1、匯報(bào)人：XXX 2015-12-18,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),1,簡(jiǎn) 介,液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。 LC-MS除了可以分析氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）所不能分析的強(qiáng)極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：分析范圍廣、分離能力強(qiáng)、定性分析結(jié)果可靠、檢測(cè)限低、分析時(shí)間快、自動(dòng)化程度高,2,液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:,氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物

2、；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比。 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問(wèn)題：不揮發(fā)性化合物分析測(cè)定；極性化合物的分析測(cè)定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測(cè)定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測(cè)定；沒(méi)有商品化的譜庫(kù)可對(duì)比查詢，只能自己建庫(kù)或自己解析譜圖。,3,LC-MS由以下幾部分組成 數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng) 液相色譜 接口 質(zhì)量分析器 檢測(cè)接收器 （離子源 ） 真空系統(tǒng),4,真空系統(tǒng),5,質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過(guò)系統(tǒng)必須處于高真空狀態(tài)。若真空度過(guò)低，則會(huì)造成離子源燈絲損壞、本底增高、圖譜復(fù)雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問(wèn)題。 一般質(zhì)譜儀都采用機(jī)械泵預(yù)抽真空后，再

3、用高效率擴(kuò)散泵連續(xù)地運(yùn)行以保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采用分子泵可獲得更高的真空度。,離子源,6,離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。,1.質(zhì)譜檢測(cè)的是離子 2.離子源=接口,7,ESI是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的電離方式。它主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。流出液在高電場(chǎng)下形成帶電噴霧，在電場(chǎng)力作用下穿過(guò)氣簾；從而霧化、蒸發(fā)溶劑、阻止中性溶劑分子進(jìn)入后端檢測(cè)。,電噴霧電離（ESI）,8,ESI是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會(huì)在電離過(guò)程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強(qiáng)的有機(jī)化合物。 ESI的最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子。目前采用電噴霧電離，可以測(cè)量大分子量的蛋白質(zhì)。

4、,大氣壓化學(xué)電離源(APCI),9,APCI噴嘴的下游放置一個(gè)針狀放電電極，通過(guò)放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等離子，溶劑分子也會(huì)被電離，這些離子與分析物分子進(jìn)行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化。,10,電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較,電離機(jī)理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成MH+或M-H-離子。 樣品流速：APCI源可從0.2到2 mlmin；而電噴霧源允許流量相對(duì)較小,一般為0.2-1 mlmin. 斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解. 靈敏度：通常認(rèn)為電噴霧有利于分析

5、極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。 多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子,11,質(zhì)量分析器,12, 質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心, 質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開(kāi)并排列。, 不同類型的質(zhì)量分析器構(gòu)成不同類型的質(zhì)譜儀。, 不同類型的質(zhì)譜儀其功能，應(yīng)用范圍，原理， 實(shí)驗(yàn)方法均有所不同。,單聚焦磁場(chǎng)分析器,13,在一定的B、V下，不同m/z 的離子其R不同，由離子源產(chǎn)生的離子，經(jīng)過(guò)分析器后可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量分離。,離子進(jìn)入分析器后，由于磁場(chǎng)的作用，其運(yùn)動(dòng)軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運(yùn)動(dòng)。其運(yùn)動(dòng)軌道半徑R可由下式表示：,上式中， m -離

6、子質(zhì)量 Z -離子電荷量 V -離子加速電壓 B -磁感應(yīng)強(qiáng)度,14,單雙聚焦質(zhì)譜儀體積大； 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的發(fā)展及儀器小型化（臺(tái)式）需要 體積小的質(zhì)量分析器：,四極桿質(zhì)量分析器 飛行時(shí)間質(zhì)量分析器 離子阱質(zhì)量分析器,體積小，操作簡(jiǎn)單； 分辨率中等；,15,四極桿質(zhì)量分析器,四極桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)廉，體積小，易操作，掃描速度快，適合于GC-MS, LC-MS。,16,飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Time of Flight MS, TOF-MS）,TOF-MS的核心部分是一個(gè)無(wú)場(chǎng)的離子漂移管；,加速后的離子具有相同的動(dòng)能,m/z小的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度快，最先通過(guò)漂移管; m/z大的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速

7、度慢，最后通過(guò)漂移管。 適合于生物大分子，靈敏度高，掃描速度快，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分辨率隨m/z的增大而降低。,17, FT-MS的核心為分析室，分析室由三對(duì)平行的極 板構(gòu)成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋運(yùn)動(dòng)垂直于z軸， 在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸方 向垂直的兩極板上檢測(cè)信號(hào)。,(Fourier Transform ion cyclotron resonance Mass Spectrometer, FTICR-MS),傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀,離子阱質(zhì)量分析器,18,特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測(cè)器；,19,檢測(cè)系統(tǒng),質(zhì)

8、量分析器分離并加以聚焦的離子束， 按m/z的大小依次通過(guò)狹縫，到達(dá)收集器, 經(jīng)接收放大后被記錄。,20,質(zhì)譜儀的檢測(cè)主要使用電子倍增器，也有的使用光電倍增管。由倍增器出來(lái)的電信號(hào)被送入計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存，這些信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后可以得到色譜圖，質(zhì)譜圖及其它各種信息。,LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化,1.接口的選擇： ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)） APCI不適合可帶多個(gè)電荷的大分子，其優(yōu)勢(shì)在于弱極性或中等極性的小分子的分析。,21,2.正、負(fù)離子模式的選擇：,選擇的一般原則為： 正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸

9、或甲酸對(duì)樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時(shí)可優(yōu)先考慮使用正離子模式。 負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化。樣品中含有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個(gè)羥基時(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式。,22,3.流動(dòng)相的選擇,常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。 LCMS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。（鹽分太高會(huì)抑制離子源的信號(hào)和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸銨10一5 mm

10、ol/l。 送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。,23,4.流量和色譜柱的選擇,不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時(shí)要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lmlmin，建議使用200400ulmin APCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。 為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時(shí)UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時(shí)使用MRM的功能，所以不要求各組分沒(méi)有完全分離）。這對(duì)于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時(shí)間。,24,5.輔助氣體流量和溫度的選擇,霧化氣對(duì)流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級(jí)質(zhì)譜的產(chǎn)生。 操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20 左右即可。對(duì)熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。 選用干燥氣溫度和流量大小時(shí)還要考慮流動(dòng)相的組成，有機(jī)溶劑比例高時(shí)可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的。,25,具體應(yīng)用領(lǐng)域,醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析 生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖 環(huán)