì)胞球生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期的晚時(shí)期培養(yǎng)液的消耗用盡，有毒代謝物質(zhì)增多，缺氧平穩(wěn)期：的生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞球

6、數(shù)的增加極少，開始死亡。 A，延遲的長(zhǎng)度主要取決于傳代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞球所處的成長(zhǎng)期和輸入細(xì)胞球數(shù)的多寡。 b .加入條件培養(yǎng)基可以縮短延遲期。 條件培養(yǎng)基：培養(yǎng)有會(huì)兒組織或細(xì)胞球的培養(yǎng)基。 如果縮短c.2次的中繼時(shí)間間隔，則能夠始終將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞球保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 d .平穩(wěn)期的細(xì)胞球混懸劑保留時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)引起細(xì)胞球的大量死亡和解體。 操作注意事項(xiàng)：繼承懸浮培養(yǎng)細(xì)胞球時(shí)，入液口孔徑小，僅使用單細(xì)胞球或小細(xì)胞球塊(2- 4細(xì)胞球)，使用吸管或注射器。 傳代前，培養(yǎng)容器靜置短時(shí)間，大細(xì)胞球團(tuán)沉降，吸收上層混懸劑。 由此，能夠多次制作良好的細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)物。 4、細(xì)胞球生長(zhǎng)測(cè)定應(yīng)對(duì)如何建立的細(xì)胞

7、球懸浮體系進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定，掌握其生長(zhǎng)的基本規(guī)律，為繼代培養(yǎng)或其他研究提供依據(jù)。 a .細(xì)胞球計(jì)數(shù)注意：由于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞球不呈游離單細(xì)胞球，用培養(yǎng)瓶直接取樣很難進(jìn)行可靠的細(xì)胞球計(jì)數(shù)。 用5%8%鉻酸或0.25%果膠酶處理細(xì)胞球塊的生長(zhǎng)速度pP=(lnx-lnX0)/tX以t時(shí)間的細(xì)胞球密度、X0以開始細(xì)胞球密度、b、細(xì)胞球尺寸的測(cè)定技術(shù)(使用螺旋測(cè)微器) c、細(xì)胞球體積：即培養(yǎng)液每毫升細(xì)胞體積的毫升數(shù)表示。 d .細(xì)胞球的干燥重量和鮮重。 在預(yù)先稱量的尼龍布中加入一定量的細(xì)胞球混懸劑，用水沖洗，除去附著在細(xì)胞球上的多馀水滴，然后稱量，兩者的差就是細(xì)胞球的鮮重。 一般來說，干燥重量是將離心收集的細(xì)

8、胞球移至預(yù)先稱量的濾紙片中，然后在60下烘烤12h，再用干燥機(jī)蒸發(fā)制冷來稱量。 細(xì)胞球的干燥重量和鮮重一般用每毫升的懸浮培養(yǎng)物的重量表示。 e、有絲分裂指數(shù)在一個(gè)細(xì)胞球群中，將有絲分裂的細(xì)胞球占總細(xì)胞球的百分率稱為有絲分裂指數(shù)，指數(shù)越高分裂進(jìn)行得越快。 一般采用美孚根染色法，先將組織用1molHCl水解作用60后染色，常規(guī)鏡檢，修正500個(gè)細(xì)胞球，經(jīng)修正計(jì)算。 5、一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞球培養(yǎng)系統(tǒng)必須滿足三個(gè)條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞球塊小，一般在3050個(gè)細(xì)胞球以下，實(shí)際培養(yǎng)中由單細(xì)胞球構(gòu)成的植物細(xì)胞球懸浮系很少。 均勻性好，細(xì)胞球形狀和細(xì)胞球塊大小大致相同。 懸浮系外觀為大小均勻的小粒子

9、，培養(yǎng)基呈清澈透明，細(xì)胞球顏色呈鮮艷乳白或鵝黃色。 細(xì)胞球生長(zhǎng)迅速，浮游細(xì)胞球的生長(zhǎng)量通常在23天以下達(dá)到2倍。 影響懸浮細(xì)胞球生長(zhǎng)的因素：起始愈傷組織質(zhì)量：稀疏度好，增殖快，再生能力強(qiáng)。 其外觀呈顏色鮮艷乳白或鵝黃色，細(xì)顆粒狀，疏而易破碎。 接種細(xì)胞球密度：接種初期的細(xì)胞球密度過低時(shí)，延遲時(shí)間容易變長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞球的起始密度通常為0.52.5105個(gè)細(xì)胞球/毫升，低于此密度時(shí)，細(xì)胞球的生長(zhǎng)變慢。 培養(yǎng)條件：方式、溫度、傳代周期、四、懸浮細(xì)胞球的同步化細(xì)胞球同步化是指同一懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的所有細(xì)胞球都經(jīng)過細(xì)胞周期在云同步上的某一特定時(shí)期。在同一培養(yǎng)系統(tǒng)中，由于細(xì)胞球的不同步驟使懸浮細(xì)胞球的分裂、代謝

10、及大姨媽、生化狀態(tài)等更加復(fù)雜，人們希望通過一定的技術(shù)途徑，使同一培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞球保持相對(duì)一致的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)狀態(tài)，工作中常用的處理方法： 1、物理方法1 ) 篩選法是根據(jù)細(xì)胞球的體積大小進(jìn)行篩選，直接篩選相同周期的細(xì)胞球，F(xiàn)ujimura分離胡蘿卜混懸劑47m膜過濾液31 m薄膜過濾收集10%ficoll添加等體積的培養(yǎng)基網(wǎng)上細(xì)胞球180g離心5min收集各細(xì)胞球?qū)由霞尤氲募?xì)胞球，用培養(yǎng)基清洗分別接種、2 )冷處理法。 低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞球同步化的程度2，化學(xué)方法1 )在饑餓法懸浮培養(yǎng)細(xì)胞球中，切斷細(xì)胞分裂所需要的營養(yǎng)成分和荷爾蒙激素的供給，細(xì)胞球就會(huì)停滯于G1或G2期，經(jīng)過一定

11、時(shí)間的饑餓后，在培養(yǎng)基上再次加入該限制因子，靜止細(xì)胞球就會(huì)分裂為云同步。 2 )若阻化劑法在一些DNA合成阻化劑中處理細(xì)胞球，在DNA合成前期保留細(xì)胞球，解除抑制，則可得到相同細(xì)胞周期中的細(xì)胞球。 常用的阻化劑有5 -氟脫氧尿核苷、5 -氨基尿核苷、羥基尿核苷等。 3 )有絲分裂抑制秋水仙堿處理指數(shù)生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物，濃度一般為0.2%，處理時(shí)間以4-6小時(shí)為宜，任何細(xì)胞球的同步處理，細(xì)胞球本身都有一定的傷害。 處理的細(xì)胞球缺乏一盞茶的生活力，不僅不能得到理想的同步效果，而且可能導(dǎo)致細(xì)胞球大量死亡，因此在進(jìn)行同步處理之前，細(xì)胞球必須進(jìn)行一盞茶的活化培養(yǎng)。 用于處理的細(xì)胞系最好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 3

12、、單細(xì)胞球培養(yǎng)技術(shù)1、植物單細(xì)胞球培養(yǎng)的意義1、單細(xì)胞球無性系懸浮培養(yǎng)細(xì)胞球間的細(xì)胞球間存在遺傳、大姨媽和生化差異，這些個(gè)的差異反映在它們的產(chǎn)量、質(zhì)量、抗病蟲害性和抗性等方面。 如果能篩選出高抵抗、高產(chǎn)、高質(zhì)量的細(xì)胞球股票，一定能帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效果。 2、排除體細(xì)胞球干擾作用3、有利于細(xì)胞球活動(dòng)跟蹤觀察2、單細(xì)胞球培養(yǎng)方法1、細(xì)胞球平板培養(yǎng)概念：制備的單細(xì)胞球混懸劑按一定細(xì)胞密度，接種1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 被稱為平板培養(yǎng)的主要技術(shù)要點(diǎn)：分離單細(xì)胞球：一般采用酶催化劑分離法，制備小細(xì)胞球塊單細(xì)胞球混懸劑：分離的單細(xì)胞球在培養(yǎng)基上洗滌2次后，將密度調(diào)整至5105/ml，植板：將1份

13、密度調(diào)整后的單細(xì)胞球懸濁液和4份35的固體培養(yǎng)基充分混合均勻后，均勻鋪設(shè)，放入培養(yǎng)皿栽培后的培養(yǎng)基完全凝固后，用殘奧翅片或殘奧膜封口膜密封培養(yǎng)皿，防止污染，在25暗的條件下培養(yǎng)3周，可形成肉眼可見愈傷組織。 植板率的評(píng)價(jià)：用能夠形成細(xì)胞球塊的單細(xì)胞球在單細(xì)胞球接種中所占的比例來表示。 植板率()(形成的細(xì)胞球塊數(shù)/接種的細(xì)胞球數(shù)) 100修正公式中的每塊平板的新形成的細(xì)胞球塊數(shù)的修正方法有兩種：一種是直接修正法，在修正量時(shí)把握適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，即細(xì)胞球塊用肉眼可以識(shí)別，但不在一起時(shí)進(jìn)行留心。 二是感光法，在暗室紅光下將相片紙放置在想要校正數(shù)的培養(yǎng)皿下面，在其上面放置光源，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞球塊印刷到相

14、片紙上，沖洗攝影圖片校正數(shù)。 2、護(hù)理培養(yǎng)概念：一種在愈傷組織或植物離體組織中護(hù)理單細(xì)胞球使其生長(zhǎng)增殖的單細(xì)胞球培養(yǎng)方法。 3、微池培養(yǎng)的概念：在人造的中制備一個(gè)池，將單細(xì)胞球培養(yǎng)到池中少量的培養(yǎng)基中，使其分裂增殖形成細(xì)胞球塊的方法，稱為微池培養(yǎng)。特點(diǎn)： (1)顯微鏡下可追蹤單細(xì)胞分裂增殖形成細(xì)胞球塊的全過程；(2)培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH波動(dòng)幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞球只能短期分裂。 4、其他單細(xì)胞球培養(yǎng)技術(shù)對(duì)a飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞球經(jīng)放射性射線處理后，將飼養(yǎng)細(xì)胞球和培養(yǎng)細(xì)胞球混合種植板，照射的細(xì)胞球?qū)ε囵B(yǎng)細(xì)胞球發(fā)揮飼養(yǎng)作用。 b雙層濾紙植板培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層細(xì)胞球、護(hù)理濾紙層、轉(zhuǎn)

15、送盤濾紙、培養(yǎng)細(xì)胞球， 4 .植物細(xì)胞球大規(guī)模培養(yǎng)1 .概要2 .培養(yǎng)系統(tǒng)3 .植物細(xì)胞球規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)4 .提高細(xì)胞球次級(jí)代謝產(chǎn)物的途徑5 .細(xì)胞球規(guī)?；囵B(yǎng)的相關(guān)技術(shù)問題，introduction primarymetabolitesarecompoundsneededinthebasicprocession proteinsandlipids.secondarymetabolitesarecompoundsproducedinplantsthatarenotnecessaryfortheplantsbasicfunctions.somes eervice caldefense

16、againstmicrobesandanimals .type : secondarymetabolitesareusedinthepharmaceuticalinded as flavour ants and dyes，第二代消費(fèi)者指示符和指示符， 與性能.次級(jí)元件安全級(jí)別，卡片級(jí)別，標(biāo)準(zhǔn)組件。steroidal compounds。 李時(shí)珍(1593 )列入本草綱目的1892種藥物大部分是植物藥物，至今約有25種法定藥物來源于植物。 其藥物的有效成分均為副產(chǎn)物。 許多植物次級(jí)代謝產(chǎn)物是優(yōu)秀的食品添加劑和名貴化妝品原料。 部分是生物毒素的主要來源，可用于殺蟲、殺菌，但對(duì)環(huán)境和人畜無害，是理想

17、的環(huán)保產(chǎn)品。 例如從胡蘿卜、萬壽菊中提取色素從黃菊中提取揮發(fā)油類從梔子中提取果酸：果酸含有維生素c、檸檬酸等維生素。 主要作為食品的調(diào)味料使用，化妝行業(yè)用于制作護(hù)膚品和洗發(fā)露等，美容院作為換膚液使用。 3規(guī)模化細(xì)胞球培養(yǎng)為植物次生產(chǎn)品的理想途徑，保護(hù)生態(tài)環(huán)境提高生產(chǎn)效率發(fā)展新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，對(duì)植株和細(xì)胞球培養(yǎng)的紫草寧含量進(jìn)行比較，4、植物細(xì)胞培養(yǎng)特性1植物細(xì)胞球比微生物細(xì)胞球大得多，有細(xì)胞里肌肉細(xì)胞貼壁細(xì)胞球，抗扭， 抗剪斷力弱的2培養(yǎng)過程的生長(zhǎng)速度慢，容易被微生物污染，需要抗生素的3細(xì)胞球生長(zhǎng)中期及指數(shù)期容易凝聚成直徑350 jjm 1400 pm的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)難的4培養(yǎng)需要供氧，培養(yǎng)液的黏性系數(shù)大：由于有5集團(tuán)效應(yīng)的6細(xì)胞貼壁， 培養(yǎng)細(xì)胞球產(chǎn)物滯留在細(xì)胞球內(nèi)，產(chǎn)量低的7細(xì)胞球培養(yǎng)過