1、肉毒毒素介紹,1,主要內(nèi)容,肉毒毒素介紹 歷史發(fā)展 結(jié)構(gòu) 作用機理 藥理 毒理 免疫原性 目前商用的肉毒素及保妥適的特點 保妥適配制注意事項,2,什么是肉毒毒素?(肉毒神經(jīng)毒素,肉毒桿菌神經(jīng)毒素，肉毒梭菌毒素 ),是肉毒梭菌( Clostridium botulinum)在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種細菌外毒素 一種厭氧菌，其孢子常規(guī)在土壤中，與產(chǎn)生破傷風毒素的細菌屬同一科 在合適的條件下（10oC，無氧，合適的酸度）孢子生長為梭菌 細菌繼續(xù)產(chǎn)生大量的孢子或自溶將毒素釋放出來 不同的菌株(如Hall株,Bean株)產(chǎn)生不同亞型的神經(jīng)毒素(分為 A、B、C、D、E、F、G等7個抗原型), 其中A型毒

2、力最強 是導致肉毒中毒(Botulism)的原因,3,生物制品的特定,沒有仿制品的概念 肉毒毒素是一類產(chǎn)品名，而非通用名 與疫苗接近 產(chǎn)品本身沒有專利，生產(chǎn)工藝專利 用單位（Unit）衡量，單位之間不能換算 很容易得到，很難提純，很難恒定,不可認為肉毒毒素是相同的 彼此不可換算,FDA 最新通告：,4,歷史和發(fā)展（1）,1920s,1944,1946,首次沉淀純化A型肉毒毒素（H.Sommer),Schantz 開始研究其特性和應用,Lammanna首次分離出A型肉毒素結(jié)晶,1820,1895,Justinus Kerner 推測“臘腸毒” 作用原理，并提出應用于治療的可能性,E Van Er

3、mengem 分離肉毒梭狀芽胞桿菌,5,歷史和發(fā)展（2）,1960s 1970s,1978,1984,Schantz 和Scott 繼續(xù)研究,Scott在猴子身上進行A型肉毒毒素治療斜視的試驗,Scott 獲得FDA批準在人身上進行試驗（眼瞼痙攣，半面肌痙攣）,1950s,1950s 1960s,V Brook 證實A型肉毒毒素阻斷乙酰膽堿釋放,純化過程優(yōu)化 (Duff and Schantz),MF Brint 用于治療眼瞼痙攣，半面肌痙攣 斜頸，喉部肌張力障礙，書寫痙攣等,6,歷史和發(fā)展（3）,1998,2006,2009,FDA 批準低蛋白劑型 每100單位 5ng,1989,1997,

4、Allergan獲得FDA批準以 BOTOX 商品名上市；用于治療眼瞼痙攣，斜視和第VII神經(jīng)功能紊亂,Allergan 公司獲得對A型肉毒素的所用權(quán),1998年6月中國藥品監(jiān)督管理局批準保妥適用于治療眼瞼痙攣、面肌痙攣及相關(guān)病灶肌張力障礙。,2006年6月GSK在中國上市保妥適,2002,FDA批準美容適應癥,83個國家 22個適應癥,2月11日獲中國SFDA批準用于皺眉紋,7,不是個合適的生化武器,溫度、濕度，空氣和光照都會使毒素降解 霧狀的毒素，很不穩(wěn)定 常規(guī)的消毒方法既能使其滅活 氯， 加熱85C5分鐘 人與人不能傳播 存在肉毒素抗毒素 （但對已經(jīng)存在的癥狀無效）,8,高純度的保妥適治

5、療不會導致肉毒中毒,肉毒中毒: 肉毒毒素導致的一種全身性的反應 保妥適是高度純化的肉毒素 局部注射治療,直接注射在相關(guān)肌肉或腺體上 如劑量合適,很少彌散到其它肌肉 治療劑量與中毒劑量相差很遠 皺眉紋標準劑量： 20U,致死劑量 (70kg 人) 靜脈注射 3,000 單位,要導致死亡,需靜脈注射 30瓶以上保妥適,每瓶保妥適 只含100單位 純化的肉毒素,每瓶保妥適含蛋白5ng 1ng = 10-9 g,9,保妥適是局部用藥,Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088,本研究的臨床相關(guān)性有待明確,靶肌肉,鄰近 肌肉,全身

6、 作用,在治療劑量內(nèi)， 血液中檢測不到肉毒素,10,前體毒素900 KD 復合體 HA (Haemagglutinin) ,血凝素 NTNH non-toxic non-haemagglutinins 非血凝素蛋白,肉毒素結(jié)構(gòu),150 KD,100 KD,50 KD,與靶位受體結(jié)合，促輕鏈內(nèi)轉(zhuǎn),以鋅肽鏈內(nèi)切酶實施毒效,血凝素維持毒素三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 影響結(jié)構(gòu)因素： 熱變性，堿性條件 空氣/液體介面形成的氣泡改變毒素形態(tài)，氮氣/二氧化碳 稀釋至過低濃度,11,作用機理(1),12,作用機理(2),尚有其它作用機理 如疼痛,13,作用過程,主要步驟： 結(jié)合（Binding） ： A型肉毒素的重鏈與運動

7、神經(jīng)終板上的乙酰膽堿受體高親和結(jié)合 攝入（Internalization)： 毒素通過受體介導的胞飲作用進入細胞內(nèi)。這一過程中神經(jīng)末端細胞膜將毒素包裹，在神經(jīng)末梢內(nèi)形成毒素囊泡。攝入后，肉毒素的輕鏈從囊泡中被釋放到胞漿內(nèi)，現(xiàn)在已非常明確輕鏈具有阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)。 阻斷 （Blocking) A型肉毒素通過裂解膽堿能神經(jīng)末梢突觸前膜內(nèi)SNAP-25而阻滯乙酰膽堿的釋放。SNAP-25是一種在細胞膜上促使神經(jīng)末梢內(nèi)囊泡與突觸前膜順利融合并釋放乙酰膽堿的必需蛋白質(zhì)。這過程阻止肌肉收縮，但并不影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和儲存，也不影響電信號沿神經(jīng)纖維傳導。 神經(jīng)芽生 (Sprouting) 充分證據(jù)表明

8、肉毒素介導的神經(jīng)肌肉接頭的化學去神經(jīng)化作用并沒有影響終板區(qū)域，也沒有影響軸突的生長，芽神經(jīng)與終板結(jié)合連接釋放神經(jīng)遞質(zhì) 神經(jīng)再生 “芽生”是暫時的，會逐漸消退，原始的神經(jīng)肌肉接頭恢復功能。,14,乙酰膽堿的作用,顱神經(jīng),骶神經(jīng),胸腰神經(jīng),節(jié)前 神經(jīng)節(jié) 節(jié)后,CNS,副交感神經(jīng),交感神經(jīng),交感神經(jīng),交感神經(jīng),軀體運動神經(jīng),Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,N,M,交感神經(jīng),NE, ,N,N,N,N,Ach,M,D,N,Epi,Ach,膽堿能性神經(jīng)： 運動神經(jīng) 全部植物神經(jīng)節(jié)前纖維 大多數(shù)副交感神經(jīng)節(jié)后纖維 支配小汗腺和血管肌肉的交感神經(jīng)節(jié)后纖維,15,疼痛作用的發(fā)現(xiàn)-Reji

9、a 試驗,基本設(shè)計： 36個病人有疼痛性斜頸 隨機，雙盲分成4組 25U,50U,100U,及 150U 一個治療周期，每周觀察直至12周 觀察指標： 主要終點： TWSTRS ( Totonto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale) 疼痛頻率 疼痛強度 次要終點 醫(yī)生及病人 全球評定量表（Global Assessment Scale),16,Reljia 試驗結(jié)果,組1：25 U,組2：50U,組3：100 U,組4：150 U,疼痛和斜頸均無變化,斜頸無改變，但疼痛改善,疼痛改善1周后改善 斜頸2周后改善,結(jié)論： 保妥適可能有直接止痛效果

10、，獨立于其肌肉放松的效果,17,SNAP-25,Ca+ Channels,Syntaxin,VAMP/ synaptobrevin,還阻滯其它物質(zhì)的釋放,對疼痛的作用,Glutameat,cGRP,Substance P,18,軀體運動神經(jīng)元 -梭外肌-收縮減少 梭內(nèi)肌-傳入信號減弱,內(nèi)臟運動神經(jīng)元- 內(nèi)臟平滑肌收縮減少 腺體分泌減少,痛覺感受器,肉毒毒素阻滯位點,作用機理的臨床意義,19,BOTOX 臨床應用范圍日益擴大,失馳緩癥,多汗癥*,偏頭痛,痙攣性斜頸*,腦癱,眼瞼痙攣*,神經(jīng)肌肉,自主神經(jīng),感覺神經(jīng),膀胱,美容*,20,保妥適全球被批準情況,83個國家，22個適應癥,21,保妥適在

11、中國的適應癥,1998： 眼瞼痙攣、面肌痙攣及相關(guān) 局灶性肌張力障礙。,2009年2月： 暫時改善65歲及65歲以下成人因皺眉肌/或降眉間肌活動引起的中度至重度皺眉紋。,22,Perform the Iodine Starch Test,Use a surgical pen and standard ruler to mark injection points: 1 to 2 cm apart Staggered to allow for ring effect of intradermal injections,Count injection points and allocate reco

12、mmended dosage of BOTOX solution per injection, based on: 50 Units per axilla,Please see Important Safety Information on slide 12.,23,BOTOX Injection,Inject at a 45 angle to skin surface Bevel side up to minimize leakage and ensure injections remain intradermal A depth of approximately 2 mm,Be sure

13、not to inject directly on ink mark to avoida permanent tattoo effect,Please see Important Safety Information on slide 12.,24,基本藥理,單位的定義 有效性 安全性 抗原性,25,單位的定義,生物制品用單位(Unit),而不用mg衡量 肉毒素單位定義: 1 Unit (單位) = i.p. LD50 小鼠腹膜內(nèi)注射配制后的本品溶液的半數(shù)致死量(LD50) 不同廠家的肉毒素單位（Unit）彼此不能互換 有各自的實驗和檢測方法,說明書： 本品的推薦劑量不可與其他肉毒梭菌毒素制劑

14、的劑量互換。,文獻上關(guān)于保妥適的推薦劑量只適用于保妥適， 對其他A型肉毒毒素不一定適用。,26,有效性的判斷,局部有效性： 用DAS 評估 Digit Abduction Score 小鼠后趾外展評分方法 測試去神經(jīng)化程度 局部肌肉注射的 ED50 半數(shù)有效量 DAS =2 時劑量,DAS 評分方法,注射前,注射后,4分 嚴重弱化,0分 沒變化,1分,2分,3分,27,用DAS測試小鼠肌肉弱化程度,28,DAS 量效關(guān)系 （對數(shù)值）,平 均 DAS 峰 值,毒素劑量, U/kg,此圖可用來比較不同產(chǎn)品的效力,29,J. Francis Poster #51, Toxins 2005,平均DAS

15、 (小鼠后趾外展肌評分方法測試去神經(jīng)化程度)峰值效應曲線,保妥適 效力最高的肉毒素,*p 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test,*注意： 非線性關(guān)系,30,局部和全身效應：彌散系數(shù),全 身 效 應,彌散,平 均 DAS 峰 值,毒素劑量, U/kg,達到最大 局部效果,彌散系數(shù) (Diffusion Margin),=,Atr thresh,ED50,Atr thresh: 注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量,作為局部注射藥，肉毒素一般沒有口服藥所具有的全身作用 在臨床使用中，很多副反應是由于藥物不適當彌散造成的 臨近肌肉 全身,K.

16、Roger Aoki, PhD, Pharmacology of Botulinum Toxins,31,不同產(chǎn)品的彌散性不一樣,在達到最大局部 效應前就從注射 部位彌散出去了,Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088,本研究的臨床相關(guān)性有待明確,32,抗原性,抗原: 能觸發(fā)抗體產(chǎn)生的外來分子，抗原表面有非常特異性的抗體結(jié)合部位，這稱為抗原決定簇。 抗體: 抗體（也稱為免疫球蛋白Ig）是針對抗原而產(chǎn)生的。只有相對應的抗原決定簇出現(xiàn)時，抗體才被激活。 免疫應答反應具有記憶和強化功能,33,中和抗體使毒素失去作用,中和 抗

17、體,中和 抗體,非中和 抗體,非中和 抗體,34,抗原測試方法（I）,WBA （Western Blot Analysis 蛋白印跡分析） 不能區(qū)分中和抗體和非中和抗體 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay 酶聯(lián)免疫吸附試驗) 分析血標本中有無保妥適抗體及其含量的敏感的體外方法。 ELISA不能區(qū)分保妥適的中和抗體與非中和抗體,35,抗原測試方法（II）,MPA (Mouse-Protection Assay 小鼠保護試驗) 是目前測試抗體的金標準 唯一能準確測試中和抗體的方法 價格昂貴、費時, 只有陰性和陽性之分 FTAT (Frontalis A

18、ntibody Test 前額抗體試驗) 簡便,很快有結(jié)果 與其它方法相關(guān)性好,= 7.5 U,= 15 U,36,效果不佳不都是因為抗體,注射技術(shù)不正確 如劑量過低或注射在錯誤的肌肉上 對所注射的肌肉功能了解不全 沒有注射所有引起癥狀的肌肉 要達到功能效果還需控制拮抗肌 肌肉攣縮已到固定程度,37,減少抗體產(chǎn)生的危險,每次使用最低劑量 也就是降低接觸神經(jīng)毒素蛋白(ng)的可能 延長使用間隙 由產(chǎn)品的作用時間決定 使用高純度，性質(zhì)穩(wěn)定/均一的產(chǎn)品 新配方大大降低抗體的產(chǎn)生率*,Jankovic et al. (2003) Yablon et al. (2005):,38,保妥適的特點,39,目

19、前商用肉毒素,40,全球第二大醫(yī)藥公司， 占世界醫(yī)藥市場的6 2007年銷售額 $45.8 billion 114 個國家超過100,000名員工 中國投資超過4億美元，5 家企業(yè) 國內(nèi)主要處方產(chǎn)品： 肝炎，代謝類，呼吸，神經(jīng),中等規(guī)模的專業(yè)生物醫(yī)藥公司 年銷售額 $3 billion, 6,000員工 主要產(chǎn)品： 醫(yī)學美容：保妥適，填充劑，面霜 眼科產(chǎn)品,GSK這樣的大公司一定挑選這個領(lǐng)域中的最優(yōu)秀產(chǎn)品,41,純度高,質(zhì)量恒定,肉毒毒素是一種生物產(chǎn)品，其生產(chǎn)工藝遠比化學藥品復雜。很難做到批與批，瓶與瓶之間的質(zhì)量恒定。 生產(chǎn)過程中不慎被滅活的肉毒毒素無治療作用，但具有免疫原性，可激發(fā)肌體產(chǎn)生抗

20、體，令使用者產(chǎn)生繼發(fā)性無應答。,使用保妥適，醫(yī)生可精確知道所注射的劑量，無需擔心其他雜質(zhì)注入使用者體內(nèi)。,42,J. Francis Poster #51, Toxins 2005,平均DAS (小鼠后趾外展肌評分方法測試去神經(jīng)化程度)峰值效應曲線。,保妥適 效力最高的肉毒素,*p 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test,*注意： 非線性關(guān)系,肉毒素彼此不等價！100U 100U,43,得到均一900KD大分子量,900 kDa,500 kDa,Schantz 純化工藝法,均一的900KD分子量,不容易彌散到周圍肌肉,44,保妥適: 900,0

21、00 Dalton,水18 Dalton （50,000倍）,青霉素388.48 Dalton (2,317倍）,分子量比較,45,彌散系數(shù)比較,Atr thresh: 注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量 在達到相同的療效時, 保妥適比其它肉毒素更不容易彌散到遠端肌肉,J. Francis Poster #51, Toxins 2005 Presented at Toxins 2005, Denver, CO, June 22-25, 2005.,46,良好的彌散系數(shù),全 身 效 應,彌散系數(shù) (Diffusion Margin),=,Atr thresh,ED50,Atr thresh

22、: 注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量,作為局部注射藥，肉毒素一般沒有口服藥所具有的全身作用 在臨床使用中，很多副反應是由于藥物不適當彌散造成的 臨近肌肉 全身,在達到最大局部 效應前就從注射 部位彌散出去了,Atr thresh: 注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量,臨床相關(guān)性需進一步確認,47,保妥適能更好地集中在靶肌肉上,48,保妥適使用真空干燥法,真空干燥法 Vacuum Dried,液體 固體,冰凍干燥法 Lyophilized,固體 固體,保妥適,其它A型肉毒素,凍干易形成類毒素 無活性，但有免疫原性 需要明膠作為穩(wěn)定劑來降低凍干損失量,49,明膠是強致敏劑,明膠可對凍

23、干中的蛋白質(zhì)起保護作用 可能會引起瘋牛病 是強過敏源，國際上已不推薦為敷料,國內(nèi)的臨床實驗也顯示， CBTX-A 組 5 例出現(xiàn)皮疹； BOTOX組無一例發(fā)生。,Blair et al. J Clin Neurosci 2004;22(Suppl 1):S103-4 ABS-POS3R NOT porcine 湯曉芙萬新華A 型肉毒毒素治療局限性肌張力障礙和肌肉痙攣中華神經(jīng)科雜志1999年6月第32卷第3期,含有明膠的肉毒素是強致敏劑 反復暴露會增加皮膚過敏率,圖示為動物實驗中的結(jié)果,50,保妥適始終是市場的領(lǐng)導者,Source: AGN Global Mkt Research,2007 WW

24、 BoNT Market Sales $1.4 B,51,我們更關(guān)心產(chǎn)品銷售出去后的問題,持續(xù)性地在全球收集安全性數(shù)據(jù),52,不良反應維持在較低水平,53,大量的文獻支持保妥適有效性和安全性,近4,000份資料 寬度：100多個用法 時間： Mejia N et al平均15.8年,Mejia N et al. Long-term botulinum toxin efficacy, safety and immunogenicity. Mov Disord 2005; 20(5):592597.,54,我們力求提供給醫(yī)生最有價值的服務(wù),55,我們力求提供給醫(yī)生最有價值的服務(wù),注射軟件,注射記錄

25、表,56,外科記號筆,57,保妥適配制方法,58,包裝和防偽,包裝規(guī)格：1支/盒 容器：帶橡膠塞并用鋁箔密封的10ml容量的I型無色玻璃瓶。 小瓶的標簽上印有“Allergan”字樣的全息膠皮,上有平行的彩虹條文 為了能看到全息圖片,需要在臺燈或熒光燈下前后旋轉(zhuǎn)小瓶 在生長日期/批號地方?jīng)]有全息圖片,59,配制步驟: 1,最好在塑料布上進行配制，以防止液體的外濺。 選用21Gauge（ 0.813mm）, 約1.5英寸（3.8cm）長的針頭抽取適量(參見稀釋表)的 不含防腐劑的生理鹽水 (0.9% 氯化鈉液),60,以45的角度將針插入保妥適瓶內(nèi)，瓶內(nèi)真空會將生理鹽水自動吸入,為避免產(chǎn)生過多泡

26、沫,請稍用力持住筒芯,使生理鹽水緩慢進入。這一過程能檢驗瓶內(nèi)是否真空，若為非真空則棄用。,配制步驟: 2,61,將注射筒從針頭上拔下，讓空氣通過針頭進入瓶內(nèi)，中和負壓。輕輕地旋轉(zhuǎn)小瓶，使保妥適在生理鹽水中溶解，不要翻轉(zhuǎn)震動瓶子。,配制步驟: 3,62,用另一新的無菌注射筒接上針頭，從瓶底一角抽出稀釋液，勿將小瓶翻轉(zhuǎn)。,配制步驟: 4,63,將用于配制的21Gauge( 0.813mm）針頭拔下，換上與所注射適應癥相應的針頭：眼瞼痙攣、面肌痙攣使用30Gauge（ 0.305mm）針頭；如需肌電圖引導定位，使用涂有特氟隆的針頭.,配制步驟: 5,64,稀釋表,配制好的溶液應是無色至淡黃色的液體，不含任何顆粒 使用配制溶液之前應肉眼檢查澄明度及有無雜質(zhì)，本品只能單次使用，剩余溶液應丟棄。,65,附件針頭度量,ISO 9626: Stainless steel needle tubing for the manufacture of medical devices, Amendment 1. Geneva: